（1）超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上。
（2）置1%H2O2内10min至1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4）代替H2O2的。
（3）双蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室温30～60min，以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。
（5）PBS漂洗3min，洗1次（有人主张不洗）。
（6）滤纸吸干，孵育于第一抗体血清滴上，先室温预孵1h，再置于4℃24～36h。
（7）PBS漂洗3min，3次。
（8）PBS（内含1%的牛血清白蛋白）pH8.2中，5min，此步为胶体金结合作准备。
（9）胶体金标记抗体液1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液，室温孵育10min至1h。（10）双蒸水洗3min，3次。
如作双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤（2）～（10）。胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique, PAg法）
PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性，PAg复合物分子最小易于穿透组织。PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。
电镜水平的PAg染色法
PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液（pH7.4）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合，从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时，应用的PBS或TBS 的pH应变更为pH8.2。其它可参照本节中包埋后染色法进行。
液体配制：
1、胶体金稀释液配方：
（PH＝8.2）的0.02mo1／L Tris TBS缓冲液，加入试剂级卵清白蛋白至1％。｛免疫电镜按1：20-50稀释，淡红色为适宜稀释液,胶体金稀释后应于当天使用，未用完的应该丢弃。（免疫胶体金说明书）｝
2、清洗液：
0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。
0.05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH值至7.4。
0.02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至8.2。
3、 H2O2的配制:3% H2O2
4、 8％过碘酸钠水溶液
5、封闭液：
前封闭液：1%卵白蛋白—0.05mo1／LTris缓冲液（pH7.4）；
后封闭液以及胶体金稀释液：1%卵白蛋白—0.02mo1／LTris缓冲液（pH8.2），后封闭为胶体金结合作准备。
具体操作:
一、包埋：常规电镜制样，样品只需要戊二醛固定，不需要锇酸后固定。丙酮梯度脱水时70％的丙酮中没有添加染色剂。样品于37度烘箱中固化。
二、切片：
超薄切片厚50～70nm左右，载于300网孔的镍网上。
三、抗原修复：
1、置1%H2O2内10min至1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4）代替H2O2的。
（同时用8％过碘酸钠水溶液代替双氧水，室温5～25分钟以及丙酮对环氧树脂进行溶解。看三者那个效果最好）
2、双蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。(0.05mo1／L TBS pH7.4洗5min×3次?)
三、封闭以及免疫反应：
1、载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室温约1h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。
2、载网直接移至第一抗血清液滴上(抗体稀释度较常规免疫组化低l倍)，在室温孵育2h 或4℃18～24h。
3、0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。1％卵清白蛋白0.02mo1／L TBS（8.2） 37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余液体，不洗。
4、将PAg原液稀释10～20倍（1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液），载网浮于该液滴上，室温孵育10min至1h（37℃孵育2h？）。
5、0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。最后切片浸于0.05m01／L TBS pH7.4缓冲液中，送电镜室处理（含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分钟？）。
四、电子染色以及电镜观察：
1、5%醋酸铀（双蒸水配制）染5min，然后用双蒸水洗。
2、枸橼酸铀（或醋酸铅）染色5min，双蒸水洗净。
3、H－600透射电镜观察。
免疫胶体金试验成功的要求：
抗体高度特异性和亲和力以及被检组织内抗原含量高；标本的前处理和染色也至关重要。取消锇酸后固定，聚合温度不宜高于45度，可以选用37度12小时，45度48小时作为聚合温度。试验全过程应保持网面的湿润。缓冲液要清洁，最好用新鲜配制的或经微孔滤纸过滤后使用。
染色前所用器皿必须清洁干净且专用，并用双蒸水冲洗三遍，染色程序中的洗涤必须充分，以减少背景染色。尤其双重免疫标记的切片染色时，第一次金标二抗孵育后必须充分洗涤，以不影响第二次金标二抗的反应结果。摘自:贾云香,卓夏阳,顾云娣.双重胶体金标记的免疫电镜技术.江西医学院学报,2003,43(4):22-24
将免疫组织化学技术与电子显微镜技术相结合，则可以利用电子显微镜高分辨率的优点，在
超显微结构水平定位细脑内的特异性抗原。为疾病的病因、发病机理、组织来源等方面的探索研究，为提高疾病的认识与诊断提供可靠的手段。
1) 试剂配制：
(1)4％多聚甲醛一0.01％戊二醛溶液：多聚甲醛4g，0.2m01／L二甲砷酸钠缓冲液(内含0.2mol／L蔗糖，0.4mmo1／L CaCl2)50 m1，20％戊二醛40ul，双蒸水加至100m1。
(2)0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。
(3)0.05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH值至7.4。
(4)0.02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至8.2。
(5)0.5mo1／L，Triton-Tris缓冲生理盐水：Tritonx-100 l0m1;0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl 缓冲液100m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至7.4。
2)具体步骤:
(1)0.05mo1／L TBS(pH7.4)洗5min×3次。
(3)1：5正常羊血清(0.05mo1／L TBS PH7.4)37℃孵育l h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。
(4)特异性一抗(抗体稀释度较常规免疫组化低l倍)室温孵育24h。
(5)0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。
(6)0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。
(7)1：5正常羊血清(0.02mo1／L TBS pH8.2)37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。
(8)生物素化胶体金标记二抗(原液)37℃孵育2h。
(9)0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。
(10)0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。
(11)最后切片浸于o．05m01／L TBS pH7．4缓冲液中，送电镜室处理.
