小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)水平。用纯化的小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，再与HRP标记的iNOS抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)浓度。
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心
20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备
用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标
准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为480 pg/ml ，320pg/ml ，160 pg/ml，80 pg/ml ，40 pg/ml）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：Array以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批见应分别小于9%和15%
检测范围：
20 pg/ml – 500 pg/ml
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月
Mouse inducible nitric oxide synthase
Drug Names
Generic Name：Mouse inducible nitric oxide synthase (iNOS) ELISA Kit.
Purpose
This kit allows for the determination of iNOS in Mouse serum, blood plasma, and other biological fluids.
Principle of the assay
T he kit assay Mouse iNOS level in the sample，use Purified Mouse iNOS antibody to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add iNOS to wells, Combined iNOS antibody which With HRP labeled , become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of iNOS in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
Materials provided with the kit
Specimen requirements
1.serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of
2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.
2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20
mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.
3.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.
remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.
4.cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container,
centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.
5.Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）, Rapidly
frozen with liquid nitrogen, maintain samples at 2-8℃ after melting,add PBS（PH7.4）, Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.
remove supernatant.
6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevant
literature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.
7.Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active. Assay procedure
1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add Standard 100μl to the first and the second well, then add Standard dilution50μl to the first and the second well, mix; take out 100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately. then add Standard dilution 50μl to the third and the forth well ,mix ; then take out 50μl from the third and the forth well discard, add 50μl to the fifth and the sixth well ,then add Standard dilution 50μl to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standard dilution 50μl to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard dilution 50μl to the ninth and the tenth well, mix , take out 50μl from the ninth and the tenth well discard(add Sample 50μl to each well after Diluting ,(density: 480 pg/ml ，320pg/ml ，160 pg/ml，80 pg/ml ，40 pg/ml)
2.add sample：Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is 5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.
3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.
4.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.
5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.
6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.
7.incubate：Operation with 3.
8.washing：Operation with 5.
9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃
10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color change to yellow color).
11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.
Important notes
1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes in
the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should be stored in Sealed bag.
