第十一章血清学试验
第六节免疫标记技术
免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术
荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查
1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。同时还必须使抗原标记抗体复合物易于接受激发光源，以便很好地观察和记录。这就要求标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。
根据被检样品的不同，采用不同的制备方法。细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣及感染的动物组织等，可制成涂片或压印片。感染组织最好制成冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。
标本的固定有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落，二是消除抑制抗原抗体反应的因素。最常用的固定剂是丙酮和95%的乙醇。固定后用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。
2．染色方法荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。
（1）直接法取待检抗原的标本片，滴加荧光抗体染色液于其上，置湿盒中，于37℃作用30min，用pH7.2的PBS液漂洗15min，冲去游离的染色液，干燥后滴加缓冲甘油（分析纯甘油9份加PBS 1份）封片，在荧光显微镜下观察。标本片中若有相应抗原存在，即可与荧光抗体结合，在镜下见有荧光抗体围绕在受检的抗原周围，发出黄绿色荧光（图11-8）。直接法应设以下对照，标本自发荧光对照，阳性标本和阴性标本对照。该方法优点是简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
（2）间接法取待检抗原的标本，首先滴加特异性抗体，置湿盒中，于37℃作用30min，用pH7.2的PBS液漂洗后，再滴加荧光色素标记的第2抗体(抗抗体)染色，再置湿盒中，于37℃作用30min，用PBS液漂洗，干燥后封片镜检。阳性者形成抗原-抗体-荧光抗抗体复合物,发黄绿色荧光（图11-9）。间接法对照除自发荧光、阳性和阴性对照外，首次试验时应设无中间层对照（标本加标记抗抗体）和阴性血清对照（中间层用阴性血清代替特异性抗血清）。
间接法的优点是，比直接法敏感，对一种动物而言，只需制备一种荧光抗抗体，即可用于多种抗原或抗体的检测，镜检所见荧光也比直接法明亮。
（3）抗补体法将抗血清与补体等量混合，滴加于待检抗原的标本片上，使其形成抗原-抗体-补体复合物，漂洗后再滴加荧光标记的抗补体抗体染色液，感作一定时间，漂洗、干燥后镜检。此法特异性和敏感性均高，但易产生非特异性荧光。
3．荧光显微镜检查标本滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，即可在荧光显微镜下观察。荧光显微镜不同于光学显微镜之处，在于它的光源是高压汞灯或溴钨灯，并有一套位于集光器与光源之间的激发滤光片，它只让一定波长的紫外光及少量可见光（蓝紫光）通过。此外，还有一套位于目镜内的屏障滤光片，只让激发的荧光通过，而不让紫外光通过，以保护眼睛并能增加反差。为了直接观察微量滴定板中的抗原抗体反应，如感染细胞培养物上的荧光，可使用现已有商品的倒置荧光显微镜观察。
（四）荧光抗体标记技术的应用荧光抗体标记技术具有快速、操作简单的特点，同时又有较高的敏感性、特异性和直观性，已广泛用于细菌、病毒、原虫的鉴定和传染病的快速诊断。此外还可用于淋巴细胞表面抗原的测定和自身免疫病的诊断等方面。
1．细菌病诊断能利用荧光抗体标记技术直接检出或鉴定的细菌约有30余种，均具有较高的敏感性和特异性，其中较常应用的是链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、马鼻疽杆菌、猪丹毒杆菌等。动物的粪便、黏膜拭子涂片、病变部渗出物、体液或血液涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣均可作为检测样本，经直接法检出目的菌，这对于细菌病的诊断具有很高的价值。
2．病毒病诊断用荧光抗体标记技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段，如猪瘟、鸡新城疫等可取感染组织做成冰冻切片或触片，用直接或间接免疫荧光染色可检出病毒抗原，一般可在2h内作出诊
断报告；猪流行性腹泻在临床上与猪传染性肠胃炎十分相似，将患病小猪小肠冰冻切片，用猪流行性腹泻病毒的特异性荧光抗体做直接免疫荧光检查，即可对猪流行性腹泻进行确诊。
二、酶标抗体技术
酶标抗体技术（enzyme-labelled antibody technicque）是继免疫荧光技术之后发展起来的一大新型的血清学技术，目前该技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。
（一）原理酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高度敏感性而建立起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂，催化反应过程中不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。
酶标抗体技术的基本程序是：①将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，这种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的催化活性。②将此种酶标记的抗体（抗抗体）与存在于组织细胞或吸附在固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质。③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。因而可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应发生。颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，或用分光光度计加以测定。这样，就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，用以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、纳克水平上测定它们的量。所以，本法既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。
