动物固体组织蛋白提取
1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较
快。
2、 裂解液配制：：100：1，现配现用。（100010）。置入4℃冰上。
3、抽蛋白（应冰上进行）： a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10管体系中加入：7-8粒磁珠、100组织、110、1 。 b 、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入1.5的管中（ 管、离心管）。12000 4°C 离心15。 d 、离心后管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。
a 、配工作液：溶液A ：溶液50：1（200：4）。
需测试复孔。标本X ，则需A 量=2*（
1+1）
）*4。
c 、复孔，取蛋白6加入0.6管，再加入542O ，混匀。即10倍稀释。
d 、取20-25 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200工作液，混匀振荡后，37℃ 30。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换，再加入工作液即起反应，应缩短时间。
e 、酶标仪检测562吸光度。
f 、计算蛋白浓度。
根据标准曲线，如 1.27450.1684 其中Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y （、） g 、蛋白样本放-80℃冻存。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。
法（法）：
原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。
法：
原理：在碱性条件下，蛋白将还原为，与试剂形成紫色络合物，测定其在562处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
现对这两种方法进行比较：
一、实验材料：
细胞总蛋白提取试剂盒（0103）
M231
蛋白定量试剂盒（0146）
改良增强型蛋白质定量试剂盒（0145）
二、操作步骤：
法：
1.将冻干标准品（10支）用生理盐水或稀释成2000，1000 ,500 ,250 ,125 ,6
2.5 ,31.25 ,15.625 八个浓度的蛋白标准溶液。
2231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
3.各取20蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。
4.滴加200考马斯增强型试剂（溶液A）至每孔混匀并充分震荡30S
5.停止震荡，在室温孵育样品10
6.在酶标仪中测量595时的吸光值。
7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。
法：
1.按50体积试剂A加入1倍体积试剂B配置适量工作液，充分混匀。
2.将冻干标准品（10支）用生理盐水或稀释成2000，1000 ,500 ,250 ,125 ,62.5 ,31.25 ,15.625 八个浓度的蛋白标准溶液。
3231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
4.各取20蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。
5.滴加200工作液至每孔混匀并充分震荡30S
6.停止震荡，在37度孵育样品30
7.在酶标仪中测量562时的吸光值。
8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。
三、实验结果
其中1到8为2000，1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 的标准浓度的蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释M231总蛋白，样品2为32倍稀释M231总蛋白
法：
为了测试准确，应在试剂加入后的5～20内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4
法优点是：
1.灵敏度高，据估计比法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比法要大的多。
2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
3.干扰物质少。如干扰法的、、2+离子、缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、100、十二烷基硫酸钠（）和0.1M的。（如同0.1M的酸干扰法一样）。
3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000浓度范围内有较好线性。因而不能用定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
法：
由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28
法特点：1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μ，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的，5%的100，5%的20，60，80。3. 在20-2000μ浓度范围内有良好的线性关系。4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：小于10。小于1巯基乙醇低于1
法和法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。
（）裂解液( )是一种传统的细胞组织快速裂解液。裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的、等。
使用方法
对于培养细胞样品：
1. 融解裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入，使的最终浓度为1。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。
对于组织样品：
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入，使的最终浓度为1。
3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的、和免疫沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。注：裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组
等的复合物。在不检测和基因组结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如κB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全
摘要：
