EM菌种的活化与扩培技术
日期：2011-4-28 8:55:36 点击次数 788 发布单位：中国养殖信息网录入：李清
EM菌种固体原种10克可以制作10-20公斤EM原液
EM菌种固体原种由双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌等单一菌种单独发酵提纯真空干燥后再复合而成，每克含有益总菌数≥200亿 CFU。
【产品名称】EM菌种
【主要成分】双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌
【产品性状】本品为黄褐色粉末
【制作方法】制作ＥＭ菌种发酵液——EM原液
A、菌种活化：取ＥＭ菌种10克、红糖0.1公斤（红糖先用热开水溶化），加入1公斤无菌的水中。注：（先把水加热到100°C后加入红塘，而后继续加热5分钟。冷却到37°C时加入ＥＭ菌种），密闭发酵( 35°C—37°C温度 )3-5天，从第二天开始可以隔一天松动容器口放气减压一次，打开容器口时闻到有酸甜味即活化成功。可以作为液体菌种使用。
B、制作原液：将活化好的一公斤液体菌种加入二级发酵罐( 密闭容器 )( 加水比例按1：10-20的比例加入 ) ，二级发酵时培养基的配方：（10%的红糖--必须添加、0.3%的尿素0.1%微量元素--可以不添加、0.1%的复合维生素--可以不添加、0.1%氨基酸--可以不添加！发酵温度35-37度！发酵时间5-7天！），从第二天开始可以隔一天松动容器口放气减压一次，打开容器口时闻到有酸甜味即发酵扩培成功。成品发酵液标准:（气味：酸甜， PH值：3.0-4.0，活菌含量：大于100亿/ml ）
【注意事项】容器：不锈钢发酵罐（温控、压力控制、搅拌）、塑料桶、塑料壶、塑料瓶，禁止使用玻璃容器（防止爆炸）。
华微EM-200(高效有益菌群核心配方技术)
华微EM-200是“华微研发中心”专门针对水产研发的用于调水的产品EM菌种，该产品菌种纯、活力强，增殖增力快，20克/包真空包装，一包可制备250公斤高性能EM菌液。
作用与用途：
（1）调节水质、改良底质、降低氨氮、亚硝基氮等有害物质，同时能稳定PH值、稳定水色；
（2）能把池底的有机物质、残饵、生物尸体分解为二氧化碳、硝酸盐、磷酸盐等，可为单细胞藻类生长提供营养；（3）能有效抑制有害微生物和有害浮游动物、植物的生长繁殖；（4）能补充营养、改善机体代谢、降低饵料系数；
（5）刺激免疫系统、提高免疫力、提高耐受力和抗应激力。
用法与用量：
（1）适用于海淡水、半咸水中的鱼、虾、蟹、蛙、贝、甲鱼等水生生物；
（2）放苗前每亩（1米）水深计，投放EM原液2公斤，加水稀释后全池均匀泼洒，水质较差时可适量增加。一般七天
用一次；
（3）养殖中后期每亩（1米）水深计，投放EM原液2公斤；
（4）用EM菌液直接均匀喷洒在饲料上，用鱼肝油、海带粉或其他黏合剂包被后投喂，用量为每公斤饲料用EM原液10毫升，可提高虾的采食量。
制备方法：
华微EM-200扩培方法分两步：
第一步，做EM菌原液；
第二步，将EM菌源液当成种子进行二次扩培。
第一步：制备EM菌原液。
1．EM菌培养基配方：EM菌种20克（1包）、水20千克、红糖1千克、尿素0.1千克。
2．材料选择
（1）塑料桶：容量应在25千克以上，红白色均可，要求能密封，装饮用水；
（2）糖：副食店或粮油批发市场有售；
（3) 尿素：化肥用的即可；
（4）水：干净的饮用水（或井水）即可，自来水需放两天以上才能使用。
3．培育方法
用开水溶化红糖、尿素——放置冷却——把水放进塑料桶中——加入EM菌种子——摇匀——密封——静止方置4天左右（温度低时间要长点），用pH试纸检测pH值在4左右即可使用，有酸甜味和少量酒香味，此时为EM原料液。
第二步：二次扩培
把20公斤原液作为种子加入到200公斤红糖水中（配方见第一步的培养基配方），方法同前，放置4-10天左右即可使用，成功的标志为pH值4左右
包装：20g/包真空包装
附件： 新菌株（乳酸菌）斜面培养法 1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉） 2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。 3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）： 3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时 3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。 3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。 3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。 3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。 4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟 5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀 6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时 后，得到二代菌。 7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。 注意事项： 1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。 3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。 第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。第三代为工作用菌。 