[文章编号] 100723949(2002)1020120019204
?实验研究?
半边莲不同组分对内皮细胞内皮素及内皮源
一氧化氮合酶代谢的影响
李瑞峰,温海涛,李莉,陈融,任冬梅,郭成浩,闫晓梅,胡维诚
(山东大学医学院病理生理学教研室,山东省济南市250012)
[主题词] 半边莲; 内皮素; 一氧化氮合酶; 动脉粥样硬化[摘 要] 为了探讨半边莲对动脉内皮保护作用的有效成分,提取半边莲两种不同组分用于高脂血症大鼠,观察对动脉内皮细胞内皮素和内皮源一氧化氮合酶代谢以及对动脉内皮功能和形态的影响。结果发现,高脂血症大鼠应用半边莲B001组分60天后,血浆内皮素浓度和动脉内皮细胞内皮素阳性细胞率明显低于高脂未用药组(P <0.05),血浆内皮源一氧化氮合酶浓度显著高于高脂未用药组(P <0.05),且动脉内皮损伤减轻,但血脂无明显变化。应用半边莲A001组分的高脂血症大鼠血脂浓度、内皮素和内皮源一氧化氮合酶无明显变化。结果提示,半边莲B001使高脂血症时内皮细胞、内皮素合成及释放减少,并可促进内皮源一氧化氮合酶的合成,缓解高脂血症对血管内皮的持续损伤。[中图分类号] R972.6[文献标识码] A
E ffects of Different E lement from Scute Llaria B arbata on Metabolism of E ndothelin and E ndothelial Nitric Oxide Synthase in Arterial E ndothelium
LI Rui 2Feng ,WE N Hai 2T ao ,LI Li ,CHE N R ong ,RE N Dong 2Mei ,G UO Cheng 2Hao ,Y AN X iao 2Mei ,and H U Wei 2Cheng
(Department o f Pathophysiology ,School o f Medicine ,Shandong University ,Jinan 250012,China )
[MeSH ] Scute Llaria Barbata ; Endothelin ; Nitric Oxide Synthase ; Atherosclerosis [ABSTRACT] Aim T o investigate the protection of effective elements from Scute Llaria Barbata on arterial endothelium. Methods The Wistar rats were fed with high 2cholesterol diet and treated with the A001element and the B001element of Scute Llaria Barbata for 60days. The levels of the blood total cholesterol (TG ),triglycerides (TG ),endothelin 21(ET 21),endothelial nitric oxide synthase (eNOS )and the positive rate of ET in “en face ”preparation of arterial endothelium were detected. R e 2sults The concentrations of T C and TG did not reduce in hyperlipidemic rats treated with both B001and A001. The blood ET 21,positive rate of ET in arterial endothelium and the m orphological injury of the arterial endothelium decreased significantly (P <0.05)and the blood eNOS increased significantly (P <0.05)in the hyperlipidemic rats treated with B001. The hyperlipidemic rats treated with A001did not show the same changes. Conclusion The B001is the effective element of Scute Llaria Barba 2ta ,which can protect the arterial endothelium and im pede the development of atherosclerosis.
[收稿日期] 2001209204 [修回日期] 2001212224 [基金项目] 山东省卫生厅青年科学研究基金(CA2CAA2)资助。[作者简介] 李瑞峰,男,1955年出生,山东无棣人,副教授,硕士研究生导师。温海涛,男,1975年出生,山东临沂人,病理生理学硕士。郭成浩,男,1965年出生,吉林人,教授,硕士研究生导师。胡维诚,男,1945年出生,教授,博士研究生导师。
内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis ,As )病灶形成的始动环节。高脂血症是As 的最主要危险因素之一,血中脂质既能使内皮细胞发生轻度损伤,又能使脂质在内皮下沉积,并促使单核细胞在内皮粘附、向内皮下游走而启动As 过程。内皮素(endothelin ,ET )与一氧化氮(nitric oxide ,NO )平衡失调是动脉内皮受损的显著特征,与As 的形成有确定的关系[1]。内皮素与蛇毒有共同的祖基因、同源染色体结构和相似的生物学效应[2,3]。我们前期工作
显示,抗蛇毒中药半边莲和蚤休可抑制动脉内皮细胞合成内皮素,并对血管内皮具有保护作用[4]。本研究利用高脂血症实验模型进一步探讨半边莲提取物不同组分对内皮素和内皮源一氧化氮合酶(en 2dothelial nitric oxide synthase ,eNOS )的影响,以及对动脉内皮功能和形态的影响,以寻找清热解毒类中药对动脉内皮保护作用的有效成分。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
雄性Wistar 大鼠40只,平均体重180±20g ,由山东大学医学院实验动物中心提供,随机分为四组:①对照组(n =10)喂以基础饲料,任意进食;②高脂组(n =10)在基础饲料中加入10%猪油、2%胆固醇及0.5%猪胆盐[5],任意进食;③B001组(n =10)高
脂喂养30天后,每天插管灌胃5%半边莲B001水溶液4μL/g体重,持续60天;④A001组(n=10)高脂喂养30天后,每天插管灌胃5%半边莲A001水溶液4μL/g体重,持续60天。实验第90天将大鼠全部处死。
半边莲提取物A001和B001由山东大学药学院天然药物化学教研室提供。
