第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 2、汗腺，大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对，鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对。 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中，由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一.脊柱大鼠的脊柱由57 —61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎& 荐锥 4、尾锥27 —31块。锥式C7T13L6S4Cy27—31。骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块，全无肋骨相连，横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎13块，椎骨的长度由前向后逐渐增加（由2毫米增加到4毫米），锥管的直径平均为3.3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 3、腰椎6块，每块锥体的长度比较一致，约 6 —7毫米。锥管直径由前面的 4 毫米向后逐渐缩小至2毫米。 二、胸骨 共分为6节，最前一节为胸骨柄，第二到第五节称为胸骨体，最后一节为剑突，棒状的剑突后面接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统（省略） 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管
、口腔1、舌全长约30毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米，食管外径约2毫米。 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置：横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的0.5% ,属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃。胃大弯朝向腹后方，其边缘 有双层的口袋状大网膜。贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺。 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米。 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧。可分为降支（向右后行）、横支（水平部）、升支（向前行），它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有700—1000毫米。 位置形态：盘旋在腹腔的右方腹侧部。 3、回肠 长度：较短，约有40毫米。 位置形态：以三角形的系膜回盲褶与盲肠的末端相连，向盲肠的开口与结肠的起始部紧密相接。 二、大肠 1、盲肠 长度：是介于小肠与盲肠之间的一个大的盲囊。长约60毫米，直径约10毫米。位置：通常位于腹腔的左后部。盲肠呈锥体形，分为基部、体部和尖端。 2、结肠 长度：长约100毫米。
APJ拮抗剂Apelinl3 ( F13A)对肝纤维化大鼠肝脏 Beclin 1. LC3和p62表达的影响 刘明;曾斌;肖婷筑王珊;姚梦娜 【期刊名称】《医学信息》 【年(卷)，期】2015(000)025 【摘要】目的观察血管紧张素受体ATI相关的受体蛋白(APJ)拮抗剂Apelinl3(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62表达的影响。方法30只雄性SD大鼠随机分为对照组、肝纤维化模型组和Apelinl3(F13A)(100pg/kg)处理组。采用四氯化碳(CCI4)诱导大鼠肝纤维化模型。Apelinl3(F13A)通过腹腔注射给药。取肝左叶同一部位,苏木精-伊红(HE) 染色观察肝脏的病理形态学变化。Western blot检测肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62的表达。结果对照组大鼠肝脏的肝小叶结构完整，肝索排列整齐,结构完整,肝细胞排列整齐，没有发现明显的胶原纤维增生，纤维化程度分级为0级；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏严重,肝细胞排列紊乱,汇管区发现明显的坏死细胞和炎性细胞，可见大量胶原纤维增生,形成纤维纵隔，纤维化程度分级为多为3-4级；与模型组比较,Apelinl3(F13A)组大鼠肝脏组织肝细胞变性和坏死明显减少，纤维化程度明显减轻,纤维化程度分级多为1-2级。与对照组t出交，肝纤维化大鼠Beclin 1和LC3的表达显著增加，而p62的表达显著降低(均＜0.05)。与肝纤维化模型组大鼠比较，Apelinl3(F13A)降低了Beclin 1和LC3的表达,而增加了p62的表达(均＜ 0.05)。结论APJ拮抗剂Apelinl3(F13A)抑制了CCI4诱导的大鼠肝纤维化，其机制可能与Apelinl3(F13A)抑制细胞自噬有关。
