植物细胞器的分离
一、叶绿体的分离：
1.实验原理：
采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。
2.实验材料及试剂：
成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。
3.实验器材：
SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)
山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol
需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3
mol/L*182.17g/mol=54.651g
EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol
m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g
LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol
m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g
4.制备方法
4.1叶绿体粗提物的制备
（1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min),
（2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,
（3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,
（4）.弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2 000 g在3000r/min离心10min,所得沉
淀即为叶绿体粗提物,
（5）.将此粗提物悬浮于7.5 mL细胞器分离缓冲液中备用。
4.2密度梯度离心制备完整叶绿体
（1）.用50 mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18 mL含52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.8),25 mmol/L EDTA(pH为8.8)的混合液,
上面用7 mL含30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.0)、25 mmol/L EDTA(pH 为8.0)的混合液覆盖。
（2）. 将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于30%的蔗糖上面,平衡后在4℃、20 kr/min离心30 min。
（3）.处于52%蔗糖与30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。
（4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。
5.叶绿体的显微鉴别：
叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜（400~600）下观察到它的形态和分布。
二、线粒体的分离
1.实验原理：
利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
2.实验材料及试剂：
实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase和RNase为上海生物工程技术服务有限公司产品;
溴化乙锭为SerVa公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE电泳缓冲液(称取242 g Tris溶于适量蒸馏水中,加入57. 1 mL冰乙酸, 100 mL 0.5mol·L1EDTA,pH= 8. 0,用蒸馏水定容至1 L即为50×TAE转换为1 ×TAE稀50倍)缓冲液A:蔗糖0.
5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·1,EDTA5mmol·L-1,BSA 0. 1%,PVP0. 5%, 0. 1%β-巯基乙醇,pH= 7. 5.缓冲液B:蔗糖0. 5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·L-1, pH= 7. 5.缓冲液C:蔗糖0.
6 mol·L-1, Tris-Cl 10mmol·L-1,EDTA 20mmol·L-1, pH= 7. 2.缓冲液D: 0. 1 mol·L-1Tri-HCl(pH= 8. 0),0. 05 mol·L-1EDTA (pH= 8. 0), 0. 1mol·L1NaCl,10%SDS, 0. 01mol·L-1β-巯基乙醇.
EDTA：配置体积：100ml , 浓度: 0.5mol/L, 分子量：292.248g/mol
m= 0.5mol/L*100mL /*292.248g/mol =14.6124g.
蔗糖:配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:342.3g/mol
m= 0.5mol/L *100mL*342.3g/mol=17.115g.
LTris-Cl:配置体积:100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:121.14g/mol
m= 0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g.
蔗糖:配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/l , 分子量:342.3g/mol
m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.
蔗糖: 配置体积：100ml , 浓度:0.6mol/L ,分子量:342.3g/mol
m= 0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g.
Tris-Cl:配置体积：100ml, 浓度：0.1mol/L , 分子量:121.14g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g.
EDTA:配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/l , 分子量：292.248g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g.
NaCl : 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量:58.44g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g.
β-巯基乙醇: 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：78.13g/mol
m= 0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g.
3.实验仪器:
超速冷冻离心机、制冰机、研钵(Υ= 15 cm)、无菌纱布、大离心管
(50mL)、水浴锅、微量离心管(1. 5 mL)、微量离心机(1. 5mL管)、-20℃冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯.
4.实验方法:
（1）.采集叶片30 g左右(采集前需暗培养24～28 h,以减少叶片组织所含糖类的污染);
(2).用蒸馏水洗涤2～3次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液A和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色;
(3).用6层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液A漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤, 2次滤液合并,补加缓冲液A至3～5mL·g-1试材,并将滤液分装于4个50mL无菌离心管中, 1 000 g离心10m in,收集上清液;
(4).将上清液2 000 g离心10m in,再收集上清液于20 000 g离心10m in得到粗线
粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL预冷的缓冲液B用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液1 000 g离心10min;
(5).收集上清液于同一50mL无菌离心管,加入300μL 1mol·L-1的MgCl2至终浓度0. 01mo·L-1,和5mg·mL-1的DNaseⅠ至终浓度20μg·mL-1,冰浴放置1. 5～2 h,在冰浴液中加入1. 5mL 0.5mol·L1的EDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol·L-1; (6).将上述溶液小心铺于缓冲液C上(每管25mL C缓冲液), 18 000 g离心20 m in;收集沉淀重新悬浮于装20 mL预冷缓冲液C的离心管中,18 000 g离心10m in,
得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在0～4℃条件下进行.
5.显微鉴别:
线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状，但必须借助健那绿(Janus green B)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态. 因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为1%健那绿染液（将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中,加温到30-40
摄氏度,使其充分溶解）.
三、细胞核的分离:
1.原生质体制备:
（1）.取生长3～4 d的拟南芥悬浮系细胞1 700 rpm离心3min.静置沉淀，（2）.用0.4 mol L甘露醇短暂洗涤后置于20mL酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8 mmol/LCaCl2, 11 mmol/LKH2PO4, 0.3mol/LMannitol, 0.3mol/Lsorbitol, 0.4%PVP-
甘露醇:配制体积：100ml , 浓度：0.4mol/l , 分子量:182.17g/mol
m= 0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g.