1.2 血脂测定
分别在实验前、实验第30天和实验第90天测定血脂。禁食12h,断尾取血,用酶法测定血清总胆固醇(total cholesterol,TC)及甘油三酯(triglyceride,TG),试剂由北京中生生物工程高技术公司提供。
1.3 血浆内皮素1及内皮源一氧化氮合酶测定
将大鼠用乙醚麻醉后,固定于实验动物持续吸入麻醉手术台,断尾取血,用E DT A和Aprotilin抗凝酶处理,37℃水浴静置15min,3000r/min离心10 min,分离血浆,-20℃保存待测。分别在实验前、实验第30天和第90天测血浆内皮素1和eNOS。用放射免疫法测定血浆内皮素1含量,用化学比色法测定血浆eNOS活性。内皮素放射免疫药盒由中国人民解放军总医院科技开发中心放射免疫所提供,内皮源一氧化氮合酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.4 动脉内皮细胞内皮素测定
腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(35μg/g体重),于左颈总动脉插管,恒压(13.3kPa)灌注由0.1m ol/L 磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛(pH7.2),持续10 min,剥离出胸主动脉和腹主动脉,置于上述固定液内1h。沿纵轴剖开血管,制备动脉内皮铺片,显微镜下计数每例主动脉内皮全部视野内皮细胞总数和内皮素阳性细胞数,计算出内皮素阳性细胞率。小鼠抗内皮素1血清由SIG M A公司提供;S ABC免疫组织化学染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.5 统计学处理
所有数据用均数±标准差(x±s)表示,进行两组均数间的t检验和多组均数间的方差分析。
2 结果
2.1 血清总胆固醇和甘油三酯含量
高脂喂养30天后,高脂组、B001组和A001组大鼠血清TC和TG含量明显高于对照组(P<0.05);灌服中药60天后,B001组和A001组TC及TG仍增高,但与高脂组相比无显著性差异(表1和2,T able1and 2)。
表1. 半边莲不同组分对血清总胆固醇含量的影响.
T able1. E ffect of different element of Scute Llaria B arb ata on total cholesterol(x±s,mm ol/L).
G roups0d30d90d
C ontrol 1.762±0.194 1.784±0.163 1.796±0.158
H L 1.785±0.168 5.973±0.162a 6.124±0.180a
H L+B001 1.790±0.153 6.023±0.173a 6.358±0.173a
H L+A001 1.853±0.178 5.932±0.181a 6.342±0.143a
H L=high lipid diet;the same below. a:P<0.05,com pared with control group.
表2. 半边莲不同组分对血清甘油三酯含量的影响.
T able2. E ffect of different element of Scute Llaria B arb ata on blood triglyceride(x±s,mm ol/L)
G roups0d30d90d
C ontrol 1.074±0.121 1.028±0.123 1.039±0.134
H L0.986±0.109 3.124±0.414a 3.582±0.324a
B001 1.013±0.132 3.200±0.468a 3.712±0.316a
A0010.963±0.122 3.135±0.382a 3.678±0.322a
a:P<0.05,com pared with control group.
2.2 血浆内皮素1含量
高脂饮食30天后,高脂组、B001组和A001组血浆内皮素1含量显著高于对照组(P<0.05)。用药60天,B001组内皮素1继续增高,但低于高脂组(P <0.05);A001组与高脂组内皮素1比较无显著性差异(表3,T able3)。
表3. 半边莲不同组分对血浆内皮素1含量的影响.
T able3. E ffect of different element of Scute Llaria B arb ata on blood endothelin21(x±s,mm ol/L).
G roups0d30d90d
C ontrol231.38±23.09248.03±30.42242.62±35.07
H L224.68±31.56313.23±36.52a398.65±31.08
B001231.52±26.36323.26±30.09a327.65±28.04b
A001228.32±30.45316.54±29.56a376.28±32.78
a:P<0.05,com pared with control group;b:P<0.05,com pared with HC group.
2.3 血浆内皮源一氧化氮合酶活性
高脂饮食30天后,高脂组、B001组和A001组血浆eNOS活性显著低于对照组(P<0.05)。用药60天,B001组血浆eNOS活性明显高于高脂组(P<0.
05),但A001组与高脂组比较无显著性差异(表4, T able4)。
表4. 半边莲不同组分对血浆内皮源一氧化氮合酶活性的影响.
T able4. E ffect of different element of Scute Llaria B arb ata on plasm a eN OS active(x±s,ku/L).
G roups0d30d90d
C ontrol31.53±2.7630.62±2.5831.69±2.63
H L29.66±2.3523.19±2.48a18.38±1.63
B00130.62±2.5223.32±2.56a24.67±2.62b
A00128.78±2.2322.46±1.85a18.07±1.79
a:P<0.05,com pared with control group;b:P<0.05,com pared with HC group.
2.4 内皮细胞铺片检查
对照组内皮细胞排列规则,胞核呈蓝色椭圆型,大小一致,染色深浅基本一致;高脂组内皮细胞数量增多,排列紊乱,胞核形状和大小不一,可见多数小而深的胞核(固缩核)。对照组内皮素阳性细胞数量较少,高脂组内皮素阳性细胞数明显增多,B001组内皮素阳性细胞数较高脂组减少,A001组与高脂组内皮素阳性细胞数无明显差异(表5和图1,T able5and Figure1)。
表5. 动脉内皮细胞内皮素阳性细胞率.
T able5. Positive rate of endothelin in the arterial endothelium (x±s,%).