（二）用于标记的酶用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广泛，其次是碱性磷酸酶。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量最高。HRP是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白，分子量为40 000。HRP的作用底物是过氧化氢，常用的供氢体有邻苯二胺
(0PD)和3,3,-二氨基联苯胺(DAB)，二者作为显色剂。因为它们能在HRP催化H
2O 2
生成H
2
O过程中提供氢，而自己生成有色产物。
OPD氧化后形成可溶性产物，呈橙色，最大吸收波长为492nm，可用肉眼判定。OPD不稳定，须现用现配，常作为酶联免疫吸附试验中的显色剂。OPD有致癌性，操作时应予注意。DAB反应后形成不溶性的棕色物质，可用光学显微镜和肉眼观察，适用于各种免疫酶组织化学染色法。
HRP可用戊二醛交联法或过碘酸盐氧化法将其标记于抗体分子上制成酶标抗体。生产中常用的酶标抗体技术有免疫酶组织化学染色法和酶联免疫吸附试验两种。
（三）免疫酶组织化学染色技术又称免疫酶染色法。是将酶标记的抗体应用于组织化学染色，以检测组织和细胞中或固相载体上抗原或抗体的存在及其分
布位置的技术。（图11-10）。
1．标本制备和处理用于免疫酶染色的标本有组织切片（冷冻切片或低温石蜡切片）、组织压印片、涂片以及细胞培养的单层细胞盖片等。这些标本的制备和固定与荧光抗体技术相同，但尚要进行一些特殊处理。
用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于组织和细胞内含有内源性过氧化酶，可与标记在抗体上的过氧化物酶在显色反应上发生混淆。因此，在滴加酶结合物
之前通常将制片浸于0.3% H
2O
2
中室温处理15～30min，以消除内原酶。应用1%～
3%H
2O
2
甲醇溶液处理单纯细胞培养标本或组织涂片，低温条件下作用10～15min，
可同时起到固定和消除内原酶的作用，效果比较好。
组织成分对球蛋白的非特异性吸附所致的非特异性背景染色，可用10%卵蛋白作用30min进行处理，用0.05%吐温-20和含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS对细胞培养标本进行处理，同时可起到消除背景染色的效果。
2．染色方法可采用直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗酶复合物法、增效抗体法等各种染色方法，其中直接法和间接法最常用。反应中每加一种反应试剂，均需于37℃作用30min，然后以PBS反复洗涤三次，以除去未结合物。
（1）直接法以酶标抗体处理标本，然后浸入含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。
（2）间接法标本首先用相应的特异性抗体处理后，再加酶标记的抗抗体，然后经显色揭示抗原-抗体-抗抗体复合物的存在。
3．显色反应免疫酶组化染色中的最后一环是用相应的底物使反应显色。不同的酶所用底物和供氢体不同。同一种酶和底物如用不同的供氢体，则其反应物的颜色也不同。如辣根过氧化物酶，在组化染色中最常用DAB，用前应以0.05%mol/L,pH7.4～7.6的Tris-HCl缓冲液配成50～75mg/100ml溶液，并加少量
（约0.01%～0.03%）H
2O
2
混匀后加于反应物中置室温10～30min，反应产物呈深
棕色；如用甲萘酚，则反应产物呈红色，用4-氯-1-萘酚,则呈浅蓝色或蓝色。
4．标本观察显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位DAB显色呈棕黄色。亦可用常规染料作反衬染色，使细胞结构更为清晰，有利于抗原的定位。本法优于免疫荧光抗体技术之处，在于毋须应用荧光显微镜，且标本可以长期保存。
（四）酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是应用最广、发展最快的一项新技术。其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。
1．固相载体有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。聚苯乙烯微量滴
定板（40孔或96孔板）是目前最常用的载体，小孔呈凹形，操作简便，有利于
大批样品的检测。新板在应用前一般无需特殊处理，直接使用或用蒸馏水冲洗
干净，自然干燥后备用。一般均一次性使用，如用已用过的微量滴定板，需进
行特殊处理。
用于ELISA的另一种载体是聚苯乙烯珠，由此建立的ELISA又称微球ELISA。珠的直径0.5～0.6cm,表面经过处理以增强其吸附性能，并可做成不同颜色。此小珠可事先吸附或交联上抗原或抗体，制成商品。检测时将小球放人特制的凹孔板或小管中，加入待检标本将小珠浸没进行反应，最后在底物显色后比色测定。本法现已有半自动化装置，用以检验抗原或抗体，效果良好。
2．包被将抗原或抗体吸附于固相表面的过程，称载体的致敏或包被。用于包被的抗原或抗体，必须能牢固地吸附在固相载体的表面，并保持其免疫活性。大多数蛋白质可以吸附于载体表面，但吸附能力不同。可溶性物质或蛋白质抗原，例如病毒蛋白、细菌脂多糖、脂蛋白、变性的DNA等均较易包被上去。较大的病毒、细菌或寄生虫等难以吸附，需要将它们用超声波打碎或用化学方法提取抗原成分，才能供试验用。
用于包被的抗原或抗体需纯化，纯化抗原和抗体是提高ELISA敏感性与特异性的关键。抗体最好用亲和层析和DEAE纤维素离子交换层析方法提纯。有些抗原含有多种杂蛋白，须用密度梯度离心等方法除去，否则易出现非特异性反应。
蛋白质(抗原或抗体)很易吸附于未使用过的载体表面，适宜的条件更有利于该包被过程。包被的蛋白质数量通常为1～10μg/ml。高pH值和低离子强度缓冲液一般有利于蛋白质包被，通常用0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液作包被液。一般包被均在4℃过夜，也有经37℃2～3h达到最大反应强度。包被后的滴定板可置于4℃冰箱，可贮存3周。如真空塑料封口，于-20℃冰箱可贮存更长时间。用时充分洗涤。
3．洗涤在ELISA的整个过程中，需进行多次洗涤，目的是防止重叠反应，避免引起非特异吸附现象。因此，洗涤必须充分。通常采用含助溶剂吐温-20(最终质量分数为0.05%)的PBS作洗涤液。洗涤时，先将前次加入的溶液倒空，吸干，然后加入洗涤液洗涤3次，每次3min，倒空，并用滤纸吸干。
4．试验方法 ELISA的核心是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体上一层层地叠加，可以是两层、三层甚至多层。整个反应都必须在抗原抗体结合的最适条件下进行。每层试剂均稀释于最适和抗原抗体反应的稀释液(0.01～0.05mol/L pH7.4 PBS中加吐温-20至0.05%，10%犊牛血清或1%BSA)中，加入后置4℃过夜或37℃1～2h。每加一层反应后均需充分洗涤。阳性、阴性应有明显区别。阳性血清颜色深，阴性血清颜色浅，二者吸收值的比值最大时的浓度为最适浓度，试验方法主要有以下几种（图11-11）。