MES :配置体积：100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:213.25g/mol
m= 0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g.
CaCl2 :配置体积:100ml ,浓度：0.68mol/L ,分子量：110.98g/mol
m= 0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g.
KH2PO4 :配置体积：100ml ,浓度：0.11mol/L ,分子量：136.09g/mol
m= 0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g.
Mannitol甘露醇:配置体积：100ml , 浓度：0.3mol/L , 分子量:182.17g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g.
Sorbitol山梨糖醇:配制体积：100ml , 浓度：0.3mol/L ,分子量：182.17g/mol
m= 0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g.
PVP-K30 : m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g.
(3).摇床设定70 rpm,28℃.三层纱布过滤一次,
(4).滤液经1 700 rpm离心3min,去上清，
(5).用洗涤缓冲液(5 mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7))洗涤
MES :配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/L，分子量：213.25
m= 0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g.
sorbitol :配制体积：100ml ,浓度：0.2mol/L , 分子量：182.17g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.
Manmitol:配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：182.17g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.
2.细胞核与叶绿体的分离提纯
为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在0～4℃下进行.
2.1细胞核与叶绿体的粗提
(1). 向原生质体中加入含有0.5%Triton X-100的CSK缓冲液(100 mmol/L KCl,3 mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose, 1.2 mmol/L PMSF,20 mmol L DTT),振荡混匀后,静置7 min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏.
(2).取120g离心10min,弃上清液.
(3).用CSK缓冲液重悬沉淀,
(4). 20μm孔径的滤膜过滤,
(5).取120g离心10 min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物,
(6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况.
2.2细胞核与叶绿体的纯化
（1）. 把含有2.3mol L蔗糖的CSK缓冲液(100mmol LKCl, 3 mmol L MgCl2 ,1 mmol L EGTA(pH8.0), 10mmol LPIPES(pH6.8), 2.3 mol L sucrose, 1.2 mmol
KCl :配制体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：74.6g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g.
MgCl2:配置体积：100ml ,浓度:0.3mol/L , 分子量：95.21g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.
EGTA :配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：380.35g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g
PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：302.40g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g.
sucrose:配置体积：100ml ,浓度：2.3mol/L ,分子量：342.3g/mol
m= 2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g.
PMSF:配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L , 分子量：174.19g/mol
m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.
DTT :配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：154.25g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.
（2）.再把60%percoll CSK缓冲液(60%percoll, 100 mol L KCl, 3mmol L MgCl2, 1 mmol L EGTA(pH8.0), 10 mmol LPIPES(pH6.8), 300mmol Lsucrose, 1.2mmol
KCl:配置体积：10ml , 浓度：100mol/L ,分子量:74.6g/mol
m= 100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g.
MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.
EGTA: 配置体积：100ml , 浓度:0.1mol/L ，分子量：380.35g/mol
m=cv/M=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g.
PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L 分子量：302.40g/mol
m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024 g.
Sucrose:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：342.3g/mol
m= 0.3mol/L*100mL*342.3g/mol=10.269 g.
PMSF：配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L ,分子量：174.19g/mol
m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.
DTT:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L 分子量：154.25g/mol
m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.
(3).用移液枪加时要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象,
(4).然后把粗提细胞核与叶绿体的混合物用CSK缓冲液悬起并轻轻的平铺于上述两层的溶液顶部,
(5).最终形成三层溶液各居其层,
(6). 200 g离心32min.溶液梯度层重新分布,
(7).叶绿体沉于离心管底部,
(8).细胞核分布于2.3mol/L蔗糖的CSK缓冲液与60%percoll CSK缓冲液的交界处一薄层中,
(9).用移液枪小心吸出这一薄层,再加入2倍体积的CSK缓冲液,12000g离心
5min,沉淀即为纯化的细胞核,
(10).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核的纯化情况.并用1/400 mm2的血细胞计数板对从烟草悬浮细胞中提取的细胞核计数.