G roups P ositive rate
C ontrol 2.78±0.23
H L7.23±0.28a
B001 3.82±0.16b
A001 6.11±0.29
a:P<0.05,com pared with control group;b:P<0.05,com pared with HC group.
图1. 大鼠主动脉内皮细胞铺片内皮素检测(40×10)
Figure1. Detection of E ndothelin in”E n2face”preperation of aortic endothelium in rat(40×10). A:C ontrol group;B:H L group;C: B001group;D:A001group.
3 讨论
近来研究提示,高脂血症或As动物血管内皮细胞的功能损伤要早于其结构的损伤,在动脉形态学损害或斑块出现之前,就发生了内皮依赖的血管张
力调节、屏障和抗血栓形成等方面的内皮功能障碍[6]。本实验发现,高脂饮食可明显增高动脉内皮细胞内皮素的合成与释放,并明显降低血浆eNOS浓度。
内皮素除了引起强烈的血管收缩外,还能促进血小板聚集和血管平滑肌细胞(sm ooth muscle cell, S MC)增殖,在As发病中扮演重要角色。NO在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)作用下,由左旋精氨酸氧化途径产生。NO通过激活鸟苷酸环化酶而产生生物学效应[7],NO除了调节血管平滑肌张力外,还具有抗氧化、抑制白细胞和血小板粘附与激活、抑制S MC增殖与诱导S MC凋亡等多种生理和病理作用[8]。
清热解毒类中药半边莲是治疗毒蛇咬伤的常用药物。本室在前期工作中曾对高脂血症大鼠灌服半边莲的水煎剂,发现动物的血脂并不降低,但动脉内皮细胞的内皮素合成减少,并使内皮损伤减轻[4]。张继峰等[9]发现半边莲和蚤休具有使大鼠离体胸主动脉环松弛、显著抑制内皮素引起的大鼠血压升高,并能部分拮抗内皮素引起的小白鼠猝死,使动物的存活时间延长等作用。田青等[10]也作过半边莲和蚤休可拮抗内皮素生物学效应的报道。提示半边莲通过拮抗内皮素从而具有抗动脉硬化作用。
本实验结果显示,半边莲A001组分对内皮素1的合成、释放及保护血管内皮方面无明显作用;B001组分能明显降低血浆内皮素1浓度和动脉内皮细胞内皮素阳性细胞率,表明B001组分能通过拮抗内皮素1合成与释放,以缓解高脂血症对血管内皮的继续损伤。另外,半边莲B001组分尚能促进eNOS表达,进而拮抗动脉血管的收缩以及血管S MC增殖。本实验初步弄清了半边莲保护动脉内皮的有效成分,为今后在临床上进行As等心血管疾病的防治研究提供了一条新的思路。
[参考文献]
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中国科学(B辑),1995,25(2):1722178
(此文编辑 文玉珊)
?读者?作者?编者?
《中国动脉硬化杂志》第一届编委会
(1993年9月)
名誉主编: 蔡海江3
主编: 杨永宗3
副主编: 徐也鲁3 孙仁俊3
编委(以下按姓氏笔画排列)
丁翠芬3王宗立邓仲端3孙仁俊3阮琬玉3刘秉文
刘德文汪 钟陈 瑗3陈保生陈铁镇吴满平3
杨小毅3杨永宗3杨和平张英珊张筠庭范乐明3
周宏研3胡必利胡维诚徐也鲁3涂玉林3黄士通
谢金魁楼定安蔡海江3
注:姓名右上角打“3”者为常务编委。
小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)水平。用纯化的小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，再与HRP标记的iNOS抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为480 pg/ml ，320pg/ml ，160 pg/ml，80 pg/ml ，40 pg/ml）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一) 作者：刘霞包翠芬张晓明穆长征 【摘要】目的：对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。方法：分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量，SPSS10.0统计软件包统计分析。结果：新生组酶含量最高为100%,随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4%。结论：这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。 【关键词】小鼠;肾;神经型一氧化氮合酶 一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)〔1〕。目前对肾发生发育过程中NO和NOS的研究还刚刚起步,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。 1材料和方法 1.1实验动物与分组
成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。 1.2主要试剂 nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。 1.3Westernblot步骤 各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm离心10min,留取上清液。用Bradford 法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。 配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μlSDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用 溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min；再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释
小鼠小鼠一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶(NOS)(NOS)(NOS)酶联免疫酶联免疫酶联免疫分析分析分析 试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围检测范围：： 96T 1μmol/L - 32μmol/L 使用目的使用目的：： 本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的小鼠一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP 标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（64μmol/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B 液 6ml ×1/瓶 12 密封袋 1个 标本标本要求要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 32μmol/L 5号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 16μmol/L 4号标准品 150μl 的5号标准品加入150μl 标准品稀释液 8μmol/L 3号标准品 150μl 的4号标准品加入150μl 标准品稀释液 4μmol/L 2号标准品 150μl 的3号标准品加入150μl 标准品稀释液 2μmol/L 1号标准品 150μl 的2号标准品加入150μl 标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
