流式细胞术简介
一、流式细胞术发展简史
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；
②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。
现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。
流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。
近20年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FCM的应用领域和使用效果。
二、流式细胞计的基本结构和工作原理
流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在
液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节分辨率为零。国外又把流式细胞计称作荧光激活细胞分选器（Flu－orescence Activated Cell Sorter, FACS）。美国Becton-Dickinson 公司生产的流式细胞计系列均冠以FACS字头。目前我国国内使用的仪器多为美国、西欧及日本等国的产品，国内有些单位也已研制成功，但尚无定型产品面市。
1．流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
（1）流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
（2）激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
（3）光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另
一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
（4）计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。
2．流式细胞计的工作原理下面分别简要介绍流式细胞计有关的参数测量、样品分选及数据处理等工作原理。
（1）参数测量原理：流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0。角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90。角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
（2）样品分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分
选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。
稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。
（3）数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。
①数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图（histogram）、二维点图（dot plot）、二维等高图（contour ）、假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对数标度，用"道数"（Channel No .）来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。
二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在（图10-3）。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。
二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即"等高"。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。
假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐座标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察"山峰"和"谷地"的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。图10-5为假三维图的示意图。
列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用List Mode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，"一调二"就是在一维图上调出二维图来；"二调一"就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。
上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。
②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得
到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。
逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。
逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到"差结果曲线"往往是适宜的。
因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。
3．流式细胞计的技术参数为了表征仪器性能，往往根据使用目的和要求而提出几个技术参数或指标来定量说明。对于流式细胞计常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。
（1）荧光分辨率：强度一定的荧光在测量时是在一定道址上的一个正态分布的峰，荧光分辨率是指两相邻的峰可分辨的最小间隔。通常用变异系数（C.V值）来表示。C.V的定义式为：
C.V=σ/μ
式中，σ为标准偏差，μ是平均值。
在实际应用中，我们使用挖关系式σ=0.423FWHM；其中FWHM为峰在峰高一半处的峰宽值。目前仪器的荧光分辨率均优于2.0%。
（2）荧光灵敏度：反映仪器所能探测的最小荧光光强的大小。一般用荧光微球上所标可测出的FITC（fluorescein isothiocyanate 异硫氰基荧光素）的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。
（3）分析速度/分选速度：仪器每秒种可分析/分选的数目。一般分析速度为5000～10000；分选速度掌握在1000以下。
（4）样品浓度：主要给出仪器工作时样品浓度的适用范围。一般在105～107细胞/ml 的数量级。
其它技术参数尚多，不再一一介绍。
4．流式细胞计的调试和使用古语说："工欲善其事，必先利其器"。要想很好地应用流式细胞分析和分选技术，必需先对仪器进行调试，使其处于良好的工作状态，并能正确使用仪器。下面简要介绍细胞计的调试项目及要点、使用的程序等等。
（1）调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。
激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。
液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节气体压力大小以获得稳定的液流速度。
测量区光路调节：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90。散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。
流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标
定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。Flow Cytometry Stands 公司可提供荧光强度药盒，在免疫实验中可用来作为定量荧光标准来测定每个细胞所标记的抗原位点数目。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血（抗凝剂：鸡血=1：4），经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。
（2）仪器的操作和使用：
①打开电源，对系统进行预热；
②打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；
③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；
④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0。和90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；
⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；
⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；
⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；
⑧将所需结果打印出来。
在操作和使用中一定要注意如下事项：
1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的"暗适应"以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；
2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；
3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；
4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；
5）特别强度每次测量都需要对照组。