四、液泡的分离
1原生质体分离步骤
同细胞核的分离
2.酶液配制
1、比较植物、动物、微生物细胞的结构和生理特点。 性质动物细胞植物细胞微生物细胞 大小10-100um 比微生物细胞大10um 代谢调节方式内部和激素内部和激素内部 营养要求很苛刻苛刻宽松可利用多种底物 生长速率倍增时间一般为 12-60h 倍增时间一般为0.5-2h 机械强度最差，缺乏保护性细 胞壁差 差，抗剪能力弱较好 环境适应性很差差好 粘附性贴壁生长细胞团形式悬浮分离 2、描述植物细胞、动物细胞生物反应器的共性。各有何优缺点。 都需要满足动植物细胞抗剪切力弱，营养要求苛刻，培养条件严格，要求较高传质效率的特性；悬浮培养生物反应器 反应器优点缺点 机械搅拌式反应器（悬浮式）能够获得较高的溶氧系数剪切力大 通气搅拌式反应器（悬浮式）避免向培养基直接通气时气 泡损伤细胞，没有移动部件， 密封好，氧转换率较高，便于 放大氧传递系数小，气路系统不能就地灭菌 气升式培养反应器（悬浮式）湍流温和均匀剪应力小，完全 密封，便于无菌操作，氧的转 换率高，便于放大生产 填充床生物反应器（固定化）单位体积固定细胞量大混合效果差，使溶氧、pH、 温度控制、气体的排出较难流化床生物反应器（固定化）小颗粒传质特性良好剪切力和颗粒碰撞会损坏固 定化细胞 膜式（中空纤维）反应器（固定化）良好的传质性能，满足细胞贴 壁生长的特性；培养器体积 小，细胞密度高；产物纯度高； 自动化程度高；可重复使用 成本高 微载体悬浮培养系统比表面积大；生长条件易控制 且易放大，兼贴壁与悬浮培养 的优势，取样方便；易于分离 微囊培养系统小颗粒传质特性良好；科技含 量较高 结构复杂 3、你认为最适合于植物细胞、动物细胞培养的生物反应器、培养方法及操作方式，并说明其理由。
我国大规模细胞培养生物反应器综述 文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代 谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发. 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模，100L的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点： l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目，这些项目有的已购买设备，但需要维修，有的则需新添有关装置。 l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入，需要大量的用于生产的生物反应器，传统生物技术的生物反应器一般体积较大（几十M3到上百M3），而现代生物技术所需的反应器装置体积较小，但技术要求高。 l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。 l 随着生物技术的发展，需要性能更高的生物反应器，例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势，如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
植物细胞和组织 一、名词解释 1.细胞和细胞学说２．原生质和原生质体 3 ．细胞器4.组织５．胞间连丝6.细胞分化7．染色质和染色体8 ．纹孔９．传递细胞10 ．细胞周期 二、判断与改错（对的填“+”，错的填“－”） 1.构成生物体结构和功能的基本单位是组织。 ( ) 2．生物膜的特性之一是其具有选择透性。( ) 3．电镜下质膜呈现三层结构。（） 4．虎克第一次观察细胞时，因显微镜放大倍数太低,未能发现细胞核。（) 5．有丝分裂间期的细胞核可分为核膜、核仁和核质三部分。( ） 6.线粒体是细胞内主要的供能细胞器。（） 7．原生质的各种化学成分中,蛋白质所占比例最大。( ) ８.质体是植物特有的细胞器，一切植物都具有质体。（） ９. 所有植物细胞的细胞壁都具有胞间层、初生壁和次生壁三部分。( ) 10．质体是一类与碳水化合物合成及贮藏相关的细胞器。（) 11．胞质运动是胞基质沿一个方向作循环流动。（） 12.只有多细胞生物才有细胞分化现象。( ） １3．有丝分裂过程中，每一纺锤丝都与染色体的着丝粒相连。( ） 14 有丝分裂后期无核膜( ) １5.有丝分裂中DNＡ复制在G１期进行。（） １6．细胞分裂可分为核分裂，胞质分裂和减数分裂三种。( ） １7.细胞分裂时，染色体数目减半发生在分后期。( ) １8.减数分裂的结果总是使子细胞染色质只有母细胞的一半。（） 19．借助光学显微镜，可详细观察生活细胞有丝分裂的全过程。( ) 20．纺锤丝有微丝组成。（) 2１、皮孔是表皮上的通气组织。（) 22、水生植物储水组织很发达。（) ２3.成熟的导管分子和筛管分子都是死细胞。（) 24.活的植物体并非每一个细胞都是有生命的。（） ２5.“棉花纤维”不属于纤维。( ) ２7.成熟的筛管分子是无核、无液泡、管状的生活细胞。（) 28．分泌道和分泌腔均由细胞中层溶解而形成。（) 三、填空
实验一植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位,而原生质则是细胞中有生命的部位。死、活细胞原生质的理化性质有显著差别，如果细胞原生质的膜系统有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等等，而死细胞的原生质则丧失了这些特性。在植物生理研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验练习两种鉴定方法：质壁分离法及活体染色法，同时还可以通过对质壁分离及活体染色结果的观察，了解原生物的某些特性，如黏滞性、荷电性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 ［原理］活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间（由红变黄），在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 ［仪器与用具］显微镜1台；小培养皿一套；载玻片2片；盖玻片2片；单面刀片1片；尖头镊子1把；酒精灯1具；火柴1盒；擦镜纸、吸水纸适量。 ［试剂］ 0.03%中性红溶液；1mol/dm３硝酸钾溶液。 ［方法］ 1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部幼嫩部位）及小麦片作实验材料。 2．切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧纵横割划成0.5cm2的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内側向下）。若用小麦片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到的只剩下少量叶肉细胞时要小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除了小麦外，其他禾本科植物均可用此法制备表皮细胞纸片。将刮好的纸片切成约0.5cm2的小块。
观察植物细胞的质壁分离 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、实验材料： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮。（因为液泡呈紫色，易于观察。） 0.3g/ml的蔗糖溶液。（用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。） 三、实验步骤： 步骤注意问题分析 1．制作洋葱表皮的临时装片。在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平（也可挑取几条水绵放入水滴中）。盖上盖玻片。盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。 2. 观察洋葱（或水绵）细胞可看到：液泡大，呈紫色，原生质层紧贴着细胞壁。（或水绵细胞中有带状叶绿体，原生质层呈绿色，紧贴着细胞壁。液泡含花青素，所以液泡呈紫色。先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。 3. 观察质壁分离现象。从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离。原生质层与细胞壁之间充满蔗糖溶液。重复几次( 蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。) 为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。糖液浓度不能过高否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。 4. 观察细胞质壁分离的复原现象。从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。(细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。) 发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。( 因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。) 四、实验讨论答案： 1．如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 答：表皮细胞维持原状，因为细胞液的浓度与外界溶液浓度相等。 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 答：不会。因为红细胞不具细胞壁。