肝纤维化指标正常值 肝纤维化指标正常值，指的是对肝脏进行纤维化程度检查时，所参考的几个有意义的项目的正常范围。 具体来说，肝纤维化指标正常值就是：PCⅢ(即III型前胶原)的正常值、IV-C(即IV型胶原)的正常值、LN(即层粘连蛋白)的正常值、HA(即透明质酸酶)的正常值、CG (即甘胆酸)的正常值、PLD (即脯氨酸肽酶)的正常值、MAO (即单胺氧化酶)的正常值、PINP (即Ⅰ型前胶原氨端肽原)的正常值。 肝纤维化指标是对肝纤维化程度的一个评估标准。及早发现肝纤维化指标和正常值存在偏差，及早展开治疗，有利于遏制肝纤维化向更坏的趋势发展。因此，肝纤维化指标正常值相当重要。 想要得到肝纤维化指标正常值的准确数据，需要在检查前注意以下事项。 首先，检查前不能进食。肝脏抽血检查要求空腹，空腹时间一般为8—12个小时。 其次，检查前一天不能喝酒。喝酒会导致转氨酶升高，从而影响检查结果。 再次，检查前不要服用药物。有些药物会加重肝脏负担，造成肝功能暂时性损伤，从而引起肝纤维化指标检查结果的准确性。
第四，检查前要注意保证充足的睡眠，且不要进行剧烈运动。因为这些都有可能影响检查结果的准确性。 最后，接受肝穿刺活检时，一定要经过患者的同意。 在接受完静脉抽血后，就可以得到检查者的肝纤维化指标数据了。将这一数据和肝纤维化指标正常值相对比，就可以判断肝脏内的肝纤维化水平处于哪一阶段，以及是否需要治疗了。 肝纤维化指标正常值 指标具体项目正常值 PCⅢIII型前胶原低于18ng/mL IV-C IV型胶原30—140ng/mL之间 LN 层粘连蛋白50—180ng/mL之间 HA 透明质酸酶低于120ng/mL PLD 脯肽酶1107±19.5u/L之间 MAO 单胺氧化酶 3.3—15.1nmol/(s·L)之间有纤维化指标正常值，就有异常情况。肝纤维化指标的异常结果，主要有： PCⅢ超出纤维化指标正常值，连续上升，提示病情可能有恶化并向肝硬变发展。 IV-C超出纤维化指标正常值，能反映肝纤维化的程度逐渐加重。 LN水平超出纤维化指标正常值，数值越高，患者的食管
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1．75%乙醇50分钟 2．85%乙醇50分钟 3．95%乙醇（I）30分钟 4．95%乙醇（II）30分钟 5．100%乙醇（I）30分钟 6．100%乙醇（II）30分钟 7 1/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 8．二甲苯（I）20分钟 9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织 块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。 （三）浸蜡、包埋与修蜡块 1．浸蜡：
将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将 组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。 2．包埋： 将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺 序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部 要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3．修蜡块： 待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘 之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。
水飞蓟素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维 化作用 研究背景肝纤维化是由多种慢性肝病引起的肝脏炎症和修复失调所导致的,如病毒感染、毒物损伤、代谢紊乱和酒精滥用等,其特征是细胞外基质(extracellular matrix.ECM)过度沉积。肝脏中的纤维沉积,尤其是I型胶原, 可以保护肝细胞免受各种毒性刺激。 然而,过度的纤维沉积和调节失调会导致肝脏结构破坏、肝功能衰竭和肝硬化。到目前为止,临床上还没有有效的治疗肝纤维化的药物。 为寻找更好的治疗靶点,近年来对肝纤维化的病理生理机制进行了深入研究。大量的研究表明,固有免疫,特别是巨噬细胞在肝纤维化中起着关键作用。 肝巨噬细胞可通过多种途径促进肝纤维化,如释放促炎症因子,如肿瘤坏死 因子(TNF)-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6,诱导肝细胞坏死,促纤维化细胞因子,如转化生长因子(TGF)-β1直接激活肝星状细胞(HSC)。肝脏中巨噬细胞的来源主要有两种:一种是来源于胚胎祖细胞的存活时间长、自我更新的常驻库弗细胞(KF)。 在稳定状态下,肝脏中巨噬细胞数量的平衡主要依赖于KFs细胞的自我更新和增殖。另一种是在病理状态下从骨髓和外周血中迁移而来的单核细胞。 肝脏损伤后,外周血中的单核细胞大量趋化进入肝脏,并被活化成为巨噬细胞,释放促炎症因子和促纤维化因子,加剧了肝损伤和纤维化。这些发现表明抑制单核细胞浸润可能是治疗肝纤维化的一个新靶点。 进一步的研究发现,单核细胞主要根据细胞表面分子Ly6C分为两大亚群:经典单核细胞(Ly6Chi单核细胞)和非经典单核细胞(Ly6C]o单核细胞)。经典的单
