流式细胞术免疫分型基础
免疫分型组成
系别相关标志
干/祖细胞：CD34，CD38，HLA-DR，TdT
髓系：CD33，CD13，CD15，CD11b，CD14，CD64，cMPO，CD117, CD11c, CD36
红系：CD71，glyA
巨核系：CD41，CD61
B 细胞：CD10，CD19，CD20，CD22，CD23，k，λ, cCD79a,cIgM, (CD5, CD11c, CD103, CD25, FMC7)
T细胞：CD2，CD3，CD5，CD7，CD4/8，cCD3, TCR NK细胞：CD16，CD56，（CD3 -/CD56+）
浆细胞：CD138，CD38,c k，cλ
原始细胞（Blast）
早幼粒细胞（有颗粒原粒？）
髓系幼稚细胞
?幼稚细胞包括原粒、原单、原始巨核、幼单。?异常单核不能算幼稚单核，在鉴别急性粒单细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒单细胞白血病中有重要作用。
?小的异常增生巨核和微巨核不能算幼稚细胞。?在APL中，异常早幼粒也算幼稚细胞。
?原红一般不计在内，除非罕见的急性纯红细胞白血病。
髓系幼稚细胞免疫标志
?原粒、原单：CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、MPO+/-
?原始巨核:CD61、CD41a、CD9、CD36（不特异）?幼单：CD15dim、HLA-DRstr、CD64、CD11c、CD4dim、CD11b、CD33str、CD13、CD14-?APL：HLA-DR-、CD34-、CD117+、CD9+、
CD15-/+、CD33str、CD64+、CD13dim
淋系幼稚细胞
?幼稚细胞包括原始淋巴、幼稚淋巴。
表型：
?幼稚标志+泛B/T标志
?幼稚标志：CD34、TdT、B系（CD10）T系（CD1a、CD99str)
?泛B：CD19、cCD79a、CD22
?泛T：胞浆CD3、CD7、CD2、CD5
?不表达成熟标志：B系胞膜轻链；T系CD4、CD8、CD3
2008 WHO分类
?偏成熟髓系疾病
–髓系增殖性肿瘤(MPN)（包括肥大细胞增多症）
–伴有嗜酸细胞增多和PDGFRA、PDGFRB、FGFR1异常的髓系和淋系肿瘤
–MDS/MPN
–MDS
?急性髓系白血病和急性未定系列白血病
?前体淋巴肿瘤
?成熟淋巴增殖性疾病
–B细胞淋巴瘤
–T或者NK细胞淋巴瘤
–何杰金氏淋巴瘤
–免疫缺陷病
?组织细胞和树突细胞肿瘤
MPN（髓系增殖性肿瘤）?BCR-ABL1阳性慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia,CML)
?慢性中性粒细胞白血病(CNL)
?真性红细胞增多症(PV)
?原发性骨髓纤维化(PMF)
?特发性血小板增多症(ET)
?慢性嗜酸性粒细胞白血病，NOS(CEL)
?肥大细胞增多症(mastocytosis)
?髓系增殖性肿瘤，不能分类的(MPN.U)
CML加速期(Accelerated Phase,AP)
?出现下述之一考虑CML AP：
PB中嗜碱性粒细胞超过20%；（嗜碱性粒细
胞识别：位置：CD45/SSC图，原粒的左上，
表达CD9、CD123、CD203c、CD22dim）
PB或者BM中髓系幼稚细胞为10-19%
幼稚细胞克隆为非髓系。
CML急变期（Blast Phase, BP）
?表现为下述之一：
①PB中原始细胞占白细胞20%以上，BM中原始细胞占有核细胞20%以上，
②原始细胞髓外增生。
70%的病例BP是急髓变，包括中性粒、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核系、巨核系或者红系急变，或者上述组合，20-30%为淋系急变。
MDS/MPN
?CMML
?aCML, BCR-ABL1-?JMML
?MDS/MPN,U
CMML诊断标准
1、持续性PB单核细胞增多>1X109/L（>20%)
2、无Ph染色体或者BCR/ABL1基因
3、无PDGFRA或者PDGFRB重排（尤其是伴嗜酸性粒细胞增多的病例）
4、PB和BM中幼稚细胞<20%
5、至少1个髓系增生不良，如果没有或者只有轻微髓系增生不良，需要其它条件：①造血细胞中存在获得性、克隆性细胞或者分子遗传学异常，或者②单核细胞增多至少持续3个月和③排除其它所有导致单核细胞增多的原因。
急性白血病(acute leukemia)诊断标准?BM：建议用瑞氏染色，计数500个分化细胞，PB计
数200个
?如果有明显的细胞减少，可以使用棕色层（buffy
coat）涂片。
?如存在骨髓纤维化，不能涂片，如果blast表达
CD34,活检片子CD34+≥20%也可以诊断。