（1）间接法用于测定抗体。用抗原包被固相载体，然后加入待检血清样品，经孵育一定时间后，若待检血清中含有特异性的抗体，即与固相载体表面的抗原结合形成抗原-抗体复合物。洗涤除去其他成分，再加上酶标记的抗抗体，反应后洗涤，加入底物，在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。样品中含抗体越多，出现颜色越快越深。
（2）夹心法又称双抗体法，用于测定大分子抗原。将纯化的特异性抗体
包被于固相载体，加入待检抗原样品，孵育后，洗涤，再加入酶标记的特异性抗体，洗涤除去未结合的酶标抗体结合物，最后加入酶的底物，显色，颜色的深浅与样品中的抗原含量成正比。
（3）双夹心法用于测定大分子抗原。此法是采用酶标抗抗体检测多种大分子抗原，它不仅不必标记每种抗体，还可提高试验的敏感性。将抗体(如豚鼠免疫血清Ab1)吸附在固相载体上，洗涤除去未吸附的抗体，加入待测抗原(Ag)样品，使之与固相载体上的抗体结合，洗涤除去未结合的抗原，加入不同种动物制备的特异性相同的抗体（如兔免疫血清Ab2），使之与固相载体上的抗原结合，洗涤后加入酶标记的抗Ab2抗体（如羊抗兔球蛋白Ab3），使之结合在Ab2上。结果形成Ab1-Ag-Ab2-Ab3-HRP复合物。洗涤后加底物显色，呈色反应的深浅与样品中的抗原量呈正比。
(5)酶标抗原竞争法用于测定小分子抗原及半抗原。用特异性抗体包被固相载体，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原共同孵育，对照仅加酶标抗原，洗涤后加入酶底物。被结合的酶标记抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定。如待检溶液中抗原越多，被结合的酶标记抗原的量越少，显色就越浅。可用不同浓度的标准抗原进行反应绘制出标准曲线，根据样品的OD值求出检测样品中抗原的含量。
（6）PPA-ELISA 以HRP标记SPA代替间接法中的酶标抗抗体进行的ELISA （见实训十五）。因SPA（葡萄球菌蛋白A）能与多种动物的IgGF
C
片段结合，可用HRP标记制成酶标记SPA，而代替多种动物的酶标抗抗体，该制剂有商品供应。
此外，还有酶-抗酶抗体法、酶标抗体直接竞争法、酶标抗体间接竞争法等。 5．底物显色与免疫酶组织化学染色法不同，本法必须选用反应后的产物为水溶性色素的供氢体，最常用的为邻苯二胺(OPD)，产物呈棕色,可溶，敏感性高，但对光敏感,因此要避光进行显色反应。底物溶液应现用现配。底物显色以室温10～20min为宜。反应结束，每孔加浓硫酸50μl终止反应。也常用四甲基
联苯胺(TMB)为供氢体，其产物为蓝色，用氰氟酸终止(如用H
2S0
4
终止，则为黄
色)。
6．结果判定 ELISA试验结果可用肉眼观察,也可用ELISA测定仪测样本的光密度(OD)值。每次试验都需设阳性和阴性对照，肉眼观察时，如样本颜色反应超过阴性对照，即判为阳性。用ELISA测定仪来测定OD值，所用波长随底物供氢体不同而异，如以OPD为供氢体,测定波长为492nm，TMB为65Onm(氨氟酸终止)或450nrn(硫酸终止)。
定性结果通常有两种表示方法：以P/N表示，求出该样本的OD吸收值与一组阴性样本吸收值的比值，即为P/N比值，若≥2或3倍，即判为阳性。若样本的吸收值≥规定吸收值（阴性样本的平均吸收值+2标准差）为阳性。定量结果以终点滴度表示，可将样本稀释，出现阳性（如P/N>2或3，或吸收值仍大于规定吸收值）的最高稀释度为该样本的ELISA滴度。
（五）斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) 该试验是近几年创建的一项新
技术，不仅保留了常规ELISA的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢的缺点。此法的原理及其步骤与ELISA基本相同，不同之处在于：一是将固相载体以硝酸纤维素滤膜、硝酸醋酸混合纤维素滤膜、重氮苄氧甲基化纸等固相化基质膜代替，用以吸附抗原或抗体；二是显色底物的供氢体为不溶性的。结果以在基质膜上出现有色斑点来判定。可采用直接法、间接法、双抗体法、双夹心法等。
（六）酶标抗体技术的应用此技术具有敏感、特异、简便、快速、易于标准化和商品化等优点，是当前应用最广、发展最快的一项新技术。目前已广泛应用于多种细菌病和病毒病的诊断和检测，并多数是利用商品化的ELISA试剂盒进行操作，如猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛结核病、鸡新城疫、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病、蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等传染病的诊断和抗体监测常用此技术。
课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏拉巴卓嘎 张燕培汪婷婷
免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定（RIA） 放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 （二）免疫放射测定（IRMA）
医学检验免疫学检验归纳 总结
三大免疫结合反应 直接凝集反应玻片凝集反应 试管凝集反应 间接凝集反应间接血凝试验 胶乳凝集试验 凝集反应 P47 明胶凝集试验 自身细胞凝集试验 抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原） 间接coombs试验（血清中的游离抗原） 液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法 抗体稀释法 方针滴定法 免疫浊度测定 沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳 交叉免疫电泳 三大标记技术 一、放射免疫：放射免疫：
免疫放射： 二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法 光 免固相抗体竞争法 疫 分固相抗原竞争法 析 类 型 荧光偏振免疫测定测定 荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析 异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法 Ag 间接法 双抗体夹心法 竞争法 捕获法 其他标记技术 化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术
固相膜免疫测定免疫试验IFA 免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA 免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱滤过法 磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法 免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法 淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：..........