核细胞表达高水平的CCR2和Ly6C,并表达低水平的CX3CR1,具有促炎症和促纤维化作用。 而非经典的单核细胞表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2和Ly6C,具有抗炎和抗纤维化作用。Ly6Chi单核细胞高表达的CCR2受体可与急慢性肝病时升高的趋化蛋白1(MCP-1)结合,导致Ly6Chi单核细胞向肝脏的趋化。 与野生小鼠相比,MCP-1-/-和CCR2-/-小鼠在毒性(四氯化碳,CCL4)和代谢(methionine choline-deficient)两种肝纤维化模型中显示较少的肝纤维化。药理抑制MCP-1的小鼠也出现类似现象。 因此,通过MCP-1/CCR2轴减少单核细胞浸润已成为肝纤维化治疗的重要靶点。水飞蓟是菊科药用植物。 水飞蓟素是一种含有水飞蓟全部药用成分的化合物,主要含有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭。水飞蓟素作为一种传统的保护肝的药物,具有特殊的疗效和极低的毒性,广泛应用于肝病的治疗。 许多临床和动物研究已经证实水飞蓟素具有保护肝细胞和抗肝纤维化的作用,但潜在机制仍然模糊不清。因此,本研究旨在研究水飞蓟素是否可以通过抑制Ly6Chi单核细胞的浸润而减轻四氯化碳诱导的肝纤维化。 以此来揭示水飞蓟素的保肝和抗肝纤维化的作用机理,为临床上更好的应用水飞蓟素提供充足的理论支持,且为今后治疗肝纤维化疾病提供新方向。研究方法本论文分为理论研究和实验研究两部分。 第一部分总结了中西医对肝纤维化的研究进展。第二部分研究了水飞蓟素抗纤维化的作用机制。 在理论研究部分,完整的叙述了中医先贤对肝纤维化病因病机、辨证和治疗
收稿日期:2011-05-18 基金项目:国家自然科学基金(30760230) 作者简介:邵佳亮(1980-),男,硕士,住院医师,主要从事肝纤维化的研究。 通信作者:胡国信,副教授,E -mail:hug uo x in8228@sina.co m 。 四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究 邵佳亮,万赞燕,胡国信 (南昌大学第一附属医院感染科,南昌330006) 摘要:目的 构建肝纤维化大鼠模型,并对经典四氯化碳(CCl 4)复制模型方法进行适当改进。方法 取Sprague -Daw ley(SD)大鼠40只,雌雄各半,按随机数字表法分为A 组10只、B 组14只和C 组16只。B 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液2mL kg -1,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养(改良方法);A 组为正常对照组,给予等量花生油腹腔注射,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养;C 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液5mL kg -1,2次 周-1,同时给予添加10%猪油及2%胆固醇的饲料喂养(经典方法)。实验第8周末处死各组剩余大鼠:采用酶联免疫吸附法检测血清肝功能(A L T 、AST 、A L B 、T P 、A/G)水平;H E 及M asson 染色观察大鼠肝组织病理学变化。结果 实验第8周B 、C 组均可见明显肝功能损害表现。B 组可见部分标本肝脏假小叶形成,达到早期肝硬化,肝细胞少量脂肪变性,死亡率28.6%。C 组均已形成明显肝硬化,弥漫性肝细胞脂肪变性,死亡率43.7%。结论 低剂量CCl 4诱导并给予普通饲料喂养可成功建立大鼠肝纤维化模型,并明显降低大鼠死亡率,提高了模型质量及实验效率。 关键词:四氯化碳;肝纤维化模型;改良;动物,实验;大鼠 中图分类号:R-332 文献标志码:A 文章编号:1000-2294(2011)07-0040-03 Improved Rat Model of Liver Fibrosis induced by CCl 4 SHAO Jia -liang,WAN Zan -yan,HU Guo -xin (Dep ar tment of I nf ectious Diseases ,the First A f f iliated H osp ital of N anchang Univ ersity , N anchang 330006,China) ABSTRACT:Objective To establish a rat m odel of liver fibrosis,and to improv e the classical CCl 4induction method.Methods Forty SD r ats (20female and 20male)w ere r ando mly divided into three gro ups.Gro up B (n =14)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of 