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大肠杆菌菌种活化步骤
篇一：抑菌实验步骤
抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌
菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布，
划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸
取进行划线！
涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂
布法
1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h)
2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养）
3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h）
培养基
MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋
白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5g
MH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸
溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。
菌悬液的配制
将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养
箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于
5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10-
10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品
溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度，
使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。
抑菌作用初步筛选
将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培
养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液，
均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对
照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作
台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。
抑菌率=对照菌落数-处理菌落数?100% 对照菌落数
实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。
菌种活化：37℃培养；约24H
挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养
8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。
生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min
即可。
篇二：大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌感受态制备及电转化流程
1. 细菌电转化感受态细胞的制备
准备：50mL离心管3个 10%甘油≥200mL
灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个
1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。晚上将新鲜的菌落接
种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转
速控制在200rpm；
2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培
养基的 250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；
3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管，然后至于冰水混合物
中骤冷，一定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min（需要的话这种方式可以
存放培养液数小时）
3）将离心管于4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；
4）用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，
然后把水加满，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；
5）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100μL/支（一般，25mL起始培养
物最终用200-250μL l0%甘油悬浮）；
6）放入-80℃冰箱中速冻。或者立即用于电转化。
注意：
1）菌种最好是-80℃冻存的，活化后生长状态较好。
2） 20ml培养过夜，振荡速度不要过高（一般应该是37℃，300rpm，6h，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在200rpm，可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）
3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇
动瓶子，大约15min。
4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，
再加入NaOH固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测
5）培养完毕后的离心操作一定要低温，所用的水和甘油，离心管都要冰上预冷。 6）整个过程尽量不要用枪吹打。
7）器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配置。
8）控制好菌体的OD600值，收菌以半对数期合适，一般OD为0.5~0.6最佳，过则不佳。
9）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩
200μL左右。切勿用过多甘油也悬浮细胞，我曾用350-500μL10%的甘油/25mL 出发菌液，导致细
胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级。
2 电转化
准备：冰盒、1.5mL离心管、电击杯、37℃的LB培养基
附件： 新菌株（乳酸菌）斜面培养法 1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉） 2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。 3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）： 3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时 3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。 3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。 3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。 3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。 4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟 5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀 6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时 后，得到二代菌。 7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。 注意事项： 1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。 3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。 第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。第三代为工作用菌。 乳酸菌菌种保存法 方法一：斜面保存法（略） 方法二：20%甘油保存法 器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅 操作步骤： 1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行 36.5℃恒温培养48小时 2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒 3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min） 4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧 紧盖子，摇匀，标识。 5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记 6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。 7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。 实验室菌种激活方法