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
第八章荧光免疫技术 一、A1 1、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A、光源 B、滤板 C、聚光器 D、目镜 E、物镜 2、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是 A、藻红蛋白 B、四甲基异硫氰酸罗丹明 C、四乙基罗丹明 D、异硫氰酸荧光素 E、亮绿 3、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外 A、与蛋白质分子形成离子键 B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率 C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明 D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质 E、标记方法简单，安全无毒 4、下列何种方法的灵敏度最高 A、荧光法 B、磷光法 C、分光光度法 D、比浊法 E、化学发光法 5、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法 A、ELISA B、放射免疫技术 C、直接荧光法 D、间接荧光法 E、补体法 6、免疫荧光技术的基本原理是 A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原 B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体 C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体 D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体 E、以上都不对 7、下列有关间接荧光法的叙述错误的是 A、敏感性高于直接荧光法 B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原 C、既可检测抗原，也可检测抗体
D、荧光素标记抗体是抗抗体 E、一种标记物可对多种抗原进行检测 8、荧光效率是（）。 A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率 B、指荧光色素产生荧光的强度 C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调 D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比 E、指物质产生荧光的效率 9、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是 A、提高荧光强度 B、提高荧光效率 C、可同时检测同一标本中两种抗原 D、使用一种标记物可检测多种抗原 E、减少非特异性荧光 10、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学 A、直接法 B、夹心法 C、间接法 D、补体法 E、捕获法 11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠 A、范德华力 B、氢键 C、离子键 D、共价键 E、静电引力 答案部分 一、A1 1、 【正确答案】D 【答案解析】组成荧光显微镜的结构中，只有目镜与普通光学显微镜相同。【答疑编号100029756】 2、 【正确答案】D 【答案解析】异硫氰酸荧光素呈明亮的黄绿色荧光。 【答疑编号100029751】 3、 【正确答案】A
标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，
免疫检验技术复习题（一） 一、名词解释： 1、抗原： 2、直接凝集反应： 3、免疫球蛋白： 二、填空： 1、免疫的三大功能即______、_________、______________。 2、血清中Ig含量最多的是____，含量最少的是_____，唯一能通过胎盘的是_____。 3、超敏反应分为四个类型：____、_____、_______、______。 4、酶免疫技术常用的酶为______________________和____________。 5、三大经典血清学试验方法是__________、_________、__________。 三、选择： 1、首次用于人工被动免疫的制剂是 A、破伤风抗毒素 B、破伤风类毒素 C、肉毒类毒素 D、白喉类毒素 E、白喉抗毒素 2、机体免疫防御功能过高可导致 A、严重感染 B、免疫缺陷 C、超敏反应 D、自身免疫病 E、肿瘤 3、T细胞主要位于淋巴结的 A、深皮质区 B、淋巴结 C、浅皮质区 D、髓窦 4、B细胞抗原识别受体是 A、TCR B、CR2 C、CD3 D、FCR E、mIg 5、与外毒素有相同免疫原性的物质是 A、抗毒素 B、细菌素 C、类毒素 D、抗生素 E、干扰素 6、存在于不同种属的共同抗原称为 A、同种异型抗原 B、异嗜性抗原 C、异种抗原 D、自身抗原 E、独特型抗原 7、产妇初乳中含量最多的免疫球蛋白是 A、IgG B、IgM C、SIgA D、IgE E、IgA 8、补体不具备下列哪种作用 A、溶解细胞作用B 、调理作用C 、过敏毒素作用D 、趋化作用 E、中和毒素作用 9、I型超敏反应主要是哪一类抗体介导产生的 A、IgA B、IgD C、IgE D、IgM
第八章荧光免疫技术 FluoreSCenCe ImmunoaSsay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术 的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。 二、教学内容 1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。 2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体 D．间接检测抗原或抗体 E．间接检测抗原和抗体 2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃ D．25～30℃ E．30～35℃ 3．荧光抗体保存3～4年，应选择 A．小量分装、4℃ B．瓶分装、4℃ C．瓶分装、-10℃ D．瓶分装,-20℃ E．小量分装、-20℃ 4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A．光源 B．聚光器 C．目镜 D．物镜 E．滤光片