40%CCl 4solution (a mix ture of CCl 4and peanut oil)tw ice a w eek and the feeding of no rmal complete diet.Gro up A (n =10)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of peanut oil tw ice a w eek and the feeding of nor mal com plete diet.Gro up C (n =16)w as given intr aper ito neal injec -tion of 5mL kg -1of 40%CCl 4solution tw ice a w eek and the feeding of diet containing 10%lar d and 2%cholesterol.Rats w ere killed at the end of 8w eeks,and the levels o f ser um ALT ,AST ,Alb,T P and A/G w ere determined by ELISA.The patho logical changes in liver tissue w ere ob -served by H E and M asso n staining.Results Liv er function w as damag ed apparently by CCl 4in -jectio n.Some specimens in g roup B pro duced false flo cculus and achieved the ear ly stage of liver fibro sis,w ith fatty deg ener ation in a few liver cells.A ll specimens in gr oup C had cirrhosis w ith diffuse hepatic steato sis.The m ortality w as 28.6%and 43.7%in gro up B and g roup C,respec -tively.Conclusion Liv er fibrosis can be induced by injection o f low do ses of CCl 4and feeding of norm al co mplete diet in rats.In addition,the improved m ethod can reduce the mortality and im -40南昌大学学报(医学版)2011年第51卷第7期 Jou rnal of Nanch ang University(M edical Science)2011,Vol.51No.7
肝纤维化的诊断指标及联合测定的临床意义 大部分的慢性肝脏损伤都会引起肝纤维化和肝硬化，治疗终末期肝硬化的唯一有效手段就是肝移植，但是，即使是在发达国家，由于的供肝的不足和受者对手术不能耐受，肝移植技术无法完全解决肝硬化问题。近年来肝纤维化日益受到人们的重视，已成为肝病研究领域的热点。诸多病因如病毒、酒精、药物等所致的肝细胞炎症、坏死均可引起肝纤维化，肝纤维化为慢性肝病发展至肝硬化过程中的病理组织学变化，是发展到肝硬变的必经阶段.，其机理相当复杂，目前认为它主要是多种因素造成肝细胞外基质的过度增多和异常沉积，其主要成分包括胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖和弹力纤维。尤其我国是世界公认的乙肝大国，发病人数居高不下，肝纤维化继续发展可导致肝硬化外，部分可发生癌变。 现认为肝纤维化尚有逆转至正常肝的可能，而肝硬变则否，认为阻止或延缓肝纤维化的发生和发展就能治愈大部分慢性肝病患者，给予有效治疗还可防止发展为肝硬化、肝癌。因此，人们期望对肝纤维化作出早期诊断，如何诊断肝纤维化，超声波、影像等一旦发现多数已在中期以上肝硬化阶段，能够早期诊断肝纤维化的方法至今主要依靠肝活检，临床称之为金标准。但，因其属损伤性检查，患者多不愿接受，作为抗肝纤维化药物疗效考核指标更难，因需多次活检、穿刺部位及样本大小等有其局限性； 肝脏B超是了解肝脏形态结构的非创伤性检查； 常用的肝功能检查法仅反映肝脏炎症、坏死及功能的改变；在肝穿刺不易推广的情况下与肝纤维化相关的血清学诊断方法受到关注，其项目日益增加； 血清肝纤维化标志物测定是无创伤性的，是从生化代谢方面判定肝纤维化的活动度，可进行动态观察，虽不能代替肝活检，但其与肝纤维化程度密切相关，因此临床上有其实用诊断价值，现临床所测肝纤维化的血清学指标只反映了慢性肝病肝纤维化过程的某个阶段及成分的变化，其临床意义应作综合分析评价。 肝纤维化的诊断指标 肝纤维化的诊断指标四项内容：透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白。 透明质酸(hyaluronic Acid HA) 【正常参考值】血清：<100 ng/ml 【临床意义】HA是一种产生于间质细胞的氨基多糖，分子量4，000-8，000万，由肝内皮细胞摄取、降解，其广泛存在于结缔组织、皮肤、关节液及玻璃体液中，