专题二细胞的代谢 第3讲酶与ATP 1.酶在代谢中的作用(Ⅱ) 2.A TP在能量代谢中的作用(Ⅱ) (1)在生物体的活细胞内A TP与ADP的转化只能单向进行。( ) (2)加入呼吸抑制剂可使细胞中ADP生成减少，A TP生成增加。( ) (3)含有两个高能磷酸键的ATP是DNA的基本组成单位之一。( ) (4)酶通过提供反应所需的能量来提高反应速率。( ) (5)酶活性最高时的温度并不适合该酶的长期保存。( ) (6)人体内所有酶的最适pH都接近于中性。( ) (7)影响酶促反应速率的温度和底物浓度机理是一样的。( ) (8)脲酶能够将尿素分解成氨和CO2。( ) (9)用淀粉和淀粉酶探究温度对酶活性的影响时，既可用斐林试剂也可用碘液。( ) (10)过酸、过碱或温度过高、过低，都会使酶的空间结构遭到破坏，使酶永久失活。( ) 1．加热、无机催化剂和酶均能加快化学反应速率，说出它们的区别。 2．写出测定酶的最适温度的实验思路。 3．ATP和酶在成分上有联系吗？说明理由。 1．(2014·全国大纲卷)A TP是细胞中重要的高能磷酸化合物。下列有关ATP的叙述，错误的是() A．线粒体合成的ATP可在细胞核中发挥作用 B．机体在运动时消耗ATP，睡眠时则不消耗ATP C．在有氧与缺氧的条件下，细胞质基质中都能形成ATP D．植物根细胞吸收矿质元素离子所需的A TP来源于呼吸作用 2．(2013·全国Ⅱ，T6)关于酶的叙述，错误的是() A．同一种酶可存在于分化程度不同的活细胞中 B．低温能降低酶活性的原因是破坏了酶的空间结构 C．酶通过降低化学反应的活化能来提高化学反应速度
Therapeuti c effects of a sp i r i n and m echan is m s of a sp i r i n resist ance HUA Yi2nan,X I E Mei2lin (D ept of Phar m acology,M edical School of Suzhou U niversity,Suzhou 215123,China) Abstract:A s p irin is one of the maj or drugs used f or p reventing ather othr ombotic vascular diseases,but not effective t o all patients or s o2called as p irin resistance. However,the mechanis m s of this resistance still re2 mains t o be elucidated.The recent p r ogresses is re2vie wed in the therapeatic effect of as p irin and mecha2 nis m s of the drug resistance. Key word:as p irin;as p irin resistance;thr ombosis; p latelet;mechanis m 内皮型一氧化氮合酶脱偶联的研究进展郑建普1,卞 卡1,2,3,可 燕1,2,Murad Ferid1,3 (1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心,上海 201203;2.上海高校一氧化氮与炎症医学研究院,上海 201203;3.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系,德克萨斯大学分子医学研究所,休斯顿 T X77030) 中国图书分类号:R205;R28911;R345144;R5431023; R7431023;R91613;R97713;R97714 文献标识码:A文章编号:1001-1978(2006)06-0659-05摘要:血管内皮功能障碍(endothelial dysfuncti on)是多种心脑血管疾病的共同病理机制,其突出表现为内皮依赖性血管舒张功能障碍,主要由NO减少及氧自由基增加所致。最新研究发现,内皮型一氧化氮合酶脱偶联(e NOS uncoup ling)是导致NO水平下降和氧自由基水平升高的重要机制,是高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病中内皮功能障碍的重要原因。通过纠正e NOS脱偶联可有效改善内皮功能,有望为保护血管内皮功能提供有效途径。 关键词:e NOS脱偶联;内皮功能障碍;一氧化氮;氧化应激;四氢生物蝶呤 血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)是分布于所有血管内侧的单层纵向细胞,在调节血管舒缩状态、凝血和纤溶,防止有害脂蛋白浸 收稿日期:2006-02-22,修回日期:2006-04-16 基金项目:上海市教委高校一氧化氮与炎症医学E研究院计划资助项目(No E204010);上海市教委重点科研资助项目(No 05ZZ11);上海市科委基础研究重点资助项目(No 05JC14056) 作者简介:郑建普(1979-),男,博士生,研究方向:心血管药理学与炎症医学,Tel:021*********,E2mail:je mpoo.tseng@ g https://www.doczj.com/doc/d38030256.html,; 卞 卡(1958-),男,教授,博士生导师,研究方向:心脑 血管药理学与炎症医学,通讯作者,Tel:021*********,E2 mail:Ka.B ian@uth.t m https://www.doczj.com/doc/d38030256.html, 润及氧自由基损伤等方面起重要作用。大量实验研究证明,正常的血管内环境是抵御心血管疾病的基础防线,内皮细胞的健康与否直接关系到血管内环境的稳定,而一氧化氮(nitric oxide,NO)信息系统的健全又是内皮细胞发挥生理作用的关键。正常生理条件下,血管系统中的NO主要源于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS),发挥扩张血管、调节血压、抑制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等作用[1]。近年来,大量的基础及临床资料进一步证实,在诸如高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、糖尿病及长期吸烟等病理情况下, e NOS出现功能障碍,此时e NOS不再生成NO而是产生超氧阴离子,造成NO生物利用度降低及氧化应激(oxidative stress)增加,导致或加重内皮功能障碍,该现象被称为e NOS脱偶联(e NOS uncoup2 ling)[2,3]。 1 eN O S脱偶联的产生机制 e NOS脱偶联的产生机制主要有:①NO生成底物L2精氨酸(L2arginine,L2A rg)不足,使本应转移到L2A rg的电子转移到O2从而产生超氧阴离子(O? 2 );②NO生成的重要辅助因子四氢生物蝶呤 (tetrahydr obi op terin,BH4)供应不足,导致主要的终 产物是O? 2 ,而不是NO;③氧化应激使e NOS结构发生改变从而导致活性下降。 1.1 L2Arg与eN O S脱偶联 L2A rg是人体的半必需氨基酸之一,也是NO合成的底物。L2A rg在生理 浓度下,电子由NADPH转移到F AD,生成F ADH 2 , ? 9 5 6 ? 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6):659～63