5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型 A．直接法 B．夹心法 C．间接法 D．补体法 E．双标记法 6．荧光抗体染色标本的观察时间 A．当天 B.第二天 C．第三天 D．1周内 E．5天 7．荧光抗体闭接法应标记 A．抗原 B．抗体 C．补体 D．抗抗体 E．抗体及补体 8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是 A．直接法 B．间接法 C．双抗体夹心法 D．补体法 E．双标记法 9．荧光抗体间接法可检测 A．抗原 B．抗体 C.补体 D．蛋白质 E．抗原和抗体 lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是 A．抗原荧光染色 B．抗体荧光染色 C．补体荧光染色 D．特异性荧光染色 E．非特异性荧光染色 11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术 A．荧光偏振免疫测定 B．荧光免疫显微技术 C．时间分辨荧光免疫测定 D．底物标记荧光免疫测定 E．流式荧光免疫技术 12．临床药物浓度检测的首选方法
免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术，放射免疫技术，免疫酶技术，免疫电镜技术，免疫胶体金技术和发光免疫测定。 近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。在医学和其他生物学科的所究领域及临床检验上作中应用十分广泛。 第一节免疫荧光技术 免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)始创于40年代韧，1942年Coons等曾次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶件肺炎球菌多糖抗原，当时内于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。 一、基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以—般通称为荧光抗体技术。 二、荧光及荧光素 荧光是指—个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止：能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是—种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。目前用于标记抗体的荧
新疆农业大学 专业文献综述 题目: 免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用 姓名: 陈泽 学院: 食品科学与药学学院 专业: 食品质量与安全 班级: 食品质量与安全112班 学号: 114033207 指导教师: 王子荣职称: 教授 2014 年6 月10 日 新疆农业大学教务处制
免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用 作者：陈泽指导老师：王子荣 摘要：文章介绍了免疫标记技术的发展以及免疫标记技术在食品安全检测中的应用，包括免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫测定法、免疫胶体金技术和发光免疫测定法，并概述这些检测技术对食品安全的重要作用及影响。 关键词：免疫标记技术；食品安全；检测 免疫分析法是以抗原抗体特异性结合生成抗原抗体免疫复合物为基础，用来检测生物样品中较低含量活性物质的检测方法。此种分析方法的基础是抗原抗体反应的高度专一性和反应灵敏性。进行免疫分析的前提是获得与检测物质相对应的抗体或抗原，抗体的特异性和亲和性都是决定免疫分析能力的重要影响因素。免疫标记技术:泛指使用荧光素、放射性同位素、酶、胶体金以及化学(或生物)发光剂等作为标记物，标记的抗体或抗原和与之对应的抗原或抗体进行特异性的抗原抗体反应，最终借助各种精密的检测仪器对实验结果进行观察和测定。免疫标记技术可以为样本定性研究，或为样本定量或者半定量检测技术，也可以在细胞或者组织中进行定位研究。 一、免疫分析发展的历史 20 世纪50年代，免疫分析方法最初应用在体液中生物大分子的检测。1959年，美国学者Yalow和Bersou建立检测糖尿病患者血浆中胰岛素的免疫标记方法，巧妙地将放射性同位素125I示踪技术和传统的免疫方法相结合，使免疫分析技术从定性技术转变为定量技术，开创免疫标记的先河。1971年，瑞典学者Eugvai和Perlmauu用酶代替放射性同位素进行标记，创建了酶联免疫吸附试验（ELISA）。1982年，Neurmau在免疫分析的基础上发展了一种新型免疫分析技术——时间分辨荧光免疫测定(TRFLA)。1976年，Tsuji等基于酶与其特异性发光物质与免疫反应相结合，建立化学发光免疫测定(CLIA)。1990年，Leland建立电化学发光(ECLIA)，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫, ELIA以后的新一代标记免疫测定技术。 二、免疫荧光技术 免疫荧光技术又称荧光抗体法(fluorescent antibody technique, FAT)，是一种将结合有荧光素(异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯二嗓基氨基荧光素)的荧光抗体作为分子探针与抗原进行反应，借以提高免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。该法具有灵敏度高、特异性强的特点。 免疫荧光技术的原理是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微小踪的精确性相结合，以有荧光素作为标记物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用以检测和鉴定未知抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物以及其存在部位。 张冬青等采用膜溶解、密度梯度分离纯化结合免疫荧光技术对饮用水中的“两虫”(隐抱子虫和贾第鞭毛虫)进行定性定量分析检测，其回收率分别为56%和35%，均高于EPA 1623方法的质量控制要求。采用免疫荧光技术操作方法简便且经济，适合在国内水源检测中推广使用。有报道首次将微菌落技术同免疫荧光技术相结合，建立了微菌落免疫荧光技术(M-CIF) 。M-CIF法敏感性和重复性好，用已知沙门氏菌浓度做最低检出限量实验，常规法检出限为10个/mL，而该
医学免疫学检验考试 重点