实验大鼠取材方案 [取材内容] 1.取大鼠静脉血，分离血浆、血清，-80℃保存。 2.取大鼠门静脉血，分离血清，-80℃保存。 3.取大鼠甲状腺组织，制备甲状腺电镜观察标本，其余组织液氮冰冻保存备用。 4.取大鼠胸腺组织，制备胸腺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织液氮冰冻 保存备用。 5.取大鼠肺组织，制备肺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液氮冰冻 保存备用。 6.取大鼠肝脏组织，制备肝脏组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液氮 冰冻保存备用。 7.取大鼠胰腺组织，制备胰腺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液氮 冰冻保存备用。 8.取大鼠肠系膜淋巴结组织，制备肠系膜淋巴结免疫组化观察标本，其余组织液氮冰冻保 存。 9.取大鼠胃部组织，制备胃粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液 氮冰冻保存备用。 10.取大鼠空肠组织，制备肠道粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装 液氮冰冻保存备用。 11.取大鼠回肠组织，制备肠道粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装 液氮冰冻保存备用。 12.取大鼠肾组织，制备左肾组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，右肾组织液氮冰冻保 存备用。 13.取大鼠肾上腺组织，左侧制备肾上腺组织免疫组化观察标本，右侧肾上腺液氮冰冻保存 备用。 14.取大鼠睾丸组织，左侧制备电镜观察标本、免疫组化观察标本，右侧睾丸液氮冰冻保存 备有。 [试剂及药品] 戊巴比妥钠或10%水合氯醛、75%酒精、生理盐水、多聚甲醛或福尔马林液、3％戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4％戊二醛、肝素钠、器械液（器械清洗消毒液） [器材] 备皮刀、解剖台、弯盘、组织剪、眼科剪、手术刀柄、刀片、小号弯式血管钳、蚊式血管钳、眼科镊、无损伤血管夹、聚乙烯管、三通管、丝线、培养皿、天平、一次性离心管（5ml、
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化 机理研究 【摘要】目的观察四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型时相关细胞因子 的变化，初步探讨四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。方法以四氯化碳腹腔注射的方法[四氯化碳 mL (用花生油1∶6稀释)/次，每周3次，共14周]制作大鼠肝纤维化模型，设立正常、溶剂对照组，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原含量;ELISA法检测转化生因子ββ1)、肿瘤坏死因子α);化学法检测血清氧化亚 氮(NO)。肝行HE和Masson胶原染色，光镜下观察病改变，并按SSS计分系统进行评分。免疫组化染色观察肝组织血小板源生长因子的变化，专业像分析进行图像分析。结果与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清ALT、AST、HA、LN、、NO、β1 、α明显升高
()，大鼠肝组织肝纤维化评分明显升高()，肝组织表达明显增多()。结论促进相关细胞因子的表达可能是四氯化碳腹 腔注射致大鼠肝纤维化的机理之一。 【关键词】四氯化碳;肝纤维化;细胞因子 Abstract:Objective To investigate the variation of correlated cytokine when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride,and to the relevant molecular mechanism. Methods Rat models of hepatic fibrosis were made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride at mL(diluted 1∶6 with peanut oil),three times a week,a total of 14 weeks. The normal and dissolvent groups were prepared as controls. Serum β1 and α were detected by ELISA method. Serum levels of NO were detected by