实验九观察成熟植物细胞的质壁分离和复原 实验原理： 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水； 由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开； 反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 目的要求： 1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法； 2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 重点和难点： 1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法； 2．临时装片的制作； 3．高倍显微镜的使用。 实验器材： 紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜； 质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水； 方法步骤： 一．临时装片制作： 1．选材： （1）选用紫色特别深的洋葱外表皮； 说明： A．在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸 水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。 B．将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡； （2）取表皮： 在洋葱的外表皮上，用刀片划一些“井”字，用镊子轻轻撕取一小块； 关键： 最好撕取的是一层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响 实验效果； 2．制片： 在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来； 加上盖玻片。 二○○一年十月二十五日星期四第 1 页共4 页
二○○一年十月二十五日星期四 第 2 页 共 4 页 注意： A ． 洋葱表皮不能卷曲起来； B ． 不能带有气泡； C ． 加盖玻片时，要从一侧大约呈45°角放下，在载玻片和盖玻片之间 充满了清水，以便挤出空气。 二．观察： (一) 低倍镜观察： (二) 高倍镜观察： 在高倍镜下主要要注意以下几个结构： （1 ） 紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞； （2） 注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。 （3） 找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。 (三) 质壁分离实验： 1．处理： 从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g%mL 的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。 实验成功关键之处： (1) 最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如 果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。 (2) 所用的溶液特别要注意以下几点： A ． 不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强 碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性； B ． 外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物
植物细胞器的分离 一、叶绿体的分离： 1.实验原理： 采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。 2.实验材料及试剂： 成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。 3.实验器材： SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团) 山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol 需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3 mol/L*182.17g/mol=54.651g EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g 4.制备方法 4.1 叶绿体粗提物的制备 （1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min), （2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯, （3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,
细胞培养用生物反应器 细胞培养用生物反应器 2010年12月22日 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L规模，100L 的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学
观察植物细胞详案 PPT展示章节。 开始上课： 师：(视频：丰富多彩的生物)我们学习了生物的特征，大家都知道：除病毒外，生物体都是由细胞构成的。细胞到底是什么样子的，结构又如何，大家想知道吗？ 生：想。 师：这一节课我们就一起来观察植物细胞。(PPT展示教学目标) 绝大多数细胞都非常小，我们要用显微镜才能观察到。 现在请同学们用显微镜观察一片树叶，能否看到它的细胞？ 生：取镜、安放、对光，观察。(2分钟左右) 师：巡视学生操作是否正确，及时纠正，发问：哪一组同学看到树叶上的细胞了？请举手。(让先做好的学生先回答1至3组)。分组回答 生：没有。 师：要看到植物体上的细胞，必须对生物材料进行处理，使生材料薄而透明，通常要把材料制作成玻片标本。大家知道常见的玻片标本主要有哪些？ 生：切片、装片和涂片。 师：(PPT展示介绍三种玻片标本的制作特点)。补充说明有些非常小、结构简单的生物(如单细胞藻类植物)可直接做成装片。本节课主要是制作植物临时装片，观察植物细胞及其结构。师：现在我们一起来熟悉一下我们所要做的实验。 首先，了解实验目的、要求和所需要的器材(PPT展示)，介绍如染色使细胞结构显示更清楚)；接着我们来学习把洋葱鳞片制作成临时装片的方法和步骤。请各小组阅读课本43页，讨论、交流3分钟。 师：请同学归纳步骤(2-3名) 生：其他同学纠错、补充(2-3名学生)。(注意表扬、鼓励学生，看到学生的亮点) 师：还有谁有什么没同意见？请举手。 生：没有。 师：（PPT展示一个字的制作步骤，请1-2名学生解释其中某些字如：撕和盖） 大家都知道了洋葱鳞片内表皮细胞临时装片的制作方法和步骤， 现在请同学们完成下列任务：( PPT展示任务) )，那组任务完成得快，会有意想不到的奖励，完成得又快又好得双份奖励。 生：实验中（10-15分钟） 师：(巡视，发现问题及时纠正，适时提醒)哪个小组观察到了细胞并把其中一个细胞画下来了，请举手。生：纷纷举手。 师：还有哪组，加油哟!