人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒使用说明书 Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置 标准品稀释液：1.5ml×1瓶 酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96） 【人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用 计算： 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 试剂盒组成： 封板膜:2片（48）/2片（96） 说明书:1份 密封袋:1个 标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存 酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存 样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存 浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的人一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人一氧化氮合成酶(NOS)浓度。 目的：本试剂盒用于测人血清，血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)的含量。 服务承诺： 供货期：款到发货。 工作时间内免费的技术咨询和指导。请来电咨询 为客户提供来样检测服务，最大限度实验结果的有效性(免费代测)。 保存条件及有效期： 试剂盒保存：2-8℃| 有效期：6个月 【人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒】样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
《酶在细胞代中的作用》教学设计 市南集中学倪文勤 教学目标： 知识目标： 说明酶在代中的作用 能力目标： 1，学会基本的实验操作能力和实验分析能力 2，学会分析、设置实验自变量；观察和检测因变量；控制无关变量以及对照设置方法等 3，根据控制变量，学会简单的实验设计 情感态度价值观： 通过实验培养科学严谨的作风，尊重科学事实的思想。 教学重点： 学会基本的实验操作能力和实验分析能力 教学难点： 1，设计实验并学会控制变量的科学方法 2，酶的作用机理 教学过程： 一、导入：（2分钟）
设计意图：从一个现象说起：生活中利用双氧水消毒实例漫画，从消毒时产生气泡入手，提出过氧化氢分解的反应式，分析提高反应速率的条件，引出实验：比较过氧化氢在不同条件下的分解速率。联系生活实际，直接进入主题，自然过度。 具体过程： 【师】很高兴今天能够和大家一起来探讨一节课，请看下面的漫画。擦上了怎么办？在用过氧化氢消毒的时候，我们能够看到什么现象？ 【生】有气泡冒出 【师】产生气泡的原因是过氧化氢分解了，那么过氧化氢分解的反应式是什么？【生】上黑板板书，2H2O2===2H2O +O2 【师】在生物上，写的方程式没有等号，换成箭头，不需要写气体生成符号。【师】哪些条件能够加速过氧化氢分解呢？ 【生】加热、二氧化锰 【师】今天我们为大家提供的和Mno2一样具有催化作用的Fecl3溶液。还有吗？为什么过氧化氢在消毒时会产生气泡呢？ 【生】细胞加速其分解了 【师】对，人在细胞代过程中会产生对细胞有害的物质，如过氧化氢就是其中之一，幸而细胞中含有一种物质，能将过氧化氢及时分解，这种物质就是过氧化氢酶。 二、引导学生实验：（1分钟） 设计意图：通过让学生提出问题——过氧化氢在不同条件下的分解速率，教师引导学生对问题做出假设，四个条件的反应速率比较，使学生在实验过程中更加的
一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一) 关键词：巨噬细胞肺泡一氧化氮合酶肿瘤活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用〔1〕。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺MNOS 活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。1材料和方法 1.1肺M的制备及培养体质量20～25g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1ml,共15次。将回收的灌洗液以1500r/min离心10min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5%CO2培养2h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200U/ml)的干扰素γ（INFγ）,继续培养24h。 1.2肿瘤细胞培养上清液的收集将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞P815(上海肿瘤研究所提供)以5×105个/ml的密度培养在RPMI1640培养液中,置37℃,5%CO2培养箱培养48h,2500r/min离心20min,取上清液,置-20℃保存待用。 1.3iNOS活性测定用Smith薄层层析法〔2〕测定上清液培养标本中瓜氨
酸(citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。 1.4NO测定10mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式〔3〕。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、 2.5%磷酸),室温放置10min，545nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。 1.5肺M肿瘤杀伤活性测定在培养板内加入肺M悬液100μl/孔，实验组再加入2mmol/LNG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50μl/孔，置37℃，5%CO2培养箱培养4h，再加入含10%P815上清液的营养液100μl/孔，置37℃,5％CO2培养72h。每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl,混匀静置20min,在PG-3022酶联仪上用570nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。 1.6统计学处理所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t 检验，各指标进行直线相关分析。 2结果 2.1不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响不同剂量的INFγ与活化的肺M共同培养24h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。 图1INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响 fig1TheeffectofINFγonNOproductionand activityofiNOSbymacrophages