实验大鼠取材方案 ［取材内容］ 1. 取大歸脉血分离血衆血清-80 C保存。 2. 取大鼠门静脉血分离血清-80 C保存。 3. 取大鼠甲状腺组织.制备甲状腺电镜观察标本其余组织液氮冰冻保存备用〃 4. 取大鼠胸腺组织制备胸腺组织电镜观察标本、免疫组化孵标本其余组织液氮冰冻保存备用。 5. 取大鼠肺组织制备肺组织电镜观察标本，免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰搽 保存备用。 6. 取大鼠肝脏组级制备肝脏组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用。 7. 取大鼠觴组级制备康腺组织电镜观察标芯免疫组化观察标本其余组织分装液氮 冰冻保存备用。 8. 取大鼠肠系膜淋巴结组织制备肠系膜淋巴结免疫组化观察标本其余组织液氮冰冻保存。 9. 取鳩胃部组级制备胃粘膜组织电飙察标本免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用。 10. 取大鼠空肠组级制备肠道粘膜组级电镜观察标本■免疫组化观集标本其余组级分装
液氮冰冻保存备用。 11. 取大鼠回肠组织制备肠道粘膜组织电镜观舉标技免疫组化观察标本其余组 织分装 液氮冰冻保存备用。 12. 取大關组织制备左肾组级电镜观察标本、免疫组化观察标本右肾组织液氮 冰探保 存备用。 13. 取大嵐肾上腺组织左侧制备肾上腺组级免疫组化观察标本右侧肾上腺液氮冰冻保 存 备用。 14. 取大鼠睾丸组级左侧制备电镜观察标本、免疫组化观察标本右侧睾丸液氮冰冻保存 备有。 ［试剂及药品］ 戊巴比妥钠或10%水合氯醛、75%酒精、生理盐水、多聚甲醛或福尔马林液、 3 应二醛 磷酸 盐缓冲液（PBS0.01mol/LP pH7.4）或 4 戍二肚肝素撤m器械清洗消毒液 ［器材］ 备皮刀、解剖台、弯盘、组织剪、眼科剪、手术刀柄、刀片、小号弯式血管钳、蚊式血管钳、 眼科镊、无损伤血管夹、聚乙烯管、三通管、丝线、培养皿、天平、一次性离2ml、1.5ml 、冻存氤肝麹真空采血管、微量移液議高速敲杠注射器10ml、5ml、
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
中文摘要 目的本文通过对SD大鼠腹腔注射四氯化碳以诱导大鼠肝纤维化动物模型。 方法取15只SD大鼠，180—220g，分为A组10只，B组5只，A组为模型组：40%CCL4橄榄油混合液按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周。B组为对照组：纯橄榄油按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周，八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。病理学检测：HE染色，MASSON染色,PAS染色。基因学检测：1.3.4型胶原蛋白 结果八周试验期间B组大鼠全部存活，肝组织标本结构清晰，无异常情况；A组大鼠出现明显的病态，肝组织标本均已达到肝纤维化S3以上，多数标本可见小叶被纤维结构分割包围，假小叶形成，干细胞可见脂肪变性； 结论该方法肝损伤明显，死亡率低，周期短，能够成功作为慢性肝损伤，肝纤维化的模型。 关键词肝纤维化，四氯化碳，动物模型 Abstract Objective: Established animal model of hepatic fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride. Methods: Take 15 SD rats,180-220g, divided into 10 group A, group B 5 只, A group of model group: 40% CCL4 0.12ml/100g by abdominal injection of a mixture of olive oil, twice a week, a total of eight weeks. Group B was the control group: pure olive oil press 0.12ml/100g abdominal injection twice a week, a total of eight weeks, eight weeks later, all rats were fasted for 12 hours were sacrificed, dissected liver tissue. Pathology: HE staining, MASSON staining, PAS staining. Genetics testing: 1.3.4 collagen Results: During the eight-week test group B rats survived, liver tissue specimens clear structure, no exceptions; significant morbidity A rat liver tissue fibrosis S3 have reached above, the majority of samples are split fiber structure visible lobular surrounded pseudo lobule formation, stem cell degeneration visible fat. Conclusion: This method obviously liver injury mortality, the period is short, to be successful as chronic liver damage, liver fibrosis model. Key words: Fibrosis, carbon tetrachloride, animal model 前言