2.washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolve
when dilute . Washing does not affect the result.
3.add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids the
experimental error. add sample within 5 mins, if the number of sample is much , recommend to use Volley .
4.if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the first
standard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.
5.Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.
6.The substrate evade the light preservation.
7.Please according to use instruction strictly, The test result determination must take the
microtiter plate reader as a standard.
8.All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective material
process.
9.Do not mix reagents with those from other lots.
Calculate
Assay range
20 pg/ml – 500 pg/ml
Storage and validity
1．Storage ： 2-8℃. 2．validity ： six months.
Take the standard density as the horizontal, the OD value for the vertical ,draw the standard curve on graph paper, Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the sample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor, the result is the sample actual density.
This chart for reference only
小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)水平。用纯化的小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，再与HRP标记的iNOS抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为480 pg/ml ，320pg/ml ，160 pg/ml，80 pg/ml ，40 pg/ml）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
胃蛋白酶（Pepsin）试剂盒使用说明 分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2320 规格：50/24S 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入25mL试剂二充分溶解。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入25mL蒸馏水充分溶解。 试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入30mL蒸馏水充分溶解。 试剂六：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，0.5μmol/mL酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。 产品说明： 胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌，分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别，慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。 胃蛋白酶可催化血红蛋白水解，水解产物与福林试剂反应后显蓝色；一定范围内，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。 自备仪器和用品： 研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、冰和蒸馏水。 操作步骤：
一、粗酶液提取： 组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min，调节波长到580nm，蒸馏水调零。 2.试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。 3.标准管：取EP管，加入100μL标准品，200μL试剂二，600μL试剂五，100 μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580nm测光吸收，记为A标准管。 4.空白管：取EP管，加入100μL蒸馏水，200μL试剂二，600μL试剂五，100 μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580nm测光吸收，记为A空白管。 5.对照管：取EP管，加入500μL试剂三，置于37℃水浴保温10min；加入500 μL试剂四，盖紧后摇匀1min；加入100μL粗酶液，混匀后8000g4℃离心10分钟； 取上清液100μL，加入新EP管，再加入200μL试剂二，600μL试剂五，100μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580nm测光吸收，记为A对照管。 6.测定管：取EP管，加入100μL粗酶液，500μL试剂三，置于37℃水浴保温 10min；加入500μL试剂四，盖紧后摇匀1min；8000g4℃离心10分钟；取上清液100μL，加入新EP管，再加入200μL试剂二，600μL试剂五，100μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580nm测光吸收，记为A测定管。 注意：空白管和标准管只需要测定一次。 三、计算公式： 1)按照蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。 胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管
小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一) 作者：刘霞包翠芬张晓明穆长征 【摘要】目的：对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。方法：分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量，SPSS10.0统计软件包统计分析。结果：新生组酶含量最高为100%,随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4%。结论：这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。 【关键词】小鼠;肾;神经型一氧化氮合酶 一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)〔1〕。目前对肾发生发育过程中NO和NOS的研究还刚刚起步,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。 1材料和方法 1.1实验动物与分组