PEG 10mRNA 的抑制作用最强,表明靶mRNA 的 二级结构对siRNA 的功能有很大影响。 本研究中我们构建针对PEG 10基因的siRNA 真核表达载体,并通过酶切鉴定和测序鉴定,说明我们构建的针对PEG 10的真核表达载体是正确有效的,可以用于后续PEG 10基因功能的研究,以及沉默PEG 10后抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,从而为肝癌的基因治疗提供理论依据和实验工具。 参考文献: [1] Ryuichi Ono ,Shin K obayashi ,Hirotaka Wagat suma ,et al.A retrotransposon 2derived gene ,PEG 10,is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q 21[J ]. Genomics , 2001,73(2):2322237. [2] Noble A ,Towne C ,Chopin L ,et al.Insulin 2like growt h fac 2 tor 2Ⅱbound to vitronectin enhances MCF 27breast cancer cell migration[J ].Endocrinology ,2003,144(6):241722424.[3] Moorehead RA ,Sanchez O H ,Baldwin RM ,et al.Transgenic overexpression of IGF 2Ⅱindues spontaneous lung tumors :a model for human lung adenocarcinoma [J ].Oncogene ,2003, 22(6):8532857. [4] Vella V ,Sciacca L ,Pandini G ,et al.The IGF system in t hy 2 roid cancer :new concept s[J ].Mol Pat hol ,2001,54(3):1212 124. [5] Tsou AP ,Chuang YC ,Su J Y ,et al.Overexpression of a no 2 vel imprinted gene ,PEG 10,in human hepatocellular carcino 2ma and in regenerating mouse livers [J ].J Biomed Sci ,2003, 10(6Pt 1):6252635. [6] Hiroshi Okabe ,Seiji Satoh ,Y oichi Furukawa ,et al.Involve 2 ment of PEG 10in human hepatocellular carcinogenesis t hrough interaction wit h SIA H 1[J ].Cancer Research ,2003,63(12): 304323048. [7] 常莹,陶璐薇,陈孝平,等.肝癌组织中遗传印记基因PEG 10 表达的特异性及其意义[J ].世界华人消化杂志,2005,13 (12):140821411. [8] Naito Y ,Yamada T ,Ui 2Tei K ,et al.siDirect :highly effec 2 tive ,target 2specific siRNA design software for mammalian RNA interference [J ].Nucleic Acids Res ,2004,32:W 1242 129. [9] Reynolds A ,Leake D ,Boese Q ,et al.Rational siRNA design for RNA interference[J ].Nat Biotechnol ,2004,22(3):3262 330. [编辑:刘红武] 收稿日期:2006202221;修回日期:2006204214基金项目:怀化市科技计划资助项目(0502) 作者单位:1.418000湖南怀化医学高等专科学校检验 系;2.中国科学院生物物理研究所结构与分子生物学研究 中心作者简介:张申(1955-),男,学士,教授,主要从事自由 基生物学研究 巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的NO 对共培养HL 60细胞凋亡的影响 张 申1,尹利华1,卫涛涛2 E ffects of Inducible Nitric Oxide Synthase Derived Nitric Oxide on Apoptosis of H L 60Cells Co 2cultured with RAW 264.7Macrophages ZHAN G Shen 1,YIN Li 2hua 1,WEI Tao 2tao 2 1.De partment of L aboratory Medicine ,H uai hua Medical College ,H uai hua 418000,China; 2.Center f or S t ructural and Molecular B iology ,I nstitute of B iophysics ,Chinese A cadem y of Sciences Abstract :Objective To study effects of inducible nitric oxide synthase (iNOS )2derived nitric oxide (NO )on apoptosis of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7macrophages.Methods Upon stimulation with lipopolysaccharide (L PS )and interferon 2 γ(IFN 2γ),inducible nitric oxide synthase gene was expressed in RAW 264.7macrophages ,which caused the consequent generation of nitric oxide.Effects of nitric oxide on HL 60cells viability ,expression of bcl 22and bax protein ,activity of Caspase 23and cell apoptosis were evaluated with M T T assay ,Western blot analysis ,fluorescence analysis ,flow cytometry (FCM ),trans 2mission electron microscopy (TEM )and DNA agarose gel electrophoresis.R