肝纤维化四项指标及其临床意义 HA ,Hyaluronidase（透明质酸酶）： 为基质成分，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，有认为本指标较之肝活检更能完整反映出肝全貌，是肝纤维化和肝硬变的敏感指标。 1）血清HA在急肝、慢迁肝时轻度升高；慢活肝时显著升高；肝硬化病人血清HA极度升高。 2）血清HA水平是反映肝损害严重程度、判断有无活动性肝纤维化的定量指标。 3）对慢迁肝与慢活肝的鉴别诊断，慢迁肝HA浓度与正常人无差别，而慢活肝的升高明显。 4）反映肝细胞功能，肝脏纤维化形成和程度，反映肝脏炎症性病变。 5）有助于估价肝病发展趋势，在急性肝炎→慢活肝→肝硬化发展中，血清HA逐步并优于其他肝硬化诊断指标等。 6）肝硬化时，有些病人HA却不升高，与其肝脏合成功能有关 LN ,Laminin （层粘连蛋白）： 为基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，慢活肝和肝硬变及原发性肝癌时明显增高，LN也可以反映肝纤维化的进展与严重程度。另外，LN水平越高，肝硬变病人的食管静脉曲张越明 显。 1）反映肝纤维化：正常肝脏间质含少量LN，在肝纤维化和肝硬化时，→肌成纤维细胞增多→大量合成和分泌胶原、LN等间质成分→形成完整的基底膜（肝窦毛细血管化）。肝窦毛细血管化是肝硬化的特征性病理改变， LN与纤维化程度和门脉高压正相关，纤维化后期升高尤为显著。 2）可诊断酒精肝是否存在门脉高压 3）与基底膜相关疾病有关：如先兆子痫孕妇血清较正常妊娠者显著升高，提示可能与肾小球及胎盘螺旋动脉损伤有关。血清LN与糖尿病、肾小球硬化等疾病有关。 PCIII ,Procollagen Ⅲ（III型前胶原）： 反映肝内III型胶原合成，血清含量与肝纤程度一致。 1）PCIII与肝纤维化形成的活动程度密切相关，但无特异性，其它器官纤维化时，PCIII也升高。 2）持续PCIII升高的慢活肝，提示病情可能会恶化并向肝硬变形成发展，而PCIII降至正常可预示病情缓解，说明PCIII 不仅在肝纤维化早期诊断上有价值，在慢性肝病的预后判断上也有意义。 3）肝纤维化病变程度呈密切相关，反映肝纤维合成状况和炎症活动性，早期即显著升高，而陈旧性肝硬化和部分晚期肝硬变、肝萎缩患者血清PCⅢ不一定增高。
CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型 肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）过度沉积，不是一个独立的疾病，是许多慢性肝病共同的病理过程，几乎各种慢性肝病（化学毒性、感染性、遗传代谢性、自身免疫性，以及胆汁淤积性）都可以导致肝纤维化。 CCl4是诱导实验动物产生肝纤维化和肝硬化最广泛使用的化学性肝毒物。在肝细胞内质网中，经肝微粒体内依赖于细胞色素P450 的具有混合功能的氧化酶激活后，CCl4产生了自由CCl3·及Cl，它们与肝细胞内大分子发生共价结合，可攻击膜不饱和脂质，引发活性氧自由基的产生和脂质过氧化，损伤肝细胞，从而导致狄氏间隙内原本静止的贮脂细胞活化，释放出Ⅳ型胶原酶，降解Ⅳ型胶原。同时该细胞由合成分泌Ⅲ型胶原改为合成分泌I 型胶原，取代了Ⅳ型胶原，促使肝脏纤维化 1.实验动物 SPF级BablC小鼠，健康，雄性，体重为18g-20g 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 6W 4.主要试剂 CCl4（上海国药集团） 5.建模方法 按5ml/kg 体重皮下注射体积分数为20% CCl4的油剂溶液（CCl4：橄榄油=1:4）, 每3天1次，连续6W。对照组动物皮下注射等量等次的橄榄油溶剂。正常饮食饲养，观察动物活动、精神状况和饮食量,实验前后称量小鼠体重。 完成持续给药6W后，称体重，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80℃冰箱冻存。同时取肝左叶组织1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋；其余肝组织液氮冷冻-80℃保存。 6.模型评价
世界最新医学信息文摘 2016年 第16卷 第94期39 重视中医药在大肠癌治疗方面的研究，探索新思路，研讨新治法，增加新疗法，提高大肠癌患者生存率。 参考文献 ［１］ 关彤．《金匮要略》理论在大肠癌防治中的运用［Ｊ］．中华中医药学刊，２００７，２５（２）：３７１－３７２． ［２］ 余胜珠，杨光华，陈连生，付相建．补中益气汤联合四神丸加减治疗老年大肠癌术后腹泻１８例［Ｊ］． 中国药业，２０１３，２２（８）：９９－１００．［３］ 王学中，季秀海．健脾补肾活血方改善大肠癌术后化疗毒副作用临床观察［Ｊ］．新中医，２０１５，４７（８）：２１０－２１１．［４］ 薛建章，王瑞敏．中医药联合化疗对大肠癌根治术后复发、转移以及生存期的影响研究［Ｊ］．中国现代药物应用，２０１６，１０（５）：２５９－２６０． ［５］ 黄耀，唐晓玲．熊墨年教授治疗大肠癌的临证经验初探［Ｊ］．