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤 （一）制作临时装片并观察 1、制片 ①、用拇指和食指夹住载玻片，然后取三层纱布沿一个方向擦拭载破片，直到对光看到载玻片光亮无污物为止。 ②、在载玻片上滴一滴水。（注意胶头滴管的正确使用方法：①握持方法是用中指和无名指夹住玻璃管部分以保持稳定，用拇指和食指挤压胶头以控制试剂的吸入或滴加量。 ②不能倒置，也不能平放于桌面上。③胶头滴管加液时，不能伸入容器） ③、 A 、洋葱：选用紫色特别深的洋葱外表皮，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取中间的小正方形。（注意在洋葱未经过处理时一定要取外表皮）由于每种材料主要只在取材上有区别，其它步骤基本类似。下面老师演示一种洋葱鳞片叶外表皮装片。 ④、将撕取的洋葱鳞片叶外表皮借助解剖针放在水滴中展平，主要是为了细胞尽量无重叠。 ⑤、用镊子夹住盖玻片盖在载玻片上（同学们注意：盖盖玻片应让盖玻片的一侧以大约 45 ?先触及载玻片，然后轻轻放平，防止装片产生气泡）如果四周水过多可以用滤纸吸一下。 2、观察洋葱细胞 显微镜使用顺序：取镜—安放—对光（无载破片）打开光源—低倍镜对准通光孔—聚光器调到最高—调节反光镜—把宏光光圈打开（如果还不够亮可以稍微动一下粗准焦螺旋）—放装片—先用低倍镜调粗准焦螺旋至物像清晰，并调至中央，后扭转物镜转换器用高倍镜观察 可以看到洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡，还可以看到原生质层紧贴着细胞壁。 （二）、观察质壁分离及复原 1、观察质壁分离现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加蔗糖会一不小心滴漏在显微镜上，会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入0.3g /mL的蔗糖 溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，重复几次，为什么要重复呢？让盖玻片下面的洋葱鳞片叶完全侵润在蔗糖溶液中。 ③高倍镜观察表皮细胞发生的变化。中央液泡变小，原生质层脱离细胞壁 2、观察细胞质壁分离的复原现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加清水会一不小心滴漏在显微镜上, 会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次。洋葱鳞片叶表皮浸润在清水中。 ③用高倍显微镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴向细胞壁。实验
观察植物细胞的质壁分离和复原 一、实验目的 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法； 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理 成熟的植物细胞在一定浓度的溶液中，构成一个渗透系统。当水分通过原生质层出入细胞后，由于原生质层与细胞壁的伸缩性大小不同，将导致原生质层与细胞壁分离或复原。 三、实验材料、用具 实验材料：（原因？） g/ml的蔗糖溶液（可否适用0.5g/ml的蔗糖溶液？原因？） 显微镜，镊子、载玻片及盖玻片、滴管、水等 四、探究程序 1：制作临时装片与观察 制作临时装片：用刀片在洋葱鳞片叶的外表面划一个小方块，用镊子撕取这一小块洋葱表皮，将它平展地放在载玻片中央的清水滴中，并盖上盖玻片； 观察：先用低倍镜找到洋葱表皮细胞，并移到视野中央，然后移走低倍镜，换上高倍镜。这时可看到洋葱表皮细胞中紫色的大液泡，还可以看到______ __________________________________；2：细胞的质壁分离 滴蔗糖溶液：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入0.3g／mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，洋葱表皮细胞就浸润在蔗糖溶液中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。可以看到细胞中的液泡逐渐变小，_________________________________，最后完全分离 3：质壁分离的复原 滴清水：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引这样重复几次，洋葱表皮细胞又浸润在清水中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴着细胞壁 五、实验结果及结论的分析 1．实验现象： 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，洋葱鳞片叶表皮细胞就失水，液泡体积，细胞液浓度，颜色；发生质壁分离； 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，细胞就吸水，液泡体积，细胞液浓 度，颜色已出现了质壁分离的细胞，发生质壁分离复原。 2．实验结论 细胞能否从外界吸收水分取决于细胞液的浓度和外界溶液浓度的高低。当细胞液的浓度高于外界溶液的浓度时，细胞就吸水，否则就失水 习题 1．对图示的生物学实验的叙述正确的是（） A．