esults The results showed that iNOS 2derived nitric oxide caused oxidative damage of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7mac 2rophages ,and decreased cell viability ,and evidently reduced expression of bcl 22and increased expression of bax ,and induced activity of caspase 23and DNA f ragmentation.Conclusion The results suggested im 2portant effect of iNOS 2derived nitric oxide on apoptosis of cells in RAW 264.7macrophages. K ey w ords : Inducible nitric oxide synthase ;Nitric oxide ;Apoptosis ;Mac 2 rophage 摘 要:目的 研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iN 2OS )来源的一氧化氮(NO )对共培养HL 60细胞凋亡的影响。 方法 以脂多糖(L PS )和γ2干扰素(IN F 2γ)诱导RAW 264.7巨噬细胞iNOS 基因的表达产生过量NO 为实验模型,通过
诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与寄生虫感染 转载自中国科技信息网 一氧化氮(NO)在体内由L－精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下生成。它是一种重要的信使分子, 参与血管、气道平滑肌的调节,神经递质的传递,细胞杀伤, 肿瘤细胞的溶解及内分泌激素的释放过程, 与许多疾病的发生、发展密切相关; 既在机体多个系统多种细胞中具有广泛的生理功能，又可能参与多种疾病的发生过程。NOS是合成NO的唯一限速酶，寄生虫感染时，动物机体内由其诱发产生各种细胞因子，细胞因子激发一氧化氮合酶基因,其转录产生iNOS (inducible nitricoxide synthase)mRNA,由iNOSmRNA 指导一氧化氮合酶生成。本文就NOS的类型和iNOS的表达及NO的生成和NO对寄生虫的作用以及影响NO抗寄生虫感染的因素做一简要综述。 1 NOS的类型和iNOS的表达及NO的生成 许多研究表明,NO 是一种重要的细胞内信使和新的神经递质, 又是效应分子[1]。它介导并调节多种生理机制, 在呼吸系统、神经系统、炎症和免疫反应中起着重要的作用, 但也导致病理生理状态。由于NO 可在数种哺乳动物细胞内产生, 在体内又具有广泛的生理作用, 因而这种化学结构如此简单的小分子被美国《Science》杂志评为1992 年年度分子[2]。NOS 根据所在组织类型，在细胞中的分布，效应方式，组织表达，对Ca 2＋/钙调蛋白的依赖性及对不同激动剂的反应，可分为以下3种类型[3]: I型:神经型NOS （ncNOS )，首先于脑组织中发现，所产生的NO为神经递质，也可能作为神经和血管之间的间介物。为结构表达。Ⅱ型:可诱导型NOS (iNOS)，主要存在于单核/巨噬细胞系统、肝脏、平滑肌、神经胶质细胞中，另外在内皮细胞、神经元中也有分布。为非结构表达。Ⅲ型:上皮型NOS(ecNOS)，存在于血管内皮细胞，与ncNOS类似，为结构表达，对Ca2＋/钙调蛋白依赖，分布于胞浆中。在心脏、肠、肾、肝脏和脑等重要脏器的血流量调节以及血管舒张的局部信号机制中占有重要地位。 目前普遍认为, 与抗寄生虫感染密切相关的为iNOS, 主要存在于Mφ中, 也存在于中性粒细胞、神经小胶质细胞和肝细胞等多种细胞内, 细菌脂多糖(LPS)和多种细胞因子都可诱导其高水平表达iNOS。一旦被诱导, iNOS 接着能在相当长时间内以恒定的速度合成大量的NO。由此产生的NO 能选择性地作用于寄生虫或寄生虫感染的细胞, 在局部或全身发挥抗寄生虫作用[4]。Hibbs 等[5～7]在1987 年提出了NO的生化合成途径: 在此途径中, 细胞因子可由寄生虫感染所致。杨志伟等[8] (1999) 发现经血吸虫感染家兔, 虫卵肉芽肿周围有iNOS和巨噬细胞强阳性反应物, 虫卵肉芽肿周围聚集有巨噬细胞、肥大细胞, 并有肿瘤坏死因子TNF－α和表皮生长因子EGF 存在。龙小纯、李雍龙等[9]对小鼠感染血吸虫后不同时间的肝组织总RNA进行RT-PCR，结果表明，未感染血吸虫的小鼠肝组织iNOS的转录表达为阴性，感染后21d,肝组织出现iNOS的转录表达，提示日木血吸虫能诱导宿主肝组织iNOS的转录。还有学者发现在肺内特别是寄生虫周围的炎性组织中有高水平iNOSmRNA[10],表达iNOS基因缺陷小鼠(iNOS-鼠)感染枯氏锥虫后,其体内NO的产生明显减少,并减弱了杀锥虫能力[11]。证实iNOS是合成NO的关键酶。 2 NO抗寄生虫感染的作用机制 在寄生虫感染中,NO一方面能杀死寄生虫,起保护机体的作用,另一方面可能产生相反的作用。关于NO的抗寄生虫作用的确切机制尚不清楚,多数学者认为NO作用于寄生虫的关键代谢酶,使其失活,而发挥抗寄生虫的作用[12]。人们知道,NO与一般的生物效应分子不同,其不需与特异性受体结合,因具有脂溶性,可直接进入寄生虫体内发挥杀伤作用。NO抗寄生虫感染的作用机制可能有二种，一种是NO与寄生虫体内多种代谢酶的活性部位Fe-S基团结合形成铁-亚硝酰基复合物,造成铁离子的丧失和酶活性的抑制,致使能量的产生和DNA的合成受阻,从而干扰寄生虫的生理代谢。NO抗寄生虫作用的另一机制为通过与氧自由基作用。
《酶在细胞代谢中的作用》教学设计 淮安市南陈集中学倪文勤 教学目标： 知识目标： 说明酶在代谢中的作用 能力目标： 1，学会基本的实验操作能力和实验分析能力 2，学会分析、设置实验自变量；观察和检测因变量；控制无关变量以及对照设置方法等 3，根据控制变量，学会简单的实验设计 情感态度价值观： 通过实验培养科学严谨的作风，尊重科学事实的思想。 教学重点： 学会基本的实验操作能力和实验分析能力 教学难点： 1，设计实验并学会控制变量的科学方法 2，酶的作用机理 教学过程： 一、导入：（2分钟） 设计意图：从一个现象说起：生活中利用双氧水消毒实例漫画，从消毒时产生气泡入手，提出过氧化氢分解的反应式，分析提高反应速率的条件，引出实验：比较过氧化氢在不同条件下的分解速率。联系生活实际，直接进入主题，自然过度。 具体过程： 【师】很高兴今天能够和大家一起来探讨一节课，请看下面的漫画。擦上了怎么办？在用过氧化氢消毒的时候，我们能够看到什么现象？ 【生】有气泡冒出 【师】产生气泡的原因是过氧化氢分解了，那么过氧化氢分解的反应式是什么？【生】上黑板板书，2H2O2===2H2O +O2 【师】在生物上，写的方程式没有等号，换成箭头，不需要写气体生成符号。【师】哪些条件能够加速过氧化氢分解呢？ 【生】加热、二氧化锰 【师】今天我们为大家提供的和Mno2一样具有催化作用的Fecl3溶液。还有吗？为什么过氧化氢在消毒时会产生气泡呢？ 【生】细胞加速其分解了 【师】对，人在细胞代谢过程中会产生对细胞有害的物质，如过氧化氢就是其中之一，幸而细胞中含有一种物质，能将过氧化氢及时分解，这种物质就是过氧化氢酶。 二、引导学生实验：（1分钟） 设计意图：通过让学生提出问题——过氧化氢在不同条件下的分解速率，教师引