乳酸菌菌种保存法 方法一：斜面保存法（略） 方法二：20%甘油保存法 器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅 操作步骤： 1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行 36.5℃恒温培养48小时 2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒 3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min） 4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧 紧盖子，摇匀，标识。 5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记 6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。 7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。 实验室菌种激活方法
第一章无菌操作技术 第一节灭菌技术 一、干热灭菌 1.1、灼烧灭菌 【总操作程序】 主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。具体操作如下： ①点燃火源 一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。 ②灼烧2～3次 一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。 【达标标准】 灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。 【注意事项】 ①正确使用火源，防止失火。 使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。灼烧时应用火焰的外焰 ②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。 【相关知识】 干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 1.2、干热灭菌 【总操作程序】 主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。具体操作如下： ①装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。 ②升温 接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。 ③恒温 当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。 ④降温 切断电源，自动降温。 ⑤开箱取物
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml 无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L 型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。
菌种活化-操作方法-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环 （2）平板划线法
培菌方法： 1、所谓活性污泥培养，就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件，即营养物，溶解氧，适宜温度和酸碱度。 （1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持100∶5∶1。 （2）溶解氧：就好氧微生物而言，环境溶解氧大于0.3mg/l，正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径500μm活性污泥絮粒而言，周围溶解氧浓度2mg/l时，絮粒中心已低于0.1mg/l，抑制了好氧菌生长，所以曝气池溶解氧浓度常需高于3－5mg/l，常按5－10mg/l控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg/l较为适宜。 （3）温度：任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速，但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10－45oC，适宜温度为15－35oC，此范围内温度变化对运行影响不大。 （4）酸碱度：一般PH为6－9。特殊时，进水最高可为PH 9－10.5，超过上述规定值时，应加酸碱调节。 2、培菌法： （1）生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于正常期曝气量。 （2）干泥接种培菌法：最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干