概论+抗原抗体反应 1 免疫学基本概念及其生物学功能； 免疫：机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能 免疫三大功能：免疫防御、免疫自稳、免疫监视 中枢免疫器官（骨髓和胸腺）外周免疫器官（淋巴结、脾脏、扁桃体） 免疫细胞：淋巴细胞（T，B，NK）、单核巨噬细胞、其他免疫应答细胞（中性粒、嗜酸性、嗜碱性和肥大细胞） 免疫分子：免疫球蛋白（IgM，IgG，IgA，IgE，IgD），补体，细胞因子，细胞黏附分子，人类白细胞分化抗原 免疫应答：机体免疫系统接受抗原刺激发生的一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。过程：抗原的识别、处理、信息传递（识别阶段），免疫细胞的激活、增殖、分化（活化阶段）以及产生一系列的免疫效应因子（效应阶段）。 临床免疫学检验：研究免疫学检测理论、技术、应用，免疫疾病发病机制、免疫诊断、及防治的一门医学领域的应用学科。 免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应，免疫学技术有凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、中和反应和标记免疫反应五种类型。 免疫检验：1）利用免疫检测原理和技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞黏附分子等免疫相关物质；2）体液中的微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素。 临床免疫学：利用免疫学理论和技术研究疾病的免疫病理机制、诊断和鉴别诊断、疗效评价、预后判断和预防的多个分支学科的总称。 免疫性疾病：各种原因引起的机体免疫应答异常所致的疾病，包括超敏反应性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病和免疫增生病。 感染免疫学：研究病原微生物与宿主相互关系从而控制感染的学科，传统免疫学核心。 肿瘤免疫学：研究肿瘤免疫原性、机体抗肿瘤的免疫效应及机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系以及肿瘤免疫诊断与防治的学科。 移植免疫学：研究移植物与宿主相互关系从而选择移植物和延长移植物存活的学科。 2 血清学反应的概念； 抗体主要存在于血清中，体外的抗原抗体反应称为血清学反应。 抗原抗体反应：抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应，特异性取决于抗原表位和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，并通过静电引力、范德华引力、氢键结合力和疏水作用力等非共价键结合在一起。 3 抗原抗体的反应原理 Ag决定簇和Ab分子超变区分子间的结构互补性；分子表面特异的可逆的弱结合力；亲水胶体转化为疏水胶体 * 亲和力（affinity）是抗体分子上一个抗原结合点与对应抗原表位之间相互适应而存在的引力。这是抗原与抗体之间固有的结合力。 * 亲合力（avidity) 是指反应系统中整个抗原分子与相应抗体之间的结合能力。 亲和力与亲和性、抗体的结合价和抗原的抗原决定簇数目相关。亲和力越大，抗原抗体结合越牢固。 K=抗原抗体复合物浓度/（游离抗原浓度*游离抗体浓度） K值大的抗体与抗原牢固结合，不易解离，说明该抗体有高亲和力。 亲水胶体转化为疏水胶体：血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。 当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能，抗原抗体复合物成为疏水胶体。电解质作用下，中和胶体表面电荷，使疏水胶体靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 4 抗原抗体反应的特点。 特异性：抗原与抗体结合反应的专一性。分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性 交叉反应：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应 可逆性：解离后抗原抗体仍保持原有理化性质和生物活性。 影响因素：抗体与抗原间的亲合力，亲合力越高，结合越牢固，越不易解离；环境因素－pH、离子强度 比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系。前带(prezone)：抗体过量。后带(postzone)：抗原过量。等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适 阶段性：亲水胶体转疏水胶体的化学和物理变化过程：抗原抗体特异性结合（几秒至几分钟，不出现可见反应），非特异性促凝集（抗原-抗体复合物在适合温度pH电解质等环境因素影响下，进一步交联和聚集，出现肉眼可见沉淀、凝集、细胞溶解等反应，数分钟至数小时） 【熟悉免疫学发展简史；抗原及免疫球蛋白的定义及功能 5 抗原抗体的反应影响因素。
三大免疫结合反应 直接凝集反应玻片凝集反应 试管凝集反应 间接凝集反应间接血凝试验 胶乳凝集试验 凝集反应 P47 明胶凝集试验 自身细胞凝集试验 抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原） 间接coombs试验（血清中的游离抗原） 液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法 抗体稀释法 免疫浊度测定 沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳 交叉免疫电泳 三大标记技术 一、放射免疫：放射免疫： 免疫放射：
二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法 光 免固相抗体竞争法 疫 分固相抗原竞争法 析 类 型 荧光偏振免疫测定测定 荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析 异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法 双位点一步法 Ag 间接法 双抗体夹心法 竞争法 捕获法 其他标记技术 化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术 固相膜免疫测定免疫试验IFA 免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA
免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱滤过法 磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法 免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法 淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：.......... 吞噬细胞...............