第11卷 第12期 2009 年 12 月 辽宁中医药大学学报 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Vol. 11 No. 12 Dec .，2009 正常内皮细胞具有抗凝血、抗炎症和抑制血管 增生的功能，也能通过生成一氧化氮（NO）、前列环素和其他血管舒张物质促进血管舒张。许多疾病中，内皮细胞功能障碍是造成血栓形成，炎症和血管舒张功能丧失的共同病理基础。NO 生物利用率降低和活性氧（ROS）过量生成是导致内皮功能紊乱的一个重要因素。许多研究表明,内皮型一氧化氮合酶脱偶联(eNOS uncoupling)是导致NO 水平下降和氧自由基水平升高的重要机制，其中ROS 水平升高又是造成eNOS 脱偶联的主要原因。近年来，对ROS 的病理学作用有了更加深入的认识，ROS 生成和发挥作用都依赖于ROS 相关酶的表达和激活，生理条 件下，正常细胞含有大量的抗氧化物质防御ROS 的 毒性、减少ROS 的效应。ROS 在细胞内产生的位置和抗氧化酶的分布高度区域化，因此，细胞的还原－氧化状态是不均一的。例如，大部分ROS 的产生发生在细胞核、线粒体或者细胞膜上，ROS 对细胞的其他结构影响较小。抗氧化剂以非特异性方式对细胞内总体的还原－氧化平衡的变化进行干预。虽然这些方法的治疗效果还存在争议。但是通过抑制ROS 合成特异性关键酶减少特定区域内的具体的ROS 可以减少氧化应激、逆转eNOS 脱偶联、进而改善血管内皮功能，为防治心血管疾病开辟新的途径。 内皮型一氧化氮合酶脱偶联与氧化应激 张洪平1，唐 宁1, 卞 卡1,2,3 （1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203；2.上海教委一氧化氮和炎症医学E-研究院，上海 201203； 3.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系，德克萨斯大学分子医学研究所，美国 休斯顿 TX77030）摘 要：内皮细胞功能障碍是造成许多心脑血管疾病的共同病理基础。NO 利用率降低和活性氧（ROS）过量生成是导致内皮功能紊乱的一个重要因素。内皮型一氧化氮合酶脱偶联( eNOS uncoupling)是导致NO 水平下降和氧自由基水平升高的重要机制，其中ROS 水平升高又是造成eNOS 脱偶联的主要原因。随着对ROS 病理生理作用认识的不断深入，发现ROS 的生物学作用具有两面性，一方面ROS 与蛋白质、脂质、核酸等生物大分子反应，引发一些病理过程，另一方面ROS 通过不同的信号途径对一些生理过程进行调控。该现象主要是由ROS 分布的区域化造成。通过抑制ROS 合成特异性关键酶减少特定区域内的具体的ROS 减少氧化应激、逆转eNOS 脱偶联、进而改善血管内皮功能，为防治心脑血管疾病提开辟新的途径。 关键词：一氧化氮；信号途径；氧化应激 中图分类号：R2-03 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009) 12- 0036- 05收稿日期：2009-06-19基金项目：国家科技部“十一五”支撑计划资助项目（2006BAI11B08-03）；上海市科委基础研究重点项目（08430711300, 08DZ1972104）； 上海市教委高校一氧化氮与炎症医学E-研究院计划项目（E-04010）作者简介：张洪平（1978-），男，山东聊城人，博士研究生，研究方向：心血管药理学与炎症医学。通讯作者：卞卡（1958-），男，浙江杭州人，教授，博士生导师，博士，研究方向：心脑血管药理学与炎症医学。E-mail：Kabian3@https://www.doczj.com/doc/d38030256.html,。 Endothelial Nitric Oxide Synthase Uncoupling And Oxidative Stress ZHANG Hong-ping 1, TANG Ning 1, BIAN Ka 1, 2, 3 （1. Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. E-Institute of Shanghai Universities, Division of Nitric Oxide and Inflammatory Medicine, Shanghai 201203, China; 3. Department of Integrative Biology and Pharmacology, Institute of Molecular Medicine, University of Texas Medical School, Houston TX77030, USA） Abstract： Endothelial dysfunction is the common pathological base for a number of cardiovascular diseases. Reduction of NO bioavailability and excessive generation of reactive oxygen species (ROS) are key factors which cause endothelial dysfunction. Endothelial nitric oxide synthase uncoupling (eNOS- uncoupling) is an important mechanism underlying the pathological phenomenon of reduced NO production and enhanced free radicals generation. Higher level of ROS is the major cause of eNOS-uncoupling which exerts influence on protein structure, co-factor as well as the substrate of eNOS. Furthermore, the dual effects of ROS also attract the attention: on the one hand, ROS react with biological macromolecules such as proteins, lipids, nucleic acids, which results a number of pathological consequences. On the other hand, ROS is necessary for certain physiological signaling. The compartmental effects of ROS should be responsible for above phenomenon. Inhibition of ROS in specific region may open up novel pathway for the prevention and treatment of cardiovascular diseases through the means of blocking key ROS synthesis enzymes; preventing and reversing eNOS uncoupling, and improving endothelial function. Key words：nitric oxide; signaling pathway; oxidative stress