破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。
蛋白酶抑制剂
破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。
常用抑制剂
（剧毒）
1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);
2)10溶于异丙醇中;
3)在室温下可保存一年; 2-8℃可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在-20℃
4)工作浓度:17~174(0.1~1.0);储存液浓度为100或200
5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的。
1)抑制金属蛋白水解酶;
2)0.5水溶液，8~9;
3)溶液在4℃稳定六个月以上;
4)工作浓度:0.5~1.5. (0.2~0.5);
5)加入调节溶液的值，否则不溶解。
胃蛋白酶抑制剂()
l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶;
2)1溶于甲醇中;
3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月;
4)1作浓度:0.7(1)
5)在水中不溶解。
亮抑蛋白酶肽()
1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B;
2)溶于水;
3)储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月;
4)工作浓度0.5。
胰蛋白酶抑制剂()
1)抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;
2)溶于水，7~8
3}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月;
4)工作浓度:0.06~2.0(0.01~0.3);
5)避免反复冻融:
6)在>12.8时失活。
蛋白酶抑制剂混合使用
35 …………………………………丝氨酸蛋白酶抑制剂
0.3 …………………………………金属蛋白酶抑制剂
0.7胃蛋白酶抑制剂()…………酸性蛋白酶抑制剂
0.5亮抑蛋白肽酶()……………广谱蛋白酶抑制剂
( )是很常见的抑制剂，使用浓度为1 。不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
丝氨酸抑制剂，使用浓度为4 。的抑制活性与相近，但它更易溶于水而且毒性低。因此是最佳的替代品，但价格较高。
磷酸酶抑制剂
氟化钠
溶解性：溶于水
分子量：41.99
使用：贮存液5M，工作浓度10~20。
34 原矾酸钠
分子量：183.91
溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠。原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠，激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用。
原因：原钒酸钠有一定程度的聚合，使用前要激活使之变成单体才有最大抑制效价
原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是：100 原矾酸钠激活储存液配制
(1). 取0.183克的原矾酸钠溶解于10的双蒸水中，加酸调节至10(颜色变黄)。
(2). 煮至无色
(3). 室温冷却
(4). 重调至10
(5). 重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色，并且稳定于10，分装100管，每10裂解液加一管。
使用：贮存液100，工作浓度1，-20度保存。
甘油磷酸钠
溶解性：溶于水
分子量：306.11
使用：贮存液100，工作浓度25。
2P2O4 焦磷酸钠
溶解性：溶于水
分子量：265.9
使用：贮存液100，工作浓度1-2 。
1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
1分离组织膜蛋白的方法： 1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 2 取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。 4．将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris –HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。 5．在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。 6．按实验要求，将匀浆分装于1毫升的Eppendoff 管中，其于-80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在40000g时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具体的protocol可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则需要用无水甲醇在-20度处理10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合。
蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min
酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）
各种动物蛋白原料的加工方法 1、鱼粉的加工海杂鱼、淡水鱼及海产品加工下脚料等，均可作为鱼粉加工的原料，先将原料通过晒干、烘干或水煮后晒干等程序，然后加工成粉状即成，水煮法经高温处理，质量一般较好。 2、肉骨粉的加工主要原料是肉食品加工下脚料，以及不合乎卫生要求的动物屠体组织，将原料加水蒸煮，一般脏器煮1小时，头、蹄组织煮2-3小时。煮后去掉汤表面的油脂，经烘干粉碎即成。加工较好肉骨粉呈淡红色，水分不超过6%，粗蛋白质含量达40%以上。 3、血粉的加工主要以屠宰动物血液为原料，将血液放入锅内加热，直到血液凝固和水分蒸发后，晾在水泥地板上直至干燥，然后加工成粉状即成，值得注意的是：血液加热时要不断搅拌，加入0.5%-1.5%的生石灰，煮后将血块装入麻袋内挤压沥水，使水分沥掉50%以上，再晾晒，并每隔1-2小时翻动1次，直至晒干为止。加工血粉蛋白质含量可达70%-80%，水分不超过10%，土法加工的血粉应立即饲喂。 4、羽毛粉的加工原料为禽类羽毛。将羽毛用水冲洗干净、晒干，然后在耐酸的锅中按1:6的比例先放入羽毛，再放入0.2%的稀盐酸液，加盖煮沸到用手轻轻拉断时捞出，沥去酸液，然后在阳光下晒干，用粉碎机加工成粉即可。加工好的羽毛粉蛋白质含量在70%左右。 5、骨粉的加工以动物骨头为原料，将动物骨头放入普通锅中连续煮沸7-8小时，待骨头上的脂肪煮出后，在阳光下晒干，然后加工成粉状即成，也可将骨头堆在金属架上进行焙烧，粉碎后即成骨粉，骨粉是补充钙磷元素的好饲料。 6、蛋壳粉的加工以新鲜洁净蛋壳为原料，将蛋壳洗净放入锅内煮沸，
捞出后再放入60℃的铁锅内焙炒，炒脆后取出粉碎即成蛋壳粉，蛋壳粉是补充钙的好饲料。 7、蚕蛹的加工蚕蛹是缫丝工艺的副产品。将蚕蛹放入锅内，反复煮沸数次，去掉油脂，捞出后晒干、粉碎成末即成蚕蛹粉，蚕蛹粉含粗蛋白质为45%左右，适宜饲喂猪及家禽。