生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 第20卷 第5期2008年10月 Vol. 20, No. 5Oct., 2008 免疫标记技术的进展及纳米技术在其中的应用 贾春平, 赵建龙* （中国科学院上海微系统与信息技术研究所，上海 200050） 摘 要：酶免疫标记、胶体金免疫标记及荧光免疫标记技术是目前应用最广泛的免疫反应检测技术。随 着科学技术, 尤其是纳米技术的发展和生物医药等方面的需求，人们在提高检测灵敏度、简化操作步骤、有效缩短检测时间等方面，取得了很多可喜的进展。本文将分别针对酶免疫标记、胶体金免疫标记及荧光免疫标记技术三方面的进展情况，尤其是纳米标记技术在免疫反应检测中的应用进展进行综述。关键词：免疫反应；酶免疫标记；荧光免疫标记；胶体金免疫标记；纳米技术中图分类号：N39；Q71；R730.49 文献标识码：A Progress of immuno-labeling assay and application of nano-technology JIA Chun-ping, ZHAO Jian-long* (Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050,China) Abstract: Enzyme immuno-labeling assay ，gold nanoparticle immuno-labeling and fluorescence immuno-labeling assay are used most widely in immunoassay. With the development of nano-technology and the demand of biomedicine, progresses were made in improving detection sensitivity, tailing detection time,simplifying procedures and so on. This is a briefly review about the progresses in enzyme immuno-labeling assay ，gold nanoparticle immuno-labeling and fluorescence immuno-labeling assay, especially the applica-tion of nano-technology in these immunoassay. Key words: immunoassay; enzyme immuno-labeling; gold nanoparticle immuno-labeling; nano-technology 文章编号 ：1004-0374(2008)04-0749-05 酶免疫标记、荧光免疫标记、放射性同位素免疫标记这三大抗体标记技术以及后来迅速发展的胶体金免疫标记技术，是指在抗体分子上分别标记酶、荧光、同位素、胶体金等既易测定, 又具有高敏感性的物质。通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原的性质与含量，是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段。这些标记技术，尤其是酶免疫及胶体金免疫标记技术，由于具有操作方便、不需要昂贵的检测仪器等独特优势，在医学临床诊断、食品安全检测、环境监测等各领域得到广泛应用；但在早期肿瘤标志物、神经性肽等微量蛋白的检测上，这些技术还缺乏足够的灵敏度，检测时间相对较长、操作步骤繁琐。针对这些问题，人们一直进行不断地探索， 收稿日期：2008-04-09；修回日期：2008-05-27基金项目：国家“863”资助项目(2006AA 03Z334)；上海市科委纳米专项资助项目(0752nm019，0652nm016)*通讯作者：E-mail: Jiachp@https://www.doczj.com/doc/dc1677914.html, 并将纳米技术应用于免疫标记及检测技术中，在提高灵敏度、特异性、简化操作步骤、有效缩短检测时间等方面，取得了很多可喜的进展。本文将分别针对酶免疫标记、胶体金免疫标记技术及荧光免疫标记检测技术等三方面的进展情况，尤其是纳米技术在免疫反应测定中的应用进展进行综述。1 酶免疫标记技术 酶免疫标记技术，即酶联免疫反应(e nz yme linked immunosorbent assay ，ELISA)，在临床实验室已得到普遍的应用，可用于检测各种肿瘤标志
免疫分析标记技术 摘要:较系统地综述了目前应用于免疫分析检测中的各种标记技术:放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记和金标记方法的原理、特点及免疫检测现状,同时对免疫分析标记技术的发展进行展望。 关键词:免疫分析,标记技术,研究进展 Abstract: Various labeled technique that have been app lied immunoassay presently was introduced, including labeled radiation, labeled enzyme, labeledlum inophor, labeled fluorescein and labeled paramagnetic-particle along with their principle characteristic and actuality of immunoassay, and their prospects were also discussed in this paper. Keywords: immunoassay; labeled technique; research progress
免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础,研究标记以各种标记物(定量信号)来对某种物质进行定性或定量检测的研究。标记免疫分析[1]一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记,这种标记物既保持了抗体或抗原的活性,也不影响标记物的活性,当它与相应抗体或抗原反应后,可以直接测定复合物中的标记物,从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用,可以提高免疫分析技术的敏感性。随着全世界对食品安全问题的关注程度越来越高,食品中污染物和危害物的检测日益重要,这就需要快速、准确、灵敏、能进行多组分分析的检测技术[2]。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点,已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。而在这一基础上,标记物的选择、研究就相应也成了免疫分析研究的重点内容。检测领域的免疫分析标记方法主要有放射物标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记、金标记外,还出现了超顺磁性粒子标记。 1 放射物标记分析 用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)是美国科学家Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法[3]。该技术利用核素标记物的放大效应,改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。 1.1 标记物种类 一般来说,RIA中标记抗原或抗体所用的放射性核素,最常用的是125?、121?、3H,3H 能放射出B射线,而125?、121?能放射出C射线,然后用C计数仪和液体闪烁计数仪测定。3H半衰期长,标记时需在特殊装置中进行,故多由放射性化学试剂中心做成药盒供应。其次B射线的检测需要昂贵的液体闪烁记数器测定,不易普及,故近来采用化学方法将被检测物和酪氨酸甲酯生成带有苯酚基的衍生物,便可用121?或125?标记。125?半衰期为60d,121?半衰期为8d,现今多趋向使用125?。 1.2标记方法 放射物标记中最常用的是外标记。碘标记的方法很多,最常用氯胺T法,氯胺T是一种氧化剂,它能使125?液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘,然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢如图1。
