沙地葡萄茎痘相关病毒PCR检测及外壳蛋白基因变异分析
沙地葡萄茎痘病(Grapevine rupestris stem pitting, GRSP)是嫁接传染性病害,为皱木复合病(Rugose wood complex disease)中最为普遍的一种,在栽培品种中一般潜伏侵染。以沙地葡萄圣乔治(Vitis rupestris cv. St. George)为砧木时,嫁接口以下剥去树皮可见木质部有星状穴和条状槽沟,会造成嫁接口部位逐渐坏死,植株长势衰弱,树体矮小等。
沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus, GRSPaV)与GRSP有关,该病毒隶属凹陷病毒属(Foveavirus),基因组大小为8.4～9.3kbp,为正义单链RNA病毒,编码五个开放阅读框(Open reading frame.ORF),含一个Poly(A); ORF1编码病毒复制酶蛋白(RP), ORF2～ORF4组成一个三基因框(Triple-gene block,TGB),编码TGBpl-p3, ORF5编码外壳蛋白(CP)。多样性分析表明,GRSPaV的序列多变,目前存在10个不同的序列变异体。
为调查我国沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)侵染状况以及不同分离株外壳蛋白(coat protein, CP)基因变异情况,并为今后该病毒的致病性、病害的防控及抗病毒转基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的葡萄样品中的GRSPaV进行RT-PCI检测,选择部分样品进行了印基因的克隆与测序分析,并对三种不同RNA提取方法进行了比较,主要取得了以下研究结果：1、比较研究了CTAB法、SDS法以及SiO2吸附法的提取效果,结果显示,SDS法提取的RNA条带不清晰,有拖尾现象,此外,在核酸溶解的过程中,该方法得到的RNA黏性大,杂质较多,呈褐色；CTAB法提取的RNA在电泳图上无任何条带；SiO2吸附法提取的RNA,28S和18S条带完整且清晰,溶于水后无杂质,表明所提RNA质量较好,可用于后续研究。2、对我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品
进行RT-PCR的检测结果显示,除新疆的样品外,其余15个地区的葡萄中均检测到GRSPaV。
有114株样品带毒,平均带毒株率为37.4%。对检测结果进行分析发现,不同地区的葡萄品种带毒情况不同,品种带毒率最高的为88.9%,最低的为20.0%；不同地区的葡萄植株带毒情况也存在差别,葡萄植株带毒率最高的为75.0%,最低的为6.7%。
3、通过对不同时期、不同部位的葡萄样品中的GRSPa(?)进行检测,结果显示,五月份采取的样品中,只在叶柄处检测到病毒；在八月份的样品中,分别在卷须、叶柄以及果实中检测到病毒。综合重复试验得出以下结论：对于GRSPaV的检测,春季的最佳部位为叶柄,而秋季可采用卷须、叶柄或果实,其中,果实的检测结果最好。
4、本研究共克隆了来自10个省市的27个葡萄品种41个样品,与来自六个国家的12个分离物的CP序列进行序列比对分析,其核苷酸序列同源性为
80.4%～99.7%,氨基酸序列同源性为81.9%～100%。所有的分离物在系统发育树上聚为三个大组(组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ)。
各个分离物间的遗传距离无明显的地域以及品种差异,此外,以氨基酸序列和核苷酸序列构建的系统发育树基本一致。部分分离物内各个克隆间的同源性差异较大,表明植株存在不同序列变异体的复合侵染。
此外,同一分离物内部不同克隆的SSCP以及RFLP研究,两者的分型结果基本一致。
浅析乙肝病毒基因突变检测及治疗(一) 一、概况 由于我国人民生活水平低和卫生资源溃乏，造成乙肝泛滥。据统计：我国有乙肝病毒携带者约1.5亿、慢性迁延性肝炎约2500万、慢性活动性肝炎约1000万、重症肝炎约150万、肝硬化约100万和肝癌16～30万。肝硬化和肝癌80%以上是由乙肝病毒引起，而且80%左右来源于家族性垂直传播、与病人接触而感染机率很少。乙肝传染病已被国家疾病预防控制中心列为重点监控的疾病之一。 乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝病毒科，基因结构复杂，根据HBV-DNA核苷酸序列异质性≧8%为一种基因型的规定，HBV目前分为A～H8个基因型，其中A、B、C、F4个基因型存在不同的亚型，且分布呈区域性。由于其在复制过程中HBV-DNA聚合酶缺乏校正功能，导致易于变异，有报导HBV的基因型与基因型变异可能与HBV相关性肝癌的发生发展有关。HBV 变异给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来了新问题，不同基因型的基因变异、临床表现及对抗病毒、肝移植等的治疗反应存在差异。 