图甲是用低倍显微镜观察某视野中的图像，如要看清洋葱根尖处于分裂期的细胞，应将装片适当向左移动 B．图乙是某同学在2m×2m样方范围内进行的双子叶草本植物苦荬菜种群密度的调查，圆圈表示个体，则这块地苦荬菜的种群密度为3.25株/m2 C．图丙是在高倍显微镜下观察到的黑藻叶细胞的细胞质处于不断流动的状态，实际上图中所标注的叶绿体位于右下角，细胞质按逆时针方向流动 D．图丁表示用高倍显微镜观察正在发生质壁分离的紫色洋葱表皮细胞，可见其液泡的颜色逐渐变浅 2．很多生物学实验都需要制作临时装片，在显微镜下观察，下列实验步骤不正确的是（） A．脂肪的鉴定：切取花生子叶薄片→染色→洗去浮色→制片→观察 B．观察细胞中叶绿体：取黑藻幼嫩小叶→染色→制片→观察 C．察观察细胞有丝分裂：解离洋葱根尖→漂洗→染色→制片→观察 D．观察细胞质壁分离：制作洋葱鳞片叶表皮装片→观察→滴入0．3g/mL蔗糖溶液→观察 3．（多选）用一个紫色洋葱的鳞片叶可做下列哪些实验的材料? （） A．观察植物细胞减数分裂B．观察植物细胞的质壁分离和复原 C．观察细胞中DNA和RNA的分布D．叶绿体中四种色素的提取和分离 ①
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式 米力 第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地 陕西西安，710032 动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。 动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。 1. 批式操作（batch culture） 批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。 分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期，见图1。分批培养的周期时间多在3~5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48~72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。 图1 分批式培养动物细胞生长曲线
细胞器小结 植物细胞所特有的细胞器: 叶绿体、液泡（植物细胞特有的细胞结构再加上细胞壁） 动物和低等植物特有的细胞器：中心体 单层膜结构的细胞器: 液泡、内质网、高尔基体、溶酶体 双层膜结构的细胞器: 叶绿体、线粒体 不具膜结构的细胞器: 中心体、核糖体 含有核酸（包括DNA和RNA）的细胞器: 叶绿体、线粒体 含有色素的细胞器: 液泡（花青素）、叶绿体（叶绿素、类胡萝卜素） 能生成水的细胞器: 线粒体、叶绿体、核糖体 与能量转换有关的细胞器: 叶绿体、线粒体 动植物细胞都有，结构相同但功能不同的细胞器: 高尔基体（动物分泌蛋白、植物细胞壁形成） 根尖分生区没有的（和叶肉细胞相比较）细胞器: 叶绿体、大液泡 与蛋白质的合成和分泌有关的细胞器: 核糖体、内质网、高尔基体、线粒体 与主动运输有关的细胞器: 线粒体（产能）、核糖体（合成载体蛋白） 维持大气中氧气和二氧化碳平衡的细胞器: 叶绿体、线粒体 储藏细胞营养物质的细胞器: 液泡 能自我复制的细胞器: 叶绿体、线粒体、中心体 原核细胞中具有的细胞器: 核糖体 与细胞的渗透吸水能力直接有关的细胞器: 液泡 各种细胞器的结构和功能 ①线粒体和叶绿体： 二者均为细胞内的能量转换器，都有双层膜结构，基质中都含有DNA。 线粒体是有氧呼吸的主要场所，内膜形成嵴的意义在于增加内膜的表面积； 叶绿体是光合作用的场所，色素存在于基粒的囊状结构薄膜上，基粒和基质中都有酶。 ②核糖体：细胞内蛋白质的合成场所（发生缩合反应；完成翻译过程）。其中，附着于内质网上的核糖体合成的蛋白质将分泌到细胞外。 ③内质网：增大细胞内的膜面积，有利于细胞内化学反应的进行；与分泌蛋白的运输、初步加工（如折叠、糖基化）等过程及还与脂质、糖类的合成有关。
《实验七观察植物细胞质壁分离与复原》 作者：郭文娟 【教材分析】这是人教版生物高中第一册第三章第四节《植物对水分的吸收和利用》中的一节实验课是帮助学生理解细胞吸水原理的有力实例，但是这个实验的操作相对简单，因此在教学目标上， 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法 2．理解植物细胞发生渗透作用的原理我在原有的基础上，添加了用课本实验的方法，让学生体验实验设计的几个重要基本原则的目标【教学重难点】 1. 观察植物细胞的质壁分离 2. 理解植物细胞发生质壁分离与复原的原理根据我对高二学生的了解，他们具备了以下四个特征，而且在以往的实验课中经常想尝试做一些自己的实验，也正是由于这点，使我在这节课中作了一个新设计实验的尝试 【教学方法】保证学生能在上完这节课后，要留下对学习过程的记录和今后作为复习的第一手资料，因此我使用了学案教学的方法， 【学案教学法】 学案的使用分为课前预习、课堂导学、课后巩固测试三部分 【教学过程】 一、导课用导学案的预习部分，以回忆知识的方式，讲解实验原理，了解实验用具和材料，同时将方法步骤中的难点和注意事项交代清楚。 用大约5-6 分钟的时间，学生已经对课本实验已经了解透彻，可这个实验操作很简单，那我们能不能完成这个实验的同时再多做一些观察呢？有些学生就想观察一些其他的植物。 导学案上就提出可不可以根据课本实验，用质壁分离的原理比较其他植物细胞与洋葱表皮细胞吸水能力的强弱吗？ 