本节着重介绍了流式细胞计的基本结构和工作原理、技术指标及使用操作中的基本问题。由于实际使用的仪器厂家、型号差别很大，不能一一介绍，可参照仪器使用说明书使用。
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤 分享 首次分享者：☆秋秋☆已被分享29次评论(0)复制链接分享转载举报一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA 和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，?多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项) 2014-07-07 00:26:14来源：https://www.doczj.com/doc/d23220556.html,评论：0我要评论 [流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。[关键词:流式细胞仪注意事项]… ??一、流式细胞仪的检测范围 1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。 2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。 二、流式细胞仪的临床应用 1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡； 2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测； 3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。 三、流式细胞仪的科研应用 主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。 四、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一) 直接免疫荧光标记法 取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二) 间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液（约1X106细胞/ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 五、质量控制和注意事项 流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。
样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL
第十七章流式细胞仪分析技术及应用 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。 第一节概述 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析，带分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。 一、工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。 散射光的测定 散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。流式细胞仪中涉及的散射光信号分为前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）。 （一）前向散射光激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度（0.5°～10°）向前方散射讯号。在激光束正前方的检测器为前向散射光检测器，其收集的散射光信号又称为小角散射，对同一个细胞群体，FS信号的强弱与细胞的体积成正比，因此可以说FS是用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性。 （二）侧向散射光激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号。与激光束垂直方向的检测器为侧向光检测器，也称为90°散射光检测器。其收集的散射光信号主要由细胞的致密性及粒度折射产生，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细胞内超微结构和颗粒性质的参数。 二、荧光测量 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不相同。每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又产生特定波长荧光。通过一些波长选择通透性滤光片，可将不同波长的散射光、荧光信号区分开。选择不同的单克隆抗体及荧光染料可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特征。 三、细胞分选 1.分选速度：至少达5000个/秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。 2.分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。该得率与分选的速度密切相关，当分选速度过高，会使部分目的细胞漏检，使得率下降；分选速度降低，目的细胞信号被检时间增加，得率增加。 分选纯度：与仪器的精密度直接相关，同时与被分选细胞与细胞悬液中其他细胞有无相互重叠的生物学特性密切相关。 分选收获率：是指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。收获率的高低同样与被分选细胞和不选细胞间的生物学特性是否重叠有一定关系。收获率与纯度之问有相对应关系。当被要求分选的细胞纯度高，收获率相对低，当被要求分选的细胞收获率高，其纯度就相对降低。
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
一、流式细胞术常规项目操作流程 二、样本采集和处理
些？荧光染色的两种方法意义和注意事项是什么？ 三、免疫荧光染色
3．单克隆抗体的质量控制 IVD抗体和ASR试剂，是临床常规项目的首选抗体，性能参数符合临床常规检测要求，已经对两种抗体的特异性、灵敏度、精密度、适用范围进行了验证。 对于商品化质控物可以帮助监测部分单抗的检测效率，如淋系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数、细胞绝对荧光强度、阳性表达、可以作为CD55和CD59抗体的阳性对照和室内质控物。 对于自做阳性或阴性质控物，监测单克隆抗体的质量。因为有些抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，如健康人红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59，在正常人中是阳性表达，可作为阳性对照和室内质控物。 （二）荧光染色方法 1．细胞膜免疫荧光染色 大多数免疫表型分析是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液的目的，保证细胞膜表面抗原活性不被破坏；防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰。注意事项：红细胞裂解或分离后至少洗涤1次；减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰；进行绝对计数抗原表达量时，不能洗涤红细胞裂解液，因不能改变初始细胞浓度。 2．细胞内免疫荧光染色 细胞内免疫荧光染色是采用荧光素或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法。他的意义在于诊断疾病和判断预后；细胞内髓性过氧化物酶（MPO）、CD3和CD79a的表达帮助白血病免疫分型。细胞内染色的关键之处，是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性；细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记；确保固定和透膜的步骤不影响抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合。 细胞内免疫荧光染色的破膜剂有皂角素和70％冷乙醇，皂角素最常用最稳定。70％冷乙醇用于PI与细胞内DNA结合分析细胞倍体和周期时相。需要注意的是，细胞内染色与细胞活性检测不能同时进行；当荧光染料分子的颗粒足够小时，细胞内染色不需要破膜也可以进行，活细胞染料DAPI、TO和AO等对细胞内核酸染色。 （三）免疫荧光染色的注意事项 1．免疫荧光染色制备样本的保存 避光保存，避光的目的是避免荧光淬灭，整个荧光染色过程和流式细胞仪测定前都要避光。染色完成后标本保存在4oC下，并且尽快在4小时内完成测定。不能在短时间内测定的保存在终浓度为1％多聚甲醛溶液，但最多保存至72小时。 2．对照设置 对照设置分为两类，一，用于设定流式细胞仪的检测阈值，有同型对照、空白对照和正常对照。二，用于监测抗体和试剂的质量及整个实验过程，类似于质控品，有阳性对照、阴性对照和正常对照。 （1）同型对照 同型对照理论上是理想的对照，用来监测细胞自发荧光和抗体的非特异结合，实际使用时与测试抗体
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