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)诊断标准
?BM或者PB中：髓系原始细胞≥20%，或者有髓外侵润。
?特例：
1、重现性遗传学异常，髓系幼稚细胞<20%也可以诊断。
2、骨髓有核红细胞50%以上，见鉴别诊断。
?主要标准根据BM涂片、PB涂片、BM活检。
?分类标准仅适用于化疗前。
红系前体细胞>=骨髓有核细胞的50%时的
可能诊断
MDS
幼稚细胞<骨髓中
非红系的20%
BM 中和/或PB 中幼稚细胞<20%≥50%
M6
幼稚细胞≥骨髓
中非红系的
20%BM 中和/或PB 中幼稚细胞<20%≥50%
纯红白血病粒系成分少
幼稚细胞少见
红系前体≥80%MDS 相关AML 符合MDS 相关AML 标准BM 中和/或PB 中幼稚细胞>20%≥50%诊断
其它表现PB/BM 发现
BM 中红系前体%注意：非红系的计算，红系前体、淋巴细胞、浆细胞都不计在内。
AML ，NOS 亚型：参照FAB
界限不清，出现分化标志原粒以外，有分化阶段粒细胞，POX,SBB,CE+原粒<90%，单核系<20%
M2
单核标志单核系为主，NAE+NAF 抑制单核系≥80%
M5R6明显
红系和粒系原幼+分化细胞，红系PAS 阳性
20%以上，有核红占有核细胞50%以上或者红系80%以上
M6
巨核标志
原始巨核，PAS 粗颗粒阳性
原始巨核20%以上
M7
3群细胞粒单两系原始加分化细胞，POX,CE, NAE+NAF 抑制原幼粒+成熟粒≥20%原幼单+成熟单≥20%M4干祖+全髓标志原粒为主，分化阶段少，POX,SBB ≥3%
原粒≥90%
M1干祖+全髓标志像原始淋巴，POX,SBB<3%不定M0表型形态学
髓系幼稚占非红系比例亚型
LBL/ALL定义
?定义：以局部团块为主，没有或者很少PB、BM侵润，为淋巴瘤。根据细胞成熟阶段分为成熟淋巴瘤或者淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)
?如果局部和PB/BM都有，分类比较武断，有的以25%为界，一般骨髓幼稚细胞<20%不考虑ALL，而为LBL。
淋巴肿瘤的定义
成熟度
累及范围
NHL
成熟淋巴
白血病/淋巴瘤成熟淋巴白血病/淋巴瘤
NHL
成熟
LBL ALL ALL LBL 幼稚都有BM 、
PB<20%都有BM 、PB>25%BM 、PB 髓外为主
前体B细胞白血病/淋巴瘤，
NOS
?B-ALL：以胞膜免疫球蛋白为界，不包括Burkitt。
?表型：CD19+/cCD22+/cCD79a+，但是都不特异，需要组合+高强度表达。
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤 分享 首次分享者：☆秋秋☆已被分享29次评论(0)复制链接分享转载举报一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA 和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，?多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息
近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义 1．白血病系列分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。 2．白血病系列非特异性抗原 CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。 3．白血病分化阶段抗原 T细胞抗原CD4、CD8。 B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。 4．白细胞共同抗原 CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL
免疫学分型的进展 人们识别白血病已有160多年的历史，在诊断分型上经历了五个阶段。第一阶段是肉眼观察，第二阶段是19世纪后期发明细胞染色技术，开始镜下分类诊断；第三阶段为自20世纪30年代后期相继建立起细胞化学染色技术，应用与白血病分型诊断，至20世纪80年代成 为FAB白血病分类分型的基础；第四阶段为在FAB分型细胞形态学和细胞化学的基础上应 用细胞免疫化学染色技术和细胞遗传学技术进行白血病分型诊断；第五阶段为最近十余年，应用分子生物学技术对白血病进行病理机制、诊断分型方面的深层次研究，使白血病的分类 分型诊断日臻完善，对此认识也不断深入。当前研究白血病分型趋向细胞形态学、细胞免疫学、细胞遗传学和分子生物学，简称MICM分型。