问题提出后教师就利用导学案上的“课堂导学”部分对学生进行引导，学生通过讨论完成导学案上实验设计。这里我在导学案的实验设计中把它分解为以下这三个问题，为什么这样设置呢？ 首先变量是实验的核心；设计实验的核心归根到底就是要确定实验变量的选择；学生只有抓住了这个核心，才能抓住这个实验设计的要诀。 而接着对照实验组的确定无非就是对实验变量的控制，保证实验中对照实验组之间只有一个变量不同，无关变量尽量控制在相同的条件下。 第三观察现象的确定，在这一步里学生必须找到一个能确定实验结果的可观测指标，使这个实验具有可操作性。 这样的设置看似简单，但其中却恰恰包含了新课标对学生思维培养的一种期待，这种期待是什么呢？ 通过这个简单的实验，学生掌握的不仅仅是专业知识，更是在这个过程中潜移默化地培养他们的思维，这种思维不仅仅可以用在今后的生物学习中，更可以用来解决人生道路上的各种问题。 就这个案例来说，从讨论实验设计的方法中，学生可以体会到单一变量原则、对照原则、可行性原则，事实上这些原则提炼出来就是实事求是、严谨全面、正视困难的精神，当学生在今后学习生活当中遇到问题的时候，遵循这样的精神，去寻找解决问题的方法。 当然，这节课中，学生对学案中提出的问题大感兴趣，他们找到了很多植物，除了课本上的洋葱，还有红花羊蹄甲、菠菜、香葱、美人蕉等等植物，确定实验变量为不同植物细胞。 在设计对照实验的过程中，同学们设计了各种各样的对照实验，我选了几个比较有特色的三组同学的
观察植物细胞和动物细胞 目标： 1．观察洋葱鳞片叶的表皮细胞番茄果肉细胞和人的口腔上皮细胞，认识植物细胞和动物细胞的结构特点。 2．练习使用显微镜和制作临时装片。 3．初步学会画细胞结构简图。 材料用具： 洋葱鳞片叶，成熟的番茄，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，牙签，滴管，吸水纸，碘液，生理盐水，解剖针。（见图） 过程： 两人一组，分别进行洋葱表皮细胞装片番茄果肉细胞装片番茄果肉细胞装片和人口腔上皮细胞装片的制作，交换观察。 一、观察洋葱鳞片叶表皮细胞 1．用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。 2．用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。 3．把洋葱鳞片叶向外折断，用镊子从鳞片叶的内面撕下一小块透明的薄膜。4．把撕下的薄膜放在载玻片中央的水滴中，用解剖针轻轻地把它展平。 5．用镊子夹住一块盖玻片的边缘，将它的一侧先接触水滴，然后轻轻地放平，盖在薄膜上。注意不要在盖玻片下留下气泡。 6．把制好的玻片标本放在显微镜的载物台上，用低倍镜观察。转动粗准焦螺旋，如果物像不够清晰，再转动细准焦螺旋，直到看清细胞为止。 7．从显微镜上取出玻片，在盖玻片的一侧滴一滴碘液。用吸水纸从另一侧吸去原来留在载玻片上的清水，好让碘液渗入到载玻片和盖玻片之间。再次把玻片放在低倍显微镜下观察。 二、观察番茄果肉细胞 用解剖针挑取少许番茄的果肉。制成临时装片，用低倍显微镜进行观察。看清楚番茄果肉细胞的结构。 三、观察人口腔上皮细胞 1．用凉开水把口漱净。用牙签从口腔腮壁处轻轻刮几下，牙签上附着了一些碎
屑。
2．用滴管在载玻片中央滴一滴生理盐水。把牙签放在载玻片的生理盐水滴中涂几下。 3．盖上盖玻片，注意不要留下气泡。 4．把口腔上皮细胞制成涂片，用碘液染色，然后放在低倍显微镜下观察。 画图 1．把铅笔（一般用3H的）削尖，先在纸上轻轻画出细胞的轮廓，然后再画出清晰的细胞结构图。 2．细胞中的细胞核和细胞质部分，用铅笔点上细点来表示。细胞核的细点要点得密一些（见图）。 3．在画好的细胞的右侧，用尺从细胞的各部分引出水平的指示线，再注明名称。4．依照观察到的细胞原样，画出2～3个洋葱表皮细胞或番茄肉细胞或者人口腔上皮细胞。把其中的1个细胞的各部分结构画完全，并注明名称。 讨论 1．洋葱表皮细胞与人口腔上皮细胞在结构上有什么不同？它们有没有共同的特征？ 2．为什么要用盖玻片盖着标本，才能放在显微镜下观察？ 3．观察细胞时，在盖玻片下滴加碘液有什么作用？ 反思：细胞结构对于初中阶段的学生来说一直都是学习的难点。课本中细胞结构的学习是建立在学生对细胞结构的观察基础上的。课本中学习动植物细胞是先进行观察后再学习相应的细胞结构和功能，而我是将结构的讲解放在了前面，避免学生的学习注意力集中在活动中如何正确操作上面，而忽略了活动的真正目的。 如：在观察动物细胞活动之前，给学生展示结构模式图，并通过此图来介绍细胞的结构和各个结构的功能，强调模式图的特点，让学生明白细胞是一个立体的结构而不是我们在课本和显微镜下的平面结构。这样学生即便在活动里看到模糊的人口腔上皮细胞，都能明白细胞结构的大概位置，不但加深之前讲解的结构位置，同时也减去教师在活动中烦琐的指导和讲解。 观察植物细胞前，重点强调植物细胞与动物细胞在结构上的差异，同时这些结构在观察时出现的问题：植物细胞的细胞壁与细胞膜是紧贴在一起的，所以观察活动的结构是仅仅能看清楚细胞壁，不能因为仅仅观察到细胞壁而忽视了细胞
动物细胞培养反应器 动物细胞培养反应器动物细胞体外培养时，生物反应器是整个培养过程的关键设备，为细胞提供了一个适宜的生长环境，使之快速增殖并形成所需的生物组织制品。由于动物细胞在其形态结构、培养方法以及所需的力学环境等方面均不同于微生物细胞，因而传统的微生物反应器显然已不适用于动物细胞大规模培养，特别是组织工程的需要，促使新型生物反应器的研究与开发。 动物细胞培养反应器-分类及结构特点