植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min
Instruction Manual ProBond TM Purification System For purification of polyhistidine-containing recombinant proteins Catalog nos. K850-01, K851-01, K852-01, K853-01, K854-01, R801-01, R801-15 Version K 2 September2004 25-0006
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Table of Contents Kit Contents and Storage (iv) Accessory Products (vi) Introduction (1) Overview (1) Methods (2) Preparing Cell Lysates (2) Purification Procedure—Native Conditions (7) Purification Procedure—Denaturing Conditions (11) Purification Procedure—Hybrid Conditions (13) Troubleshooting (15) Appendix (17) Additional Protocols (17) Recipes (18) Frequently Asked Questions (21) References (22) Technical Service (23) iii
Kit Contents and Storage Types of Products This manual is supplied with the following products: Product Catalog No. ProBond? Purification System K850-01 ProBond? Purification System with Antibody with Anti-Xpress? Antibody K851-01 with Anti-myc-HRP Antibody K852-01 with Anti-His(C-term)-HRP Antibody K853-01 with Anti-V5-HRP Antibody K854-01 ProBond? Nickel-Chelating Resin (50 ml) R801-01 ProBond? Nickel Chelating Resin (150 ml) R801-15 ProBond?Purification System Components The ProBond? Purification System includes enough resin, reagents, and columns for six purifications. The components are listed below. See next page for resin specifications. Component Composition Quantity ProBond? Resin 50% slurry in 20% ethanol 12 ml 5X Native Purification Buffer 250 mM NaH2 PO4, pH 8.0 2.5 M NaCl 1 × 125 ml bottle Guanidinium Lysis Buffer 6 M Guanidine HCl 20 mM sodium phosphate, pH 7.8 500 mM NaCl 1 × 60 ml bottle Denaturing Binding Buffer 8 M Urea 20 mM sodium phosphate, pH 7.8 500 mM NaCl 2 × 125 ml bottles Denaturing Wash Buffer 8 M Urea 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 500 mM NaCl 2 × 125 ml bottles Denaturing Elution Buffer 8 M Urea 20 mM NaH2PO4, pH 4.0 500 mM NaCl 1 × 60 ml bottle 3 M Imidazole, 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 500 mM NaCl 1 × 8 ml bottle Purification Columns 10 ml columns 6 Continued on next page iv
东北农业大学网络教育学院 动物组织胚胎学作业题 作业题（一） 一、名词解释 1.组织学：是研究动物体微细结构及其与功能关系的科学。研究容包括细胞、组织和器官组织三个部分。 2.胚胎学：是研究动物个体胚胎发育的科学。 3.皮：衬在心、血管和淋巴管面的上皮叫皮。皮薄而光滑，有利于血液和淋巴的流动以及皮细胞外的物质交换。 4.肌节：肌原纤维之相邻两Z线之间的部分，称为一个肌节，是肌肉收缩的基本结构和机能单位。 5.胎盘：是胎儿与母体进行物质交换的结构，它由胎盘的胎儿部分和母体部分所组成。 6.神经元：神经细胞是一种高度分化的细胞，具有很长的突起，能够感受刺激和传导神经冲动，是神经组织结构和机能的基本单位，因此又叫神经元。 7.骨单位：是位于、外环骨板之间的一些平行于骨干长轴排列的圆柱体。它们由许多呈同心圆排列的筒状骨板和中央的哈氏管所组成。 8. 胰岛：是胰腺中的分泌细胞团，散在分布于胰腺外分泌部的腺泡之间。胰岛主要有A、B、D、PP四种细胞，它们都具有蛋白质分泌细胞的超微结构特点；分别分泌高血糖素、胰岛素、生长抑素、分泌胰多肽。 9.尘细胞：肺巨噬细胞：数量较多，广泛分布于肺间质，也可进入肺泡腔。来源于单核细胞，有活跃的吞噬、免疫和分泌功能，起重要的防御作用。当吞噬进入肺的尘粒后，称为尘细胞。 10.肾单位：肾单位是尿生成和排泄的基本单位，由肾小体和肾小管两部分构成。 二、判断下列句子正确与否并用“√”或“×”标明 1～5√××××；6～10××××√ 三、单项选择 1～5DCDDB ；6～10DCBCA 四、填空题 1.细胞膜、细胞质、细胞核。2髓鞘、神经膜（施万）细胞。3骨骼肌、心肌、平滑肌。 4表皮、真皮和皮下组织。5过滤淋巴、参与免疫应答、产生淋巴细胞。6 鼻、咽、喉、气管、支气管、肺。 五、简答题 1. 外分泌腺的腺细胞有几种分泌方式，举例子说明。 1)透出分泌：分泌物以分子的方式透出细胞膜，例如胃壁细胞盐酸的分泌。 2）局部分泌也叫胞吐分泌。所形成的带包膜的分泌颗粒逐渐移到细胞的游离面并与质膜融合，将容物胞吐出去，细胞膜本身不受损伤。唾液腺和胰腺外分泌部都是此种分泌方式。 3）顶浆分泌胞质中形成的分泌物移到游离面质膜下后，顶着质膜向外突出，最后自突出部位与细胞折离，损伤的质膜很快修复。乳腺和汗腺细胞都为顶浆分泌。 4）全浆分泌当胞质充满分泌物后，细胞发生死亡性变化，最后整个细胞解体，连同分泌物一起排除，由邻近的腺细胞补充。皮脂腺细胞属于全浆分泌型。 2. 哺乳动物血液的组成。