江西省２ ０ １ ４年中医、中西医结合肿瘤学术交流会暨中医苗治疗肿瘤新进展培训班，１８４－１８７． ［６］ 李晓琳，冯 妮．复方苦参注射液联合化疗治疗大肠癌术后３１９例患者的疗效分析［Ｊ］．中医中药，２０１５ ，１３（１４）：１９９－２００．［７］ 陈爱飞．清肠消癌方灌肠联合化疗治疗晚期大肠癌５６例观察实用［Ｊ］．中医药杂志，２０１１，２７（１２）：８４２－８４３． ?综述? 肝纤维化大鼠模型的研究进展 王宪东１，石安华２（导师），陈文玲３（通讯作者） （１．云南中医学院 基础医学院，云南 昆明 ６５０５００；２．云南中医学院 继续教育学院，云南 昆明 ６５００００； ３．云南中医学院 临床医学院，云南 昆明 ６５００００） 摘要：肝纤维化动物模型是研究肝纤维化发病机制的重要途径，本文对目前常用的肝纤维化大鼠模型进行阐述，主要综述了四氯化碳、二甲基亚硝胺、猪血清、刀豆蛋白、乙醇及胆管阻塞手术方等造模方法，同时探讨了每一种模型的造模方法和优缺点。 关键词：肝纤维化；动物模型；大鼠；机制 中图分类号：R657.3+1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1671-3141.2016.94.028 0 引言 肝纤维化是肝脏内弥漫性纤维结缔组织沉积，机体对炎症组织损伤修复的反应［１］。肝纤维化是许多慢性肝病的中间环节，阻止延缓肝纤维化的发生发展是治疗的关键。肝纤维化动物模型的建立，既是研究肝纤维化发病机制的前提，也是研究肝纤维化治疗的先决条件。标准的肝纤维化动物模型应该具备如下条件：与人类的病变基本相似；肝纤维化的发生发展具有明显的分期的过程；动物的造模成功率高，死亡率低；造模方法简便，造模成本低廉，具有可重复性等。 1 四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型 四氯化碳（ＣＣＬ４）诱导的大鼠肝纤维化模型是应用最广泛的肝纤维化动物模型，其模型在临床上与人类的某些病理学变化极其相似。ＣＣＬ４经过灌胃或者腹腔注射后，通过门静脉流入肝脏，随着血液的循环由汇管区向中央静脉流动。在此过程中，ＣＣＬ４被肝细胞吸收，在肝细胞内经微粒体细胞色素氧化酶Ｐ４５０代谢生成大量的自由基，攻击肝细胞，使肝细胞发生凋亡或坏死。黄月红等［２］对大鼠腹腔注射生理盐水５０％与 ＣＣＬ４ 蓖麻油混合液，剂量为２ｍｌ／ｋｇ，每周两次，共四周，结果显示ＣＣＬ４造模４周早期肝纤维化已形成。ＣＣＬ４诱导的大鼠肝纤维化模型具有操作简便，价格低廉，耗费时间短等优点，但是动物的死亡率较高，而且停止注射一段时间后，肝纤维化有愈合的趋势。 2 二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化动物模型 二甲基亚硝胺（ＤＮＭ）是一种半挥发性的有机化学品，小剂量接触可能致癌，具有较强的肝毒性作用。ＤＭＮ通过肝微粒体代谢其中间产物与核酸、蛋白质等结合导致肝细胞损伤，同时产生的活性甲基化产物使核酸、蛋白质甲基化导致肝坏死［３］。梁晋川等［４］对大鼠腹腔注射ＤＭＮ１０μｌ／ｋｇ，连续３ｄ／周，连续３￣６周；或８ｍｌ／ｋｇ，连续３ｄ／周，连续五周，在注射２￣５周后肝纤维化程度逐渐加重。ＤＭＮ诱导的大鼠肝纤维化模型具有周期短，可重复性好，纤维化的程度高，停止给药后不宜反复等特点，而且ＤＮＭ本身就是致癌物，与临床上肝癌的病变特点有相似之处。但对ＤＭＮ注射的量不易掌控，动物的死亡率较高，ＤＭＮ本身就为一级致癌物，在操作中也要注意个人防护，防止中毒。 3 猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型 猪血清是一种异种血清，血清中的白蛋白注入大鼠体内后变为异种抗原 ，诱导机体产生抗体从而形成抗原与抗体的复合物，沉积于门脉区肝血管和间质组织中，通过免疫复合物介导的细胞毒性反应活化枯否氏细胞而导致肝血管和间质组织结构的改变，最终引发肝纤维化。张艳等［５］对大鼠采用腹腔注射猪血清０．５ｍｌ／ｋｇ，每周两次，经观察腹腔注射猪血清四周时，肝纤维化已初步形成，八周时模型就已经复制成功。猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型主要与免疫性肝纤维化的形成有关，与人类慢性肝炎中肝纤维化的发生相似。但其复制模型的周期较常长，动物肝脏的损伤常常具有自愈性，动物的死亡率也比较高。4 刀豆蛋白诱导肝纤维化的大鼠模型 刀豆蛋白Ａ（Ｃｏｎ Ａ）是从刀豆中提取的凝集素，其具有沉淀多种糖类、区分某些正常的细胞和肿瘤并促进其分裂等。Ｃｏｎ Ａ可以激活Ｔ细胞从而引起肝脏的损伤。梁洁等［６］经尾静脉注射１２．５ ｍｇ／ｋｇ剂量的Ｃｏｎ Ａ，每周１次，连续注射八周后的大鼠ＡＬＴ、ＡＳＴ指标显著增高，肝脏体积增大，肝脏指数升高，提示肝纤维化形成。Ｃｏｎ Ａ诱导肝纤维化大鼠模型，其病理过程与慢性肝炎的病理过程相似，可以更好的复制人类病毒性肝病的模型。Ｃｏｎ Ａ诱导肝纤维化大鼠模型造模的成功率高，动物死亡率低，简便易行。 5 乙醇诱导的肝纤维化动物模型 酒精中毒是西方国家肝硬化发病的主要原因，在我国，随着生活水平的提高，酒精性肝病的比例也逐渐升高。酒精在进 （下转第３０页） 基金项目：云南省科技厅应用基础面上项目（NO. 2013FZ091） 作者简介：王宪东，男，汉族，籍贯：辽宁省大连市，现在职务或职称：研究生在读，学位：硕士学位，研究方向：中西医结合防治疾病机制研究。