菌种活化-操作方法-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环 （2）平板划线法
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml 无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L 型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。
本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == 大肠杆菌菌种活化步骤 篇一：抑菌实验步骤 抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌 菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布， 划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸 取进行划线！ 涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂 布法 1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h) 2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养） 3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h） 培养基 MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋 白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5g MH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸 溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。 牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。 菌悬液的配制
将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养 箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于 5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10- 10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品 溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度， 使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。 抑菌作用初步筛选 将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培 养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液， 均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对 照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作 台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。 抑菌率=对照菌落数-处理菌落数?100% 对照菌落数 实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。 菌种活化：37℃培养；约24H 挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养 8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。 生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min 即可。 篇二：大肠杆菌电击转化流程 大肠杆菌感受态制备及电转化流程 1. 细菌电转化感受态细胞的制备 准备：50mL离心管3个 10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个 1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。晚上将新鲜的菌落接 种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转 速控制在200rpm； 2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培 养基的 250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；
低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。
A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环 （2）平板划线法
冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。
真空冷冻干燥法保藏菌种操作步骤 操作过程 1、安瓿管准备 选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121℃下高压灭菌20分钟，备用。 2保护剂的选择和准备 选取新鲜牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂， 115℃下高压蒸汽灭菌25min，备用。 3冻干样品的准备 (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到108～1010个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，每管分装量约～毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 4预冻 -80℃冰箱预冻1～2小时。 5冷冻干燥 将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断：①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值；③选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。
6真空封口 将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。 7保藏 安瓿管保藏在-20℃冰箱里。 8活化 如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端，使管子破裂，在安瓿管中加入～1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管，是冻干菌种复水，然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。
种植专用EM菌种使用方法 一、产品特点 本品由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、光合菌、乳酸菌、酵母酸、和放线菌等10属80多种微生物复合培养而成的有益微生物菌群。 1、外观：灰白色粉末，略带腥臭味。 2、主要成分：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、光合菌、乳酸菌、酵母酸、放线菌和少量培养基干物质，总菌数≥200亿/克。 二、EM原液的制作方法本品10克可以制作10-20公斤EM原液 【制作方法】制作ＥＭ菌种发酵液——EM原液 A、菌种活化：取ＥＭ菌种10克、红糖0.1公斤（红糖先用热开水溶化），加入1公斤无菌的水中。注：（先把水加热到100°C后加入红塘，而后继续加热5分钟。冷却到40°C时加入ＥＭ种），密闭发酵( 35°C—37°C温度 )3-5天（第二天开始每天松动容器封口减压放气一次），打开容器口闻到有酸甜味即活化成功。可以作为液体菌种使用。 B、制作原液：将活化好的液体菌种加入二级发酵罐( 密闭 )( 加水比例按1:10-20的比例加入）。 二级发酵液配方：10% 的红糖、0.3% 微量元素、0.1% 氨基酸（尿素也可以），温度35-37度，发酵5-7天（第二天开始每天松动容器封口减压放气一次），打开容器口闻到有酸甜味即活化成功。可以作为原液使用。 成品发酵液标准:（气味：酸甜，PH值：4.0-5.0，活菌含量：大于100亿/ml ） 【作用功效】 1、EM菌种原液能分解木质素、粗纤维等大分子有机物，使其转化为利于动、植物吸收利用的小分子物质。 2、EM菌种原液在发酵代谢过程中形成优势菌群和产生的多种抗生性物质，能有效抑制有机物中病原菌的滋生。 3、EM菌种原液能分泌与合成有机酸、多种酶、生理活性物质，提高肥效。 4、EM菌种原液可以鳌合有机肥料中的重金属，降解其中的有毒有害物质，防止对土壤和作物的危害。 【用法用量】 １、发酵农家肥或有机垃圾：每公斤本品可发酵农家肥（有机垃圾）500-1000公斤（生料、粗料用量大些）。具体操作方法：取1公斤本品，加入100公斤左右水制成稀释液（具体的用水量，要根据农家肥或有机垃圾自身的含水量而定），而后与有机基料均匀混合，含水量控制在40%左右（手握可见指缝有水渗出，但不下滴），压实后用塑料膜覆盖严，如发酵料多（数吨）时，当堆心温度高于65℃时，进行翻堆。共翻堆2-3次，夏季发酵20天，冬季发酵30天，即可充分发酵成