成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。 1.2主要试剂 nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。 1.3Westernblot步骤 各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm离心10min,留取上清液。用Bradford 法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。 配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μlSDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用 溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min；再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释
胰蛋白酶活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2310 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水充分溶解。 试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。 胰蛋白酶催化水解BAEE的酯键，生成BA，BA在253nm处有吸收峰，通过测定253nm吸光度增加速率，即可计算出胰蛋白酶的活性。 自备仪器和用品： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g样品，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000rpm4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。或者直接称取1mg酶粉，加1mL提取液，充分混匀后置冰上待测（为保证实验的准确性建议梯度稀释）。 二、测定： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到253nm，蒸馏水调零。 第1页共2页
2.工作液的配制：将试剂一与试剂二按2:97配置工作液，按需配制，并置于37℃水浴预热30min以上。 3.空白管：取1mL石英比色皿，加入990μL工作液，再加入10μL蒸馏水，混匀，迅速于253nm测定0s 和60s的吸光度，分别记为A1、A2，△A空白=A2-A1。 4.测定管：取1mL石英比色皿，加入990μL工作液，再加入10μL粗酶液，混匀，迅速于253nm测定0s 和60s的吸光度，分别记为A3、A4，△A测定=A4-A3。 三、胰蛋白酶活性计算： 1.按蛋白浓度计算： 活性单位（U）定义：在1mL体系下，37℃每毫克蛋白质每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为一个单位。胰蛋白酶（U/mg prot）=(△A测定-△A空白)÷0.001÷（Cpr×V1）÷T =100000×(△A测定-△A空白)÷Cpr 2.按样本鲜重计算： 活性单位（U）定义：在1mL体系下，37℃每克组织每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为一个单位。 胰蛋白酶（U/g鲜重）=(△A测定-△A空白)÷0.001÷（W×V1÷V2）÷T =100000×(△A测定-△A空白)÷W Cpr：粗酶液蛋白质浓度（需要另外测定），mg/mL；W：样本鲜重，g； V1：加入反应体系中粗酶液体积，10μL=0.01mL；V2：粗酶液总体积，1mL； T：反应时间，1min。 注意事项： 实验前用1～2个样做预实验，保证吸光值变化在0.01～0.15之间。 第2页共2页
小鼠小鼠一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶(NOS)(NOS)(NOS)酶联免疫酶联免疫酶联免疫分析分析分析 试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围检测范围：： 96T 1μmol/L - 32μmol/L 使用目的使用目的：： 本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的小鼠一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP 标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（64μmol/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B 液 6ml ×1/瓶 12 密封袋 1个 标本标本要求要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 32μmol/L 5号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 16μmol/L 4号标准品 150μl 的5号标准品加入150μl 标准品稀释液 8μmol/L 3号标准品 150μl 的4号标准品加入150μl 标准品稀释液 4μmol/L 2号标准品 150μl 的3号标准品加入150μl 标准品稀释液 2μmol/L 1号标准品 150μl 的2号标准品加入150μl 标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
SUMO蛋白酶使用说明 货号：P2070 规格：1000U(200μL) 产品内容： 试剂名称规格保存温度 SUMO蛋白酶（5U/μL）200μL-80℃ SUMO Protease Buffer1mL×2-20℃ 产品说明： SUMO蛋白酶也称Ulp，是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，它能识别SUMO蛋白的三级结构，而不是氨基酸序列，因此可以高效而且特异性地将SUMO蛋白从重组融合蛋白上切割下来。SUMO蛋白酶在较宽范围的反应环境体系中能保持较高的活性，如温度（4-30℃），PH(5.5-9.5)等，SUMO蛋白酶带有多聚His标签，便于融合蛋白切割后利用亲和层析去除该蛋白酶。 保存条件： SUMO蛋白酶-80℃长期保存，可存储2年；首次使用后可置于-20℃保存，避免反复冻融。SUMO Protease Buffer可置于-20℃保存。 酶活定义： 在1×SUMO Protease Buffer(50mM Tris-HCl,1mM DTT,pH8.0)中，30℃反应1h，剪切>85％的2μg底物所需要的酶量定义为一个活性单位。 使用方法说明： 1.SUMO蛋白酶与需要酶切的目的蛋白比例：1：100。
2.酶切体系： 融合蛋白1000μg SUMO Protease Buffer20μL SUMO蛋白酶2μL ddH O定容至1000μL 2 3.酶切条件：推荐4℃酶切过夜，用户可以根据自己研究的目的蛋白进行摸索，以下酶切分析图片可供参考。 4.酶切后可取少量样本进行SDS-PAGE分析，若要去除酶切后体系中的SUMO蛋白酶，可用His标签纯化树脂亲和层析。 酶切后电泳分析图: 4℃酶切3h;5h;6h;7h;8h;10h;12h;22h后SDS-PAGE电泳图。 注意事项： 1.为达到最好的酶切效果，请保证重组蛋白为部分或完全纯化的蛋白。