污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1％的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度 （3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺，分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌，在少量接种条件下，在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。 （4）工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌；另一类工业废水，营养成分尚全，但浓度不够，需补充营养物，以加快培养进程。所加营养物品常有：淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水（碳源）；或尿素、硫氨、氨水（氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 （5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水，只能先以生活污水培菌，然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。 （6）直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养，还可利用当地科研力量，利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA（聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法，投资大，周期长，只有特殊情况才用。 3、驯化：在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量，逐渐减少，工业废水比例逐渐增加，最后全部转为受纳工业废水，这个过程称为驯化。理论上讲，细菌对有机物分解必须有酶参与，而且每种酶都要有足够数量。驯化时，每变化一次配比时，需要保持数天，待运行稳定后（指污泥浓度未减少，处理效果正常），才可再次变动配比，直至驯化结束。
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将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养 箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于 5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10- 10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品 溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度， 使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。 抑菌作用初步筛选 将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培 养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液， 均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对 照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作 台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。 抑菌率=对照菌落数-处理菌落数?100% 对照菌落数 实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。 菌种活化：37℃培养；约24H 挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养 8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。 生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min 即可。 篇二：大肠杆菌电击转化流程 大肠杆菌感受态制备及电转化流程 1. 细菌电转化感受态细胞的制备 准备：50mL离心管3个 10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个 1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。晚上将新鲜的菌落接 种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转 速控制在200rpm； 2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培 养基的 250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；
香菇菌种生产的方法与步骤 (一)母种生产培养基的配方选择 一是马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂16~23克，水1 000毫升。氢离子浓度1 000~10000纳摩／升(pH5~6)，用于分离、培养菌种。 二是PDA改良培养基(甲)：马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾(KH2PO4)2克，硫酸镁(MgSO4)0．5克，维生素B110毫克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升(pH5．0～5．5)，用于培养、分离菌种。 三是PDA改良培养基(乙)：马铃薯(去皮)200克，麸皮或米糠50克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克，琼脂20克，灭菌后氢离子浓度3163～3981纳摩／升(pH5．4～5．5)。 四是PDA改良培养基(丙)：心材木200克，细米糠(或麸皮)100克，硫酸铵1克，麦芽糖(或葡萄糖)20克，琼脂20克，水1 000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升 (pH5.0～5.5)，用于分离菌种。 