菌种保存与活化 （一）培养基保存法 利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。 1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。经35℃培养18～24h后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月， 每月传代一次。 2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐 延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。 3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。 4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。 5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以 无菌方法加入灭菌的液体石蜡。高度约lcm，置4℃冰箱保存。保存时间可达3～6个月。 （二）干燥保存法 原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。 （三）冷冻干燥保存法 本法又称冷冻真空干燥法。它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年， 有的可长达10年以上。 菌种保管要求 2009-11-16 15:32【大中小】【我要纠错】 1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。液体培养基不适于保存菌 种。 2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初 次分离的流感嗜血杆菌需保存于37℃孵箱中。 3.保存菌种应做鉴定记录。在主要培养基上生长情况、菌落特征、形态及革兰染色或特殊染色反应、 生化反应、血清学性状以及个别菌种需要的动物试验结果等。
菌种活化与传代 一、菌种活化 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。 2、先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用75%乙醇擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。（有些商品化的产品打开更方便） 3、取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许（无菌水也可），加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 ( a ) 适用细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基或无菌水，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 4、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 二、菌种传代 1、培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上写上菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 2、点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通
EM菌种的活化与扩培技术 日期：2011-4-28 8:55:36 点击次数 788 发布单位：中国养殖信息网录入：李清 EM菌种固体原种10克可以制作10-20公斤EM原液 EM菌种固体原种由双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌等单一菌种单独发酵提纯真空干燥后再复合而成，每克含有益总菌数≥200亿 CFU。 【产品名称】EM菌种 【主要成分】双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌 【产品性状】本品为黄褐色粉末 【制作方法】制作ＥＭ菌种发酵液——EM原液 A、菌种活化：取ＥＭ菌种10克、红糖0.1公斤（红糖先用热开水溶化），加入1公斤无菌的水中。注：（先把水加热到100°C后加入红塘，而后继续加热5分钟。冷却到37°C时加入ＥＭ菌种），密闭发酵( 35°C—37°C温度 )3-5天，从第二天开始可以隔一天松动容器口放气减压一次，打开容器口时闻到有酸甜味即活化成功。可以作为液体菌种使用。 B、制作原液：将活化好的一公斤液体菌种加入二级发酵罐( 密闭容器 )( 加水比例按1：10-20的比例加入 ) ，二级发酵时培养基的配方：（10%的红糖--必须添加、0.3%的尿素0.1%微量元素--可以不添加、0.1%的复合维生素--可以不添加、0.1%氨基酸--可以不添加！发酵温度35-37度！发酵时间5-7天！），从第二天开始可以隔一天松动容器口放气减压一次，打开容器口时闻到有酸甜味即发酵扩培成功。成品发酵液标准:（气味：酸甜， PH值：3.0-4.0，活菌含量：大于100亿/ml ） 【注意事项】容器：不锈钢发酵罐（温控、压力控制、搅拌）、塑料桶、塑料壶、塑料瓶，禁止使用玻璃容器（防止爆炸）。 华微EM-200(高效有益菌群核心配方技术)
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a )适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b )适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期( lag period )较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture)后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。双歧杆菌的活化 请问各位双歧杆菌的冻干粉怎么活化？
活化培养基是什么？ 活化时间？ 活化时需要特别注意什么？ 谢谢！ -------------------------------------------------------------------------------- 脱脂乳7份+豆奶3份混均，加2%的酵母浸出液，2%的酪蛋白胨，0.1%的抗坏血酸，葡萄糖2%，混溶分装试管，利用间歇灭菌法(同上)灭菌，冷却，低温保存，备用。双歧杆菌为厌氧菌，需进行厌氧培养。 在无氧条件下，打开干燥菌种菌管，用接菌环取冻干菌种于双歧杆菌活化培养基内，38℃恒温厌氧培养24ｈ，取深层活化菌种传入下一代培养基中深层培养，反复活化传至第5代，每代均为38℃及24ｈ。 -------------------------------------------------------------------------------- 一般传两代以后，才能正常使用！ 常用活化培养基液体培养基有PYG固体有TPY 活化方法，ATCC推荐：1、冻干粉菌开封以后，用生理盐水，溶解！接种于液体培养基上！培养为正常生长时间的二倍，36±1℃2、然后将其离心集菌，接种于平板上，养为正常生长时间的二倍，36±1℃自我感觉，液体培养基活化不好用！我的活化方法：冻干粉菌开封以后，用小牛血清溶解！接种于TPY固体培养基上！培养为72H，36±1℃，然后挑菌，接种于平板上，培养为72H，36±1℃即可
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临 时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃~ －80℃之低温条件下。 2. 准备37℃之70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将cryotube 从低温保存条件中取出，置于37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之cryotube 吸取50 l（或1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约10 公分，等待约10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复2. 的动作完成III 区与IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。
菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次； 3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面； 4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养； 5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养 6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 总结一下菌种活化需要以下几个步骤： 第一配置菌种适宜生长的培养基 第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻 第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮 第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落 经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的