第十七章流式细胞仪分析技术及应用 第一节概述 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成 一、工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。 标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态单细胞液柱，液柱与水平方向的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中因细胞大小和胞内颗粒多少的不同会被激发而产生不同的散射光 一台好的流式细胞仪每秒可测量15000个细胞，测定1000个荧光染料分子的粒子。 二、散射光的测定 （一）前向散射光激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度（0.5°～10°）向前方散射讯号。FS 信号的强弱与细胞的体积成正比，因此可以说FS是用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性。 （二）侧向散射光激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号。SS信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性。 三、荧光测量 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不相同。每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又产生特定波长荧光。通过一些波长选择通透性滤光片，可将不同波长的散射光、荧光信号区分开。选择不同的单克隆抗体及荧光染料可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特征。 （一）荧光信号测量与放大器 线性放大器用于测量信号强度变化范围较小的信号或具有生物学线性过程的信号，如前向散射光的测量与CD3+细胞DNA指数的测量。 对数放大器用于测量信号强度变化范围较大且其光谱信号较复杂的信号，在免疫测量中最常使用。 （二）荧光补偿 依靠滤光片是不能完全阻挡干扰信号，在每两种荧光的发射光信号中仍有不可避免的重叠现象。该重叠区越大，信号检测的准确性越差。通常采用荧光补偿的方法来消除重叠信号，保证检测信号的准确性。 四、细胞分选原理 （一）分选的基本原理 当细胞悬液形成液流柱流经流动室，由于振动形成液滴。被设定了分选参数的细胞的会被充电而带有电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场时，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。 1.分选速度：至少达5000个/秒左右。 2.分选纯度与仪器的精密度直接相关，同时与被分选细胞与细胞悬液中其他细胞有无相互重叠的生物学特性密切相关。 3.分选收获率是指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。收获率的高低与被分选细胞和不选细胞间的生物学特性是否重叠有关。当被要求分选的细胞纯度高，收获率相对低。 4.分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。
流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。
检测究竟是如何进行的呢？ 一、细胞凋亡检测的意义和方法
正常细胞的周期时相 细胞凋亡和周期 上图为流式测定细胞凋亡图，通过PI染色来测定细胞含量。正常的细胞的周期为第一张图中所示的G1、G0期，S期、G2/M期，那么在G1、0期前面没有亚二倍体峰，也就是M1这个位置它的含量会很低。这是一个正常细胞的周期时相，当这个细胞发生凋亡之后，在G1G0期的前面出现了一个亚二倍体峰，我们也把它叫做凋亡峰，M1这个位置细胞数百分率明显增多，相对其他的时相，G1G0、S期和G2/M期的含量就会相对减少。 （3）获取参数 通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数：凋亡细胞的百分率，和细胞周期当中其它时相的百分率。 （4）方法学评价 DNA含量分析方法比较简便，而且经济，在临床上用的比较多，而且标本制备也比较容易，但是它有它的缺点：只有当凋亡细胞达到一定浓度的时候才能够检测出亡峰来。所以在早期凋亡的时候采用DNA含量分析可能是不合适的，因为可能检测不出凋亡峰，含量太少。所以比较适合的是中晚期凋亡的检测。另外DNA含量分析也无法获取一些信息，也就是这个凋亡到底是S期还是G2/M期，有的时候无法反应这个情况。 2.Caspase-3活性的检测 （1）原理 检测原理主要是由于半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族，也叫做Caspases-3的家族有一种酶：是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。 该酶的活性被激活之后，就在整个凋亡过程当中不断地升高，直到凋亡的晚期酶的活性才能够迅速下降。因此，对Caspase-3酶的连续检测可以动态地观察凋亡的整个过程。 （2）检测试剂 通常检测此酶的活性的试剂包括一个荧光底物，其中它的荧光基团被激活的Caspase-3切断后可以释放荧光物质，在380nm的紫外波长下发出450nm波长的荧光，这样就可以用流式细胞仪来检测。我们通常通过对荧光强度的检测来测定出Caspase-3的活性并进行定量分析。但是由于它是紫外激发的检测方式，因此对于没有紫外光的流式细胞仪是无法来获取Caspase-3的活性检测信息。
流式细胞术及其应用 作者：贾宇臣 第一部分流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点
FACSCalibur 临床型（台式机） 特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢，主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa 科研型（大型机） 特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria 科研型 特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析 流式细胞仪检测范围
临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 -光学系统 激光光源 光收集系统 -液流系统 流动室 液流驱动系统 -电子系统 光电转换 数据处理系统 -细胞分选系统 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； 于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1 （propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。
流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。在液流系统中，可快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集，进而进行定量分析和检测。检测包括：快速测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。流式细胞术目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞，因其具有速度快、精度高、准确性好的优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液、可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。 流式细胞术的应用范围：1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2.能准确地进行DNA倍体分析；3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4.快速进行细胞分选和细胞收集；5.医学应用:免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析，流式细胞术与分子生物学研究；6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。 [相关例题] 1.流式细胞仪可根据细胞中DNA含量的不同对细胞分别计数。研究者用某抗癌物处理体外培养的癌细胞。24小时后用流式细胞仪检测，结果如图。对检测结果的分析不正确的是（） A、b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍 B、a峰和b峰之间的细胞正进行DNA复制 C、处于分裂期的细胞均被计数在a峰中 D、此抗癌药物抑制了癌细胞DNA的复制 【答案】C 2.（10分）胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率都较高。Akt是一种蛋白激酶，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。科研人员研究了Akt抑制剂对人胃癌细胞细胞周期的影响。 （1）环境中的致癌因子使细胞中发生突变，导致正常细胞变成癌细胞。由于癌细胞膜上的等物质减少，使癌细胞容易在体内转移。
如何看流式细胞术结果中的图 FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。 Q1：坐标轴的意义？ 1、单参数直方图 每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！
2、二维图 在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。 Q2：“Gate”和“Regin”？ 设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。
On-line gating(threshold gating)监测/获取数据 Off-line gating：分析实验数据散射光设门/荧光设 门散射光/荧光联合设门多重逻辑门(组合门) 多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2) 其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2 Q3:流式图中的颜色与荧光颜色? 流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为指定, 与荧光颜色无关!! Q4：流式图中的阴/阳（N/P）如何划分? 如何做M1阴性界限？实际上，这个M1的划分完全是根据阴性(同型)对照来的！如下图：左图为同型对照，即：您所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。右图即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。