五是麦芽浸膏、酵母浸膏、琼脂培养基(MYD)：麦芽浸膏3克，葡萄糖10克，酵母浸膏3克，琼脂20克，蛋白胨5克，水1 000毫升(用于菌种培养)。 六是麦芽浸膏、蛋白胨培养基(MPA)：麦芽浸膏20～25克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1 000毫升(用于分离、培养、保存菌种)。 上述6个培养基配方中，马铃薯、葡萄糖、琼脂(PDA)配方应用最普遍。在此着重介绍PDA培养基的配制方法与步骤： 1．制备培养基的操作程序 选择优质马铃薯，去皮或挖去发芽眼，削去发青皮，切成薄片，称取200克，置于钢精锅，加水1 000毫升，煮沸后小火保持30分钟，趁热用8层纱布过滤后放人有1 000毫升刻度的量杯(或量筒)中，补充水到1 000毫升，倒回钢精锅，加琼脂继续加热，待琼脂溶化后，再加葡萄糖，再补水至1000毫升，用玻璃棒搅均匀，趁热分装试管，或装入三角瓶备用。 2．分装试管 将配制好的PDA培养基，趁热(60℃)倒人事先准备好的量杯或玻璃漏斗，分装试管。每支试管装培养基为管长的1／4，培养液不可贴附管口内壁，如有沾附物必须揩拭干净。 3．做棉塞 取适量棉花做成较紧实的棉塞，塞入试管约2厘米左右，外留1厘米，紧贴试管内壁，松紧度
菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断
搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法
污水处理菌种培养方法 培菌方法： 1、所谓活性污泥培养,就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件,即营养物，溶解氧,适宜温度和酸碱度。 (1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持1００∶5∶1。?(２)溶解氧:就好氧微生物而言,环境溶解氧大于0.3mg/ｌ,正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径5０0μm活性污泥絮粒而言,周围溶解氧浓度２ｍｇ/l时,絮粒中心已低于0.1mｇ/l,抑制了好氧菌生长,所以曝气池溶解氧浓度常需高于3-５mｇ/ｌ，常按5－10mｇ/ｌ控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg／ｌ较为适宜。 (３）温度:任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速,但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10-４5oC，适宜温度为15-35oC,此范围内温度变化对运行影响不大。?(4）酸碱度:一般PH为6-9。特殊时,进水最高可为PH 9-１0.5,超过上述规定值时,应加酸碱调节。?2、培菌法:?（1）生活污水培菌法:在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现,并逐渐增多。为加快培养进程,在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等,以提高营养物浓度。特别注意,培菌时期（尤其初期)由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于
正常期曝气量。 (2)干泥接种培菌法:最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1%的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度(3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺,分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌,在少量接种条件下,在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。?（4)工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌;另一类工业废水，营养成分尚全,但浓度不够,需补充营养物,以加快培养进程。所加营养物品常有:淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水(碳源);或尿素、硫氨、氨水(氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 (5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水,只能先以生活污水培菌,然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。?(6)直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养,还可利用当地科研力量,利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA(聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法,投资大,周期长,只有特殊情况才用。 ３、驯化:在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量,逐渐
低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。
常用的菌种的筛选方法如下： （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。 （2）随机分离方法 有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。 （3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养