一、名词解释 第1章概论 1.免疫学： 2.免疫分子： 3.补体： 4.临床免疫学： 第2章抗原抗体反应 5.抗原抗体反应： 6.抗原抗体反应特异性 7.可逆性 8.比例性 9.抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence） 10.最适比（optimalratio） 11.带现象（zonephenomenon） 第3章免疫原和抗血清的制备 12.免疫原(immunogen) 13.半抗原 14.免疫佐剂 15.多克隆抗体(polyclonal antibody, pcAb) 第5章凝集反应 16.凝集反应 17.直接凝集反应 18.间接凝集反应 19.明胶凝集试验 第6章沉淀反应 免疫学及免疫学检验试卷第1页（共13页）
20.沉淀反应 21.絮状沉淀试验 22.免疫浊度测定 23.凝胶内沉淀试验 24.单项扩散试验 25.双向扩散试验 26.免疫电泳技术 27.对流免疫电泳 28.火箭免疫电泳 29.免疫电泳 30.免疫固定电泳 第19章补体检测及应用 31.补体 32.免疫溶血法 33.补体结合试验 第22章感染性疾病与感染免疫检测 34.感染 第23章超敏反应性疾病及其免疫检测 35.超敏反应 36.Ⅰ型超敏反应 37.Ⅱ型超敏反应 38.Ⅲ型超敏反应 39.Ⅳ型超敏反应 第24章自身免疫性疾病及其免疫检测 40.自身耐受 41.自身免疫 免疫学及免疫学检验试卷第2页（共8页）
42.自身免疫病 43.自身抗体 44.抗核抗体 第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测 45.免疫增殖性疾病 46.免疫球蛋白增殖病 47.本周蛋白 48.血清区带电泳 49.免疫电泳 50.免疫固定电泳 第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验 51.免疫缺陷病 52.获得性免疫缺陷综合征 第27章肿瘤免疫与免疫学检验 53.肿瘤免疫学 54.肿瘤抗原 55.肿瘤标志物 第28章移植免疫及其免疫检测 56.移植 57.主要组织相容性复合体 58.移植排斥反应 59.移植物抗宿主反应(GVHR) 60.血清学分型法 二、填空题。 免疫学及免疫学检验试卷第3页（共13页）
第八章荧光免疫技术 第一节概述 一、荧光的基本知识 1、荧光 荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。 2、发射光谱 发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度。激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。 3、激发光谱 激发光谱是指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 4、荧光效率 荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。 荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）/吸收光的光量子数（激发光强度）。 5、荧光寿命 荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。 激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质的荧光寿命不同，可利用延时测定的方法消除某些短寿命荧光的干扰，此为时间分辨荧光免疫测定的理论基础。 6、荧光淬灭 荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、Ⅰ-、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。 7、荧光偏振 P=FH-FL／FH+FL 式中：P表示偏振度,FH表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度，FL是上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度。 当P=0时，说明完全不偏振；P在-1～+1之间即为部分偏振。 二、荧光物质 （一）荧光色素 能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物称为免疫荧光色素或荧光染料。 1、异硫氰酸荧光素（FITC）黄绿色荧光为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。 2、四乙基罗丹明（RB200）橘红色荧光为橘红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。 3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）橙红色荧光最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对
免疫标记技术题库7- 1-8
问题： [单选]荧光抗体染色技术中，只制备一种标记抗体，却可检测几乎所有的抗原抗体的方法是（） A.直接法 B.间接法 C.补体结合法 D.双标记法 E.混合法 荧光抗体染色法中，间接法可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且只制备一种标记抗体，却可检测几乎所有的抗原抗体系统。
问题： [单选]在紫外光激发下，FITC所产生的荧光为（） A.灰蓝色 B.黄绿色 C.橙红色 D.橙色 E.黄色
问题： [单选]在RIA这一反应系统中，参与反应的有标记抗原，已知抗体和待测抗原，对这三种成分的要求是（） A.只需固定标记抗原量 B.待测抗原的量要先标定 C.标记抗原和已知抗体的量都是固定的 D.只需固定已知抗体的量 E.标记抗原、已知抗体、待测抗原的量均需固定 (辽宁11选5 https://www.doczj.com/doc/dc1677914.html,)
问题： [单选]目前应用最广泛的荧光素为（） A.异硫氰酸荧光素FITC B.四乙基罗丹明RB200 C.四甲基异硫氰酸罗丹明 D.镧系螯合物 E.藻红蛋白R－BE 异硫氰酸荧光素（FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感。②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。被广泛的应用于临床试验中。
问题： [单选]免疫放射测定（IRMA）与RIA的区别中，下列论述不正确的是（） A.RIA使用标记抗原，IRMA使用标记抗体 B.RIA反应速度较慢，IRMA反应速度较快 C.RIA针对多克隆抗体特异性较低，IRMA针对单克隆抗体特异性较强 D.RIA的标记物可过量，IRMA的标记物需要限量 E.IRMA为非竞争结合，RIA为竞争抑制