无DNA酶的胰RNA酶将胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl(PH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的浓度,与100度加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份－20度保存.
病毒液体的胶体金技术：
（自：傅仓生，胶体金免疫电镜技术用于烟草花叶病毒的检测，植物病理学报，VoL．24，No．4，353—355）1.3.1 外标记标本制备： (1)以带膜铜网蘸取纯化病毒悬液，PBS冲洗。
(2)在相应的抗血清中室温孵育20分钟，PBS冲洗。(3)在PAg(1：50稀释)中室温孵育20分钟，PBS冲洗。(4)1％醋酸铀负染，H500电镜观察，拍照。
内标记标本制备： (1)以感染烟草花叶病毒的普通烟叶的试料，电镜常规制样，超薄切片。
(2)在TMV抗血清中室温孵育l小时，PBS冲洗数次。(3)在PAg(1：50稀释)中室温孵育1小时，PBS冲洗数次，三蒸水冲洗数次。(4)醋酸铀一柠檬酸铅双染色，H500电镜观察，拍照。
（自：翟雷，朴晓萍，潘萍等。微生物学免疫学进展，1995，24（3）：17-19。免疫胶体金试剂的制备及应用胶体金免疫电镜技术检测戊型肝炎病毒）取样品100 ul分别于微量离心管，各加100 ul鼠抗HEV单克隆抗体(1：500一1000稀释)，混匀， 37℃温箱作用60min，双蒸水充满管，13000 rPm离心30 min，弃上清．沉淀用100 ul双蒸水悬浮，加l00ul胶体金标记免抗鼠IgG，温匀，置37℃温箱作用60 min．双蒸水充满管，13000rPm离心30min，
弃上清，沉淀用l00ul双蒸水悬浮，滴于镀膜铜网，干后3％PH7.4的PTA负染，电镜观察。（自：滴一滴NDV于铜网上，室温吸附15分钟，然后用0.1％的PBS洗5次，吸去余液；加一滴金标抗体于铜网上，37度作用20分钟，PBS洗5次，吸去余液，然后用磷钨酸负染5分钟，干燥后电镜观察。
（自：梁红，谭红英，蔡景霞等。蛋白A胶体金免疫电镜负染技术检测脊髓灰质炎病毒和SV40病毒，中华微生物和免疫学杂志，1998，9（2）：111－112）取抗原抗体各50UL在血凝板孔中37度，45分钟。加OD值为0.2胶体金50UL，37度，45分钟。取抗原抗体胶体金混和物50UL，于铜网，室温30分钟。胶体金缓冲液洗两次，双蒸水洗一次，磷钨酸负染，电镜检查。
胶体金标记实验步骤 点击次数：13 发表于：2008-08-19 14:02转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 1、蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 （1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。 （2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时，调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10. 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 2、蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定 （1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml.
（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml～50μg/m l，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 （3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 （4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。 将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，５分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置２小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。 3、标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10. 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 下述标记步骤最为常见： ①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记ＳＰＡ时调到pH6.0)。 ②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为２～３ml），搅拌２～３分钟。 ③加入5ml１％PEG20000溶液。
浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖
浙江大学2001年10月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不
免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择。样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。
免疫层析试纸包被技术简介 试纸生产 过程中一般有三种 溶液的包被处理，即 质控溶液，检测溶 液，和结合物溶液 （胶体金）。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。 在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行 C/T线的包被，是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中使用的硝酸纤维素膜有两类，一种是免疫渗滤产品用的，按孔径选择一般采用0.45um-1.2um的膜，与分子生物学中用的印迹转移膜一样。Whatman Schleicher & Schuell的膜属于纯采用100%的纯硝酸纤维素，蛋白结合能力较高。另一类即免疫层析用膜，一般按侧向流动速度来划分，常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主，也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有适当差别。 鉴于流动封闭技 术的普及，C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上，然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作，干燥后进行其 他部分的贴板组装，这种 划膜工艺可简称为划板。 但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好C/T线，然后用特定配方的溶液将膜进行浸泡封闭处理，干燥后再贴膜及其他部分材料，这种划膜工艺可简称为划膜。 在结合物溶液（胶体金）的包被上，较多的用户倾向于用气动喷头进行定量操作。在科研及研发项目中，往往喷一条线或几条线就够用了，因此在单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3--7mm，不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程中，一般建议采用成片的胶体金垫，用三维平台往复来回地间隔喷线，一次即可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条，这样的操作会效率高，适合规模生产。 在某些免疫层析试纸产品生产工艺中，层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被，要求效果均匀，如层析膜和样品垫的特定封闭处理。
大学电子显微镜室大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖
大学2001年10月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm围。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入 不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保 持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3
免疫胶体金技术影响因素分析 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸
纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均
免疫金的特性 胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。 胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。 来源：Gold 2 免疫金的制备 1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再调胶体金的pH 值。 2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。 3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。 4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。 5．轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。 6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。
胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。 1．Frens标准方法： 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。2．Slot标准方法： 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色， 4)冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的