动物细胞培养反应器 1、搅拌式生物反应器 搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。 （1）供氧方式的改进 一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。
笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器，整体呈梨形，搅拌置于反应器底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。 （2）搅拌桨的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。 2、非搅拌式生物反应器 |搅拌式生物反应器用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，
探究植物细胞质壁分离的创新说课稿 武陟一中梁西周 一、理论背景及实验创新理念 目前高中生物教学中尽管改革不断深化，课堂的人文性有所加强，但生物课堂教学效率低下，低效教学甚至无效教学在传统的教学中仍然大量存在。因此当前亟待解决的问题就是如何实现有效教学，以尽可能少的时间、精力和物力投入，取得尽可能多的教学效果。对实验的创新是必要的，在改进中的和创新中使学生对实验的原理、现象、结论及其运用有更好的理解和掌握，相对传统的实验，创新实验的效果更明显，更易于激发学生的学习和探究热情，培养学生的发散思维和逆向思维，在教学过程中做到有效果、有效率、有效益。 二、教学内容分析 本案例出自必修1《分子与细胞》新课标内容的第四章第一节：物质跨膜运输的实例。本实验是在学习扩散和渗透、被动转运、主动转运知识的基础上，利用植物细胞质壁分离及质壁分离复原实验强化渗透作用原理，同时也是对物质出入细胞方式这块内容的升华。本实验也是在初中《科学》“根对水分的吸收”的基础上进一步学习植物的水分代谢过程。同时也与后面学习的细胞呼吸作用和光合作用存在一定程度的联系，是植物体新陈代谢的基础。 三、学情分析 学生除拥有初中自然科学相关水分吸收内容基础知识外，在学习物质出入细胞的方式内容后，他们对植物细胞在什么情况下吸水和失水等内容已经有所了解，并在日常生活经验中也有类似植物细胞吸水失水的实例，例如萝卜咸菜腌制等。但并没有系统学习植物细胞吸水和失水的基本原理及条件，缺乏感性认识。与平时理论课相比，学生对实验课有更高的积极性，对课本中没有的创新实验有更强的探究欲望。 四、教学目标 高中生物课程标准的基本理念中明确指出倡导探究性学习和注重与现实生活的联系。尝试从不同角度思考、分析和解释观察的现象，树立实事求是的科学态度；解释植物细胞质壁分离及质壁分离复原的现象。 1．知识目标：解释植物细胞渗透吸水的原理和过程；解释质壁分离与复原的实质；说明质壁分离能否自动复原的条件。 2．能力目标：初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法；尝试对实验结果进行分析和解释并得出相应的结论；运用质壁分离与复原知识解决实际问题；复习并熟练光学显微镜的操作步骤。 3．情感目标：参与小组合作与交流，体验团队协作学习过程；通过实验结果和现象观察，养成实事求是的科学态度；培养不断探求新知的精神和合作精神。 五、教学重点与难点
实验二观察动物细胞和植物细胞 一、实验目的 1.练习使用显微镜和制作临时装片； 2.进一步认识细胞的基本结构并了解动植物细胞的区别； 3.学习如何绘制生物显微图。 二、实验原理 实验室常用的光学显微镜是根据凸透镜成像的原理制成的，因此使用光学显微镜时光必须能透过物体，才能利用显微镜进行观察。因而在制作装片时，被观察的物体必须薄且透光。 三、实验器材 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、牙签、吸水纸、纱布、刀片、水、红墨水（或碘液）、0.01%亚甲基蓝溶液、0.9%的生理盐水、洋葱鳞片。 四、实验步骤（补充步骤）和结果记录 （一）观察洋葱表皮细胞 1.擦：________________________________________________________________ 2.滴：________________________________________________________________ 3.撕：________________________________________________________________ 4.展：________________________________________________________________ 5.盖：________________________________________________________________ 6.染：________________________________________________________________ 7.观察 （1）将在显微镜下观察到的洋葱表皮细胞绘制在下面的空白框内，画图时注意如下几点：将结构图画在中部偏左部分，在标注细胞中的结构时，需用尺引出水平线，并将相应的结构名称标注在线的右边；画图时只能采用点、线、面，明暗部分用铅笔点出疏密不同的细点表示；最后在结构图下方标注所画图形的名称（如洋葱表皮细胞） （2）若无法找到洋葱表皮细胞，请参照P45页找出问题并尝试解决，再完成绘制任务： _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________