动物组织各种固定液及优缺点 编 号 类别名字配方优缺点或备注 甲醛：从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1. 组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2. 固定均匀,穿透力强.3. 能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂类物质.5. 成本较低. 缺点:1. 杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.2. 含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3. 可产生福尔马林色素,影响观察.4. 不能固定尿酸和糖类物质.5. 容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6. 可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,临床活检不用.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。 1 10%缓冲福尔马林固 定液甲醛100ml 蒸馏水900ml NaH2PO44g Na2HPO4 6.5g 该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固 定较好,损伤较少,因对其后的各方面研究都较 好,尤其是对免疫组化的染色. 2 10%福尔马林固定液甲醛100 ml 自来水900ml 这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。 3 10%福尔马林盐固定 液甲醛100ml 自来水900ml Nacl 9克 先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种 较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是 一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染 色，增加染色的强度 4 Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 2 ml 冰醋酸 5 ml 该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平 5 醛糖钙固定液甲醛100ml 蔗糖300ml 乙酸钙20g 蒸镏水90ml 先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。 酒精：优点：1、可保存尿酸结晶和糖原等物质。2、能在任何比例的情况下与水混合，如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。 3、可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，因此称它为桥梁试剂。 4、能除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。5，可与其它试剂配成多种的混合固定液，加快固定，它的缺点是：1、可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片。2、对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。3、渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。 5、可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
①用液氮研磨的方法更佳，具体方法可以联系本公司****@***.c*m索取详细资料。 beibokit https://www.doczj.com/doc/e711379660.html, - 2 - 产品说明书 相关产品： 产品 总蛋白提取试剂盒核蛋白提取试剂盒 膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒Bradford蛋白定量试剂盒ECL化学发光检测试剂盒细胞蛋白提取试剂盒组织蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒昆虫蛋白提取试剂盒磷酸化蛋白提取试剂盒SDS-PAGE凝胶配制试剂盒总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）植物蛋白提取盒（2D电泳用）细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3126 BB-3105 BB-3702 BB-3181 BB-3183 BB-3187 产品 磷酸化蛋白富集试剂盒膜蛋白提取试剂盒活性蛋白提取试剂盒BCA蛋白定量试剂盒植物核蛋白提取试剂盒细菌膜蛋白提取试剂盒植物总蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒
蛋白酶抑制剂混合物真菌蛋白提取试剂盒磷酸酶抑制剂混合物SDS-PAGE上样Buffer 细菌蛋白提取盒（2D电泳用）酵母蛋白提取盒（2D电泳用）线粒体蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3703 BB-3182 BB-3185 BB-3191 beibokit https://www.doczj.com/doc/e711379660.html, - 3 -
Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如
WT LOST 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。 b 、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎， 也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min 。 d 、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。4、蛋白浓度测定。 a 、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul ：4ul ）。 需测试复孔。标本 X ，则需 A 量=2* ；B=2*（X+1+1）*4。 c 、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O ，混匀。即 10 倍稀释。 d 、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后，37℃ incubat e 30min 。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e 、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f 、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y （ug/ul 、mg/ml ） g 、蛋白样本放-80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）