常用的几种微生物接种方法 接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同，分述如下： 一、平板划线接种法（分离培养法） 是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。 （一）分段划线法 平板分段划线(左)及培养后菌落分布图 本法多用于含菌量较多的标本。方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。 （二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。
菌种培养方法 污水处理-生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水-污水处理，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节-污水处理，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程-污水处理，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期-污水处理（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量-污水处理，应大大低于正常期曝气量。 1. 前期准备阶段 1.1. 物料准备①污泥准备对于万立方米级污水处理装置而言，其 生化池体积较大，为了保证生化池初始污泥浓度，需要准备投加的原始污泥量很大。理论上讲，投加后生化池的污泥的质量浓度最好控制在2 500mg/L左右。实际运行时，为了节约成 本，调试期间初始污泥的质量浓度可控制在1 500mg/L左右，一日处理1×104m3污水生化 时间为12h的污水处理装置为例，调试前需准备含水率在80%的活性污泥约40m3。污泥品种最好是同类或相似的活性污泥。如有困难，其它活性较强的污泥也可使用。污泥在使用前为保证一定的活性，对待用的污泥需进行喷水保湿处理，在保湿条件下污泥的活性至少可保持15d以上。 ②碳源培养前的准备生化调试过程中理想的碳源是大粪及淀粉。一般来说调试前期以加入大粪为主，中后期以加入淀粉为主，为接生成本，淀粉可用地脚面粉替代。由于大粪无法事先储存，因此，事前需和有关部门确定好调试期间需要的数量。调试期间碳源准备量一般按如下原则进行估算。每天投加到生化池的COD量按混合后生化池COD的质量浓度在200~300mg/L水平计，其中地脚面粉COD的质量折算量约为1t[COD]/t[面粉]。大粪的COD 折算比较困难，根据经验，在整个调试期间需100~150 m3的大粪。加入大粪的目的除补充 碳源外，还可增加生化池菌种的引入。地脚面粉可准备10~15t。③磷源、氮源的准备补 充碳源一般以普钙Ca（H2PO4)2为主，补充的氮源以尿素CO（NH2）2为主。生化池COD的质量浓度在300mg/L时估计BOD5值一般以100mg/L计，补充量按 m（BOD5）：m（N）：m （P）=100：5：1折算，每天需补充淀粉2000-3000kg，尿素100kg，补普钙200kg，质量比按照淀粉：尿素：普钙=20-30：1：2补给。调试期间需准备尿素2~3t，普钙5~6t。另外如有条件可准备10~20kg粉状阴离子聚丙烯酰胺（PAM）。 1.2. 物料化制及输送设备由于调试期间需要的物料量很大，加之生化调试无污水进入，池内污水流动性较差，为提高接种速度，需要将污泥及补充碳源尽可能均匀地输入各生化池内。因此，对于一定规模的污水处理设施设置物料化制及物料输送系统，对减轻劳动强度提高调试效率是必需的。根据经验，物料化制池宜设于地下，池内设空气搅拌装置，池容积一般在20~30m3。池内分二区，一区为化制区，该区需设置物料化制及初级垃圾清理装置；二区为输送取，设置潜水泵或液下泵，同时在泵周围设置垃圾同以防泵发生堵塞。输送管道在生化池附近宜使用软管以便根据需要调整投加料点位置。另外，物料化制旁最好设置一个消火栓或供水管，用于化制污泥及其它物料时供水。 1.3. 监测仪器准备为配合生化调试，需对生化池中的COD（铬法）、溶解氧、pH值、细菌等指标进行监测。一般生化处理调试需配备以下监测仪器：COD测定仪、溶解氧测定仪、pH值测定仪、显微镜。 2. 调试阶段 2.1. 初期（3d）①首先将生化池注入一定量的清水和部分待处理的污水， 然后将污泥倒入物料化制池。一般第1次投加20m3污泥，同时投加大粪等培养料，加水搅
EM固体菌种 本品由双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌等单一菌种复合发酵提纯而成，每克含有益总菌数≥1000亿个。本品促进畜禽增重率提高10～30%。使用本品所产的肉、蛋、奶能延长保鲜和储存。长期应用本品，综合效益极为显著。 【主要成分】双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、醋酸菌、光合细菌、解磷钾菌等 【产品名称】EM菌种 【产品性状】粉剂【批准文号】豫饲添字（2015）09003 【产品规格】10克/瓶；10瓶/盒【生产许可】豫饲添（2014）H07009 【有效日期】3年【贮藏方法】密封避光阴凉处 【制作方法】 第一步：材料准备如下：菌种1瓶；水36斤；红糖4斤；发酵桶1个；食盐20克（选加）；尿素20克（选加）； 第二步：把4斤红糖加入36斤水中后加热烧开去除杂菌；待冷却到40度以下后再装入发酵桶内。并加入1瓶菌种。 第三步：密封好发酵3到7天时间即可制作成功；成功后原液检测标准：PH在3到5之间；镜捡活菌100亿每毫升。 【注意事项】 第一：原液制作时可以加入20克食盐和20克尿素；加入的话会好些。这个是选加的；没有不加也可以。 第二：干净的水源和红糖也可以不烧开加热；但加热可以清除绝大部分杂菌；这样效果好些。 