二、变异及区域 HBV受自然压力、个体免疫力和药物治疗作用出现变异。HBV有四个开放阅读框架（ORE）即S、C、P、X区。 1、C区变异：用基因芯片检测HBV前C区和C基因启动子（BCP）区4位点突变，发现前C 区A1896、前C区A1814、BCP区nt176 2、BCP区nt1764突变检出率分别是58.57%、12.86%、54.29%、52.86%。突变的发生依次是慢重肝、慢乙肝重度、中度、轻度，血清病毒标志是HBeAg(-)HBeAb(+)、HBV-DNA定量在104-106copy/ml之间的突变发生率最高。可以解释小三阳DNA阳性之原因：HBeAg前C区A1896位的G变异成A，密码子UGG变为终止UAG，使HBeAg不能合成，但不影响病毒复制。 2、S区变异：前S1有识别功能，前S2是介导受体进入功能。前S区的变异可能是病毒逃避宿主免疫的一种方法，前S区的变异决定不同的HBV亚型。124、131位变异或122-124间插入变异可改变S抗原决定簇的构型，致HBsAg假阴性。145、141、126、133位氨基酸的改变，用常规试剂仍可检出HBsAg，但可能削弱HBsAg的无免疫性，使高效价的乙肝免疫球蛋白或接种诱生的HBsAb难与变异株的HBsAg结合，缺乏中和特性，使HBsAg与HBsAb 同时阳性。在HBV-DNA阳性时，无论是乙肝病毒基因变异株或野毒株，前S1抗原是判断乙型肝炎病毒复制的重要指标。 3、P区变异：用微孔板核酸杂交法检测乙肝病毒P基因区变异，突变位点主要位于HBV-DNA 聚合的区域（YMDD），M1（蛋氨酸）可被VC（缬氨酸）或IC（异亮氨酸）替代。研究用拉米夫啶（LMV）治疗慢性乙肝而发生耐药的有关变异可见：LMV本身可引起HBV的变异即YMDD变异，用LMV四周后50-70%的病人出现YMDD变异。 4、X区变异：HBV-X蛋白对信号转导通路及细胞凋亡有影响，X蛋白对核转运影响和对线粒体直接作用。X区变异引起X蛋白（HBXAg）过度表达，激活体内癌基因和抑制抑癌基因，导致肝癌的发生。有报导：用聚合酶链反应检测原发性肝细胞癌（HCC）患者癌组织及癌周组织中HBV-X基因，检出率分别为68%和77%。
病毒的遗传与变异 病毒的遗传能保持物种的相对稳定，维系生物界的平衡；而病毒的变异可导致新品种出现，孕育生物界的进化。病毒是一类极为简单的分子生物，核酸是遗传的物质基础，核酸复制的忠实性使病毒具有稳定的遗传表现。但由于病毒没有细胞结构，其遗传物质极易受外界环境及细胞内分子环境的影响而发生改变，病毒与其它生物相比，其遗传具有更大的变异性。 病毒的变异主要源于其基因组的突变和重组。病毒突变一般分为自发突变和诱导突变。自发突变是在没有任何已知诱变剂的条件下，病毒子代产生高比例的突变体，最后导致表型变异。诱导突变则是利用不同的物理或化学诱变剂处理病毒，提高病毒群体突变率，诱导病毒子代出现特定的突变类型。DNA病毒和RNA病毒在突变频率上有较大的差别。病毒突变类型可从多层次、不同水平进行分类，但目前作为研究工具的突变体类型主要有无效突变体、温度敏感突变体、蚀斑突变体、宿主范围突变体、抗药性突变体、抗原突变体、回复突变体等。 病毒重组一般通过分子内重组、拷贝选择和基因重配三种机制完成。分子内重组需要核酸分子的断裂及其它核酸分子的再连接，拷贝选择不涉及核酸分子的共价键断裂，基因重配则是具分段基因组病毒之间核酸片段交换，基因组各片段在子代病毒中随机分配。病毒重组机制不同，其重组频率有很大差别，且RNA分段基因组病毒同型不同株病毒间的重组经重组重配机制进行，其重组率可高达50%.通过病毒重组，可构建表达特定外源基因的重组病毒，可使灭活病毒经交叉感染或复感染得以复活，这在病毒的研究和利用上都具有重要意义。 病毒表型突变除了源于基因组的突变和重组外，还有一些非遗传因素影响病毒变异。无囊膜病毒的转壳、表型混杂及具囊膜病毒的伪型病毒都可使病毒的表型发生改变。病毒的同源干扰、缺陷干扰及缺陷病毒的存在也会对病毒表型变化产生影响。 如何利用病毒突变和重组建立病毒生物学研究的有效方法，如何利用重组病毒构建重要疾病基因治疗载体，是研究病毒遗传和变异的主要目的之一。虽然有一些病毒现已可通过序列分析进行其基因组研究，但病毒重组作图、重配作图、中间型杂交、转录图和多肽图等仍是研究病毒遗传图的重要方法。在病毒基因功能研究中，经典的互补试验、克隆基因的互补试验及利用突变和重组进行的顺式因子分析、反式因子分析和基因瞬时表达，都有着不可替代的作用。由于一些病毒可以感染动物和人类的特异组织细胞，利用这些病毒构建表达外源基因载体，用于人类一些特殊疾病的基因治疗，这一方面具有诱人的前景。 比如，为什么过去感染过流感的人，虽然体内已经产生了抗体，但对新型病毒变异株却可能没有免疫力呢？为什么流感大流行会经常反复的出现，而为了能够提供有效防御流感的疫苗，则必需频繁地制造出新的流感疫苗呢？这是因为：流感病毒的抗原性会因为核酸的复制、装配等各种因素而发生变化，有了这些变化，流感病毒就可以有效地逃避宿主的免疫清除。