Therapeuti c effects of a sp i r i n and m echan is m s of a sp i r i n resist ance HUA Yi2nan,X I E Mei2lin (D ept of Phar m acology,M edical School of Suzhou U niversity,Suzhou 215123,China) Abstract:A s p irin is one of the maj or drugs used f or p reventing ather othr ombotic vascular diseases,but not effective t o all patients or s o2called as p irin resistance. However,the mechanis m s of this resistance still re2 mains t o be elucidated.The recent p r ogresses is re2vie wed in the therapeatic effect of as p irin and mecha2 nis m s of the drug resistance. Key word:as p irin;as p irin resistance;thr ombosis; p latelet;mechanis m 内皮型一氧化氮合酶脱偶联的研究进展郑建普1,卞 卡1,2,3,可 燕1,2,Murad Ferid1,3 (1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心,上海 201203;2.上海高校一氧化氮与炎症医学研究院,上海 201203;3.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系,德克萨斯大学分子医学研究所,休斯顿 T X77030) 中国图书分类号:R205;R28911;R345144;R5431023; R7431023;R91613;R97713;R97714 文献标识码:A文章编号:1001-1978(2006)06-0659-05摘要:血管内皮功能障碍(endothelial dysfuncti on)是多种心脑血管疾病的共同病理机制,其突出表现为内皮依赖性血管舒张功能障碍,主要由NO减少及氧自由基增加所致。最新研究发现,内皮型一氧化氮合酶脱偶联(e NOS uncoup ling)是导致NO水平下降和氧自由基水平升高的重要机制,是高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病中内皮功能障碍的重要原因。通过纠正e NOS脱偶联可有效改善内皮功能,有望为保护血管内皮功能提供有效途径。 关键词:e NOS脱偶联;内皮功能障碍;一氧化氮;氧化应激;四氢生物蝶呤 血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)是分布于所有血管内侧的单层纵向细胞,在调节血管舒缩状态、凝血和纤溶,防止有害脂蛋白浸 收稿日期:2006-02-22,修回日期:2006-04-16 基金项目:上海市教委高校一氧化氮与炎症医学E研究院计划资助项目(No E204010);上海市教委重点科研资助项目(No 05ZZ11);上海市科委基础研究重点资助项目(No 05JC14056) 作者简介:郑建普(1979-),男,博士生,研究方向:心血管药理学与炎症医学,Tel:021*********,E2mail:je mpoo.tseng@ g https://www.doczj.com/doc/078933101.html,; 卞 卡(1958-),男,教授,博士生导师,研究方向:心脑 血管药理学与炎症医学,通讯作者,Tel:021*********,E2 mail:Ka.B ian@uth.t m https://www.doczj.com/doc/078933101.html, 润及氧自由基损伤等方面起重要作用。大量实验研究证明,正常的血管内环境是抵御心血管疾病的基础防线,内皮细胞的健康与否直接关系到血管内环境的稳定,而一氧化氮(nitric oxide,NO)信息系统的健全又是内皮细胞发挥生理作用的关键。正常生理条件下,血管系统中的NO主要源于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS),发挥扩张血管、调节血压、抑制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等作用[1]。近年来,大量的基础及临床资料进一步证实,在诸如高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、糖尿病及长期吸烟等病理情况下, e NOS出现功能障碍,此时e NOS不再生成NO而是产生超氧阴离子,造成NO生物利用度降低及氧化应激(oxidative stress)增加,导致或加重内皮功能障碍,该现象被称为e NOS脱偶联(e NOS uncoup2 ling)[2,3]。 1 eN O S脱偶联的产生机制 e NOS脱偶联的产生机制主要有:①NO生成底物L2精氨酸(L2arginine,L2A rg)不足,使本应转移到L2A rg的电子转移到O2从而产生超氧阴离子(O? 2 );②NO生成的重要辅助因子四氢生物蝶呤 (tetrahydr obi op terin,BH4)供应不足,导致主要的终 产物是O? 2 ,而不是NO;③氧化应激使e NOS结构发生改变从而导致活性下降。 1.1 L2Arg与eN O S脱偶联 L2A rg是人体的半必需氨基酸之一,也是NO合成的底物。L2A rg在生理 浓度下,电子由NADPH转移到F AD,生成F ADH 2 , ? 9 5 6 ? 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6):659～63
人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒使用说明书 Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置 标准品稀释液：1.5ml×1瓶 酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96） 【人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用 计算： 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 试剂盒组成： 封板膜:2片（48）/2片（96） 说明书:1份 密封袋:1个 标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存 酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存 样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存 浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的人一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人一氧化氮合成酶(NOS)浓度。 目的：本试剂盒用于测人血清，血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)的含量。 服务承诺： 供货期：款到发货。 工作时间内免费的技术咨询和指导。请来电咨询 为客户提供来样检测服务，最大限度实验结果的有效性(免费代测)。 保存条件及有效期： 试剂盒保存：2-8℃| 有效期：6个月 【人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒】样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一) 关键词：巨噬细胞肺泡一氧化氮合酶肿瘤活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用〔1〕。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺MNOS 活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。1材料和方法 1.1肺M的制备及培养体质量20～25g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1ml,共15次。将回收的灌洗液以1500r/min离心10min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5%CO2培养2h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200U/ml)的干扰素γ（INFγ）,继续培养24h。 1.2肿瘤细胞培养上清液的收集将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞P815(上海肿瘤研究所提供)以5×105个/ml的密度培养在RPMI1640培养液中,置37℃,5%CO2培养箱培养48h,2500r/min离心20min,取上清液,置-20℃保存待用。 1.3iNOS活性测定用Smith薄层层析法〔2〕测定上清液培养标本中瓜氨