第三：制作过程中会有很强气压产生；可以每天打开放气后接着马上盖起来继续发酵；或安装自动排气阀。 第四：发酵温度最好控制在30到35度最好；低于10度不发酵；高于45度会烫死部分菌。 第五：冬天温度低需要延长发酵时间；但最好用电热毯或电灯；棉被等等包起来加温；或放太阳下晒。 第六：EM菌属于厌氧发酵；也就是说容器必须密封好发酵；密封好坏是发酵成败的关键因素。 第七：EM原液发酵饱和了PH值应在3到5之间；如高于5的话可以再延长发酵几天即可。 第八：黑糖；黄糖；葡萄糖；蜂蜜；都可以代替红糖使用；但白糖不行。 第久：制作好的液体请在12个月内用完；固体原种保存期是36个月。 第十：制作过程会有很大气压，建议使用塑料和不锈钢容器，严禁使用玻璃瓶和陶瓷瓶制作，以免意外。 第十一：瓶底有沉淀物为菌种载体，属正常情况；若瓶内有气体，请缓慢开启，以免菌液外溢。 【养殖专用菌种】 【作用机理】 1、EM有益菌可改善动物肠道内的微生物环境，帮助消化系统对食物的充分消化和吸收。 2、EM有益菌可激活动物体内上万种酶的活性；促进畜禽生长，提高动物繁殖能力。 3、EM菌可提高畜禽特异性免疫和非特异性免疫功能；达到动物抗病防病和减少发病的作用，代替抗生素。 4、EM有益菌可分解动物粪便中的有害微生物，明显消除圈舍粪便恶臭，改善饲养环境。 【作用用途】 1、EM菌种可以发酵微生物饲料、制作EM菌液（EM原露、EM原液）等微生物产品； 2、EM菌种能防治雏鸡白痢，中鸡球虫、脱肛和仔猪黄白痢、腹泻等消化道疾病； 3、EM菌种促进畜禽生长，提高动物繁殖能力，提高饲料报酬率、产蛋率和产肉率； 4、EM菌种可以用于发酵猪床，发酵猪床材料（锯末、秸秆粉、干草粉、黄土）； 【用法用量】 1、用发酵好的EM原液按1：300～500倍稀释后供动物饮用、混入饲料、喷洒到动物粪便上、发酵秸秆等； 2、治疗动物疾病时可加倍使用（1：100倍稀释）。
活性污泥菌种培养
活性污泥有多种培养方法，但不同的方法所要求的培养时间和人力物力均不同。应根据废水水质、气候、实际许可的条件等情况来选择培养方法。 1.培养前的准备工作 （1）各构筑物建成，并经清池清除建筑垃圾，静压试验证明无渗漏，无下沉位移，最后按有关规程验收合格。 （2）电器、机械、管路等全部设备建成并经单机试车、联动试车正常。最后按有关规程（说明书）验收合格。 （3）根据日后运行管理需要，有条件的污水处理厂（站）需进行最基本的常规化验测试，如pH、水温、COD、DO、生物相等，用以指导活性污泥的培养过程和日常运行。 （4）基础数据的调查摸底，包括污水流量昼夜变化情况，水质（pH、水温、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物质等）及其变化情况，各种设施和设备的技术参数。有条件的地方最好对受纳水体(如接纳排污的河流等)本底水质调查备案，以便考察若干年后对受纳水体的影响提供依据。
（5）根据处理水质状况备足必需的营养物(碳源、氮源、磷源)，以备缺什么补什么。采用接种培菌法还需备足污水性质相似其他污水处理厂（站）的干（或浓缩）污泥作为活性污泥微生物培养用的菌种。 （6）操作人员应熟悉整个系统的管道布置和公用工程方面的情况，了解污泥培养的基本过程和控制要求。 （7）人员到位，自培养和驯化后一般应使系统连续运行，不能脱人。 （8）编制必要的化验和运转的原始记录报表以及初步的建章立制。从培菌伊始，逐步建立较规范的组织和管理模式，确保启动与正式运行的有序进行。 自然培菌 自然培菌，也称直接培菌法。它是利用废水中原有的少量微生物，逐步繁殖的培养过程。城市污水和一些营养成份较全、毒性小的工业废水，如食品厂、肉类加工厂废水，可以考虑这种培养方法，但培养时间相对较长。自然培菌又可分为间歇培菌和连续培菌二种。 （1）间歇培菌。将曝气池注满废水，进行闷曝（即只曝气而不进废水），数天后停止曝气，静置沉淀1 h，然后排出池内约1/5的上层废水，并注入相同量的新鲜
菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
污水处理菌种培养方法 污水处理生化段需要用到哪些微生物菌种？目前市面感觉比较好用的是甘度污水处理菌种，比如甘度复合菌种、甘度反硝化细菌、甘度硝化细菌等；这些菌种都可以去除什么指标？今天我们就来聊聊甘度复合菌种、甘度反硝化细菌、甘度硝化细菌污水处理常用菌种培养方法？ 具体污水处理菌种对应的功效介绍： 1、甘度复合菌种：降解COD/BOD/氨氮/总氮/总磷等污染物；助力新老系统快速启动。 复合菌种主要是降解COD/BOD/氨氮/总氮/总磷等污染物，复合菌种是一个复合型菌种，属于兼性菌种，主要成分硝化细菌属、反硝化细菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和活化酶以及多糖等等。同时应用于新老系统启动也具有非常好的效果。 2、甘度硝化细菌：主要降解氨氮 氨氮的去除所用的细菌是硝化细菌，硝化细菌属于好氧菌种，主要应用于好氧池，其成分主要是亚硝酸菌和硝酸菌组成。 3、甘度反硝化细菌：主要降解总氮 总氮的去除所用的细菌是反硝化细菌，属于厌氧菌，主要应用于厌氧池或缺氧池，其主要成分是假单胞菌属、芽孢杆菌科等等。 硝化阶段 硝化阶段：含氮有机物（有机氮）在有氧货无氧环境中被氨化为氨氮，改部分污水进入有氧的处理构筑物后，在亚硝酸细菌和硝化菌的做一下转化为硝酸盐氮，为后续反硝化提供准备。 控制条件： 1、溶解氧：溶解氧控制在2~3mg/l之间，溶解氧低于0.6mg/l硝化过程将受到较大抑制， 2、水温：硝化菌比较合适的水温25~35℃之间。通常低于5℃时，细菌的活性会受到抑制，硝化菌就很难发挥它的作用。 3、PH值：硝化菌最佳的PH值7.5~8.5之间 4、底物浓度：硝化细菌是自养型好氧菌，底物浓度对于硝化菌不是其生产的必要因素。 5、污泥龄：需要保证好氧系统的微生物有足够的硝化菌，提供硝化菌的浓度，通常将污泥龄控制在10d左右。 反硝化阶段 反硝化阶段：承接硝化段的产物硝酸盐氮，对其进行反硝化反应，使硝酸盐氮转化为氮气排出水体。 PH值：反硝化过程合适的PH值6.5~7.5，PH值控制不当，将影响反硝化细菌的生长速率及