但是由于白血病细胞具有异源性和异质 性的特点，用免疫学手段检测细胞表面分化抗原常有紊乱现象，而且它们尚未达到实用、普 及意义上的应用要求。因此，细胞形态学检验仍为当今最根本性的诊断手段，而理想的分类 便是以细胞形态学为基础，结合细胞免疫学、细胞遗传学和分子生物学提供的信息，或把新 技术作为临床诊断的辅助性手段，相互结合，进行综合判断，不断发现和认识每一个白血病 类型的异质性差异和临床之间的联系。因此细胞遗传学和分子生物学是当今研究探索白血病 本质极其重要的方法，对于形态学来说又是亟须充实的新学科知识。 造血细胞分化为成熟细胞过程中会出现一系列的免疫表型变化，白血病是造血细胞的 某一克隆被阻滞在某一分化阶段上并异常增殖的结果，故白血病细胞往往停滞在细胞分化的 某一抗原表达阶段，因此可以利用单克隆抗体检测相应白细胞表面抗原或胞质内的分化抗原 进行白血病类型、细胞发育阶段的鉴别，从而指导治疗，判断预后。 近来采用急性白血病的一线单抗来筛选急性髓系白血病及T、B淋巴系白血病，用二线单抗 进一步确定系内亚型。 ALL的免疫学亚型与FAB亚型之间除L3外，无相关性，有报道78%的B-ALL为L3型。 急淋免疫学分型不同，临床表现及预后有差异。 急性白血病免疫诊断标志 一线单抗二线单抗 髓系CD13、CD117 CD33、CD14、CD15、CD11、CD61 Anti-MPO CD41、CD42、血型糖蛋白A B淋巴系CD22浆、CD19、CD10、CD79a浆CD20、CD24、Cyμ、Smlg T淋巴系CD3浆、CD7、CD2 CD1、CD4、CD5、CD8 非系列特异性TdT核、HLA-DR CD34 筛选急性白血病的免疫标记 CD10 CD19 CD22c/m* TdT HLA-DR CD3c/m CD7 CD13 CD17 MPO B系-ALL + + +/—+ + —————T系-ALL ———+ —+/—+ ———AML ————+ ——+ + + 1.ALL免疫分型急性淋巴细胞白血病的免疫分型可分成三个阶段：1986年以前的五分法，1986~1994年的两大类七分法，1994年法国召开了国际白血病欧洲免疫学分型协作组（EGIL）提四型21类法。目前较常用将ALL分为T细胞系{占20%}和B细胞系（80%） 两大型，T细胞系ALL又分为两亚型：早T前体-ALL和T细胞ALL；也有将T-cell-ALL 分为三个亚型：I型幼稚胸腺细胞型、II型中间胸腺细胞型、III型成熟胸腺细胞型；B细胞
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
一、流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述 近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流 式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列 及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、 表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分 化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进 一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的， 对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标 记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴 别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义 1．白血病系列分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。 2．白血病系列非特异性抗原 CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而 言，干/祖细胞CD34＋、HLA－D R＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼 稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－D R－、CD38＋。 3．白血病分化阶段抗原 T细胞抗原CD4、CD8。 B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