免疫胶体金技术影响因素分析 张付贤1,2,王兴龙2 (1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062) 摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。 关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测 中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1 耗材的选择 1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标 收稿日期:2008-11-28 作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。 通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。E-mail:w ang xl-2006@https://www.doczj.com/doc/dc1343882.html, 基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。 1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2 关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。 胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作
胶体金标记的实验操作 （1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。 2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH 值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 （2）蛋白质最适用量的选择： 胶体金与标记蛋白用量之比的确定 1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。 2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml～50μg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。 将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。 （3）标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 下述标记步骤最为常见：
胶体金免疫分析技术 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA 需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验，也是用已知抗原或抗体包被NC膜，再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定，阳性时斑点呈胶体金的红色。改进之处为采用了渗滤装置，更加简便。金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。
胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 文章来源： 文章作者： 发布时间：2007-04-24 字体： [大 中 小] （一） 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl 4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由 于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA 、PHA 、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 （二） 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1．枸橼酸三钠还原法 （1）10nm 胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml ，加热煮沸30 min ，冷却至4℃，溶液呈红色。 （2）15nm 胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml ，加热煮沸 15min ～30min ，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K 2CO 30.5ml ，混匀即可。 （3）15nm 、18nm ～20nm 、30nm 或50nm 胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加热煮沸。根 据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml 、2.5ml 、1ml 或0.75ml ，继续煮沸约5min ，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm 、18～20nm 、30nm 和50nm 。 2．鞣酸—枸橼酸钠还原法 A 液：1％HAuCl 4水溶液1ml 加入79ml 双馏水中混匀。 B 液：1％枸橼酸三钠4ml ，1％鞣酸0.7ml ，0.1Mol/L K 2CO 3液0.2ml ，混合，加入双馏水至20ml 。
浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2001年10月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1- 500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金（HAuCI 4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3?16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1?0.2%的 H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12?150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径 的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g）,因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20 C）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4C保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3?16 nm胶体金 （1）取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1 %氯化金，预热至60?70C。 （2）取一50 ml烧杯，加入4 ml 1 %柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60?70C。K2CO3的作用是保持 溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3 可以省略。 （3）将上两种溶液迅速混合并充分
胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理 从定性、半定量向全定量是即时检验（POCT）技术发展的一个趋势。全定量的POCT检测技术有多种原理。本文主要介绍胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理。 一、胶体金标记的全定量免疫层析POCT试剂装置结构示意图及作用 1、吸收垫：吸收多余液体。 2、PVC底板：提供试剂封装外壳。 3、C1、C2：标准质控区。羊抗鼠抗体结合于硝酸纤维膜上。 4、T：检测区。鼠源性单克隆二抗。 5、硝酸纤维素膜：提供抗原抗体反应的固相载体。 6、胶体金垫：含胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。 7、样品吸收垫：吸收样品液体。 二、原理 该方法的免疫学原理是一个双抗体夹心法。 样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解胶体金垫中含有的胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。其次样品中待测抗原与胶体金颗粒标记的鼠源性单克隆抗体结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一鼠源性单克隆二抗。当样品层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。无显色反应则表示样品中无抗原存在。而胶体金的量反应了待测抗原的量。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的，无论携带抗原与否，均可被固定于标准的羊抗鼠抗体所捕获，形成显色反应，这种显色反应，既代表了整个反应体系是正确的，同时C1、C2区的显色反应的深浅，与检测区中被测抗原的量呈对应关系。胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。 三、讨论 全定量是POCT的发展趋势，采用两点定标法是全定量的一个重要标志，只有两点定标才有可能实现真正的全定量。
免疫胶体金标记手册 浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2０0１年1０月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nｍ的胶体金粒子，但做为免疫标记探针,其直径应在３－３0nm范围内。 在氯化金（HＡuＣl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径３~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0．1～0.２％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5－10 nｍ的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备１2～150 ｎm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备1２-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备５ nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存（０.5ｇ或1ｇ)，因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ｍl试管分装为1 ｍl保存(－2０℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷／氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存１-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一25０ ml三角瓶，加入79 ｍl双蒸水和１ ml 1％氯化金,预热至60～7０℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加 入不同用量的单宁酸及等量的２5 mＭ K2ＣＯ3。预热至６0～70℃。Ｋ2CO3的作用 是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对ｐH的影响不大，K ２ＣO3可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温１0分钟。自然冷却。