免疫细胞分型常见标志物大串烧（一）——T细胞分型标志物 免疫分型（immunophenotyping）是指根据存在于细胞表面、核或细胞质中的标记物或抗原的类型，利用基于抗体的对异质细胞群进行分析，以鉴定多种目标细胞群的存在及比例。通过使用特异性识别不同细胞类型标记物或抗原的抗体，从而帮助鉴定细胞的谱系。例如肿瘤标志物的检测、浸润免疫细胞的分析、白血病的诊断等。免疫分型可以利用组织切片(新鲜或固定组织)通过免疫组化方法以及利用细胞悬液通过流式细胞术进行分析。 流式细胞术可以说是用于探测人类免疫表型的首选技术，特别是由于它可以在诸如血液的复杂混合物中通过测量许多单个细胞上的多个参数，从而鉴定和分析包括稀有亚群在内的许多细胞亚群。并且由于可用的抗体试剂的扩大和实验方案的不断调整，流式细胞术不仅可用于评估细胞表面蛋白的表达，还可以用于评估胞内蛋白的表达或修饰水平以及细胞因子的水平。 使用细胞表面标记的特定组合对免疫细胞亚群进行定义是一个不断发展的过程，特别是那些高频研究的细胞类型。这些类型包括调节性T细胞(Treg)、分泌IL-17的T辅助细胞(Th17)、树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)。尽管新标记的发现和新的细胞子集将在未来一段时间内持续下去，然而，我们还是希望细胞免疫学领域具有足够的成熟程度，以达到对大多数共同研究的免疫细胞亚群的定义达成共识。换句话说，应当能够定义一种相对稳定的标记集合，其描绘T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和DC细胞等主要类型。因此，我们通过总结文献确定各个细胞类型的关键分化标记，并且总结目前用于人体免疫监测的标准化免疫表型分型组合。 T细胞 T淋巴细胞可在CD3表达的基础上被免疫表型化，随后进一步细分(如CD8+杀伤性T细胞和CD4+辅助性T细胞)。此外，T细胞表型是灵活的，可以随不同的微环境发生变化；表
流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限
流式细胞术免疫分型基础
免疫分型组成
系别相关标志 干/祖细胞：CD34，CD38，HLA-DR，TdT 髓系：CD33，CD13，CD15，CD11b，CD14，CD64，cMPO，CD117, CD11c, CD36 红系：CD71，glyA 巨核系：CD41，CD61 B 细胞：CD10，CD19，CD20，CD22，CD23，k，λ, cCD79a,cIgM, (CD5, CD11c, CD103, CD25, FMC7) T细胞：CD2，CD3，CD5，CD7，CD4/8，cCD3, TCR NK细胞：CD16，CD56，（CD3 -/CD56+） 浆细胞：CD138，CD38,c k，cλ
原始细胞（Blast） 早幼粒细胞（有颗粒原粒？）
髓系幼稚细胞 ?幼稚细胞包括原粒、原单、原始巨核、幼单。?异常单核不能算幼稚单核，在鉴别急性粒单细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒单细胞白血病中有重要作用。 ?小的异常增生巨核和微巨核不能算幼稚细胞。?在APL中，异常早幼粒也算幼稚细胞。 ?原红一般不计在内，除非罕见的急性纯红细胞白血病。
髓系幼稚细胞免疫标志 ?原粒、原单：CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、MPO+/- ?原始巨核:CD61、CD41a、CD9、CD36（不特异）?幼单：CD15dim、HLA-DRstr、CD64、CD11c、CD4dim、CD11b、CD33str、CD13、CD14-?APL：HLA-DR-、CD34-、CD117+、CD9+、 CD15-/+、CD33str、CD64+、CD13dim
利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； 于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1 （propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。
流式细胞仪在白血病免疫分型诊断 一、概述 近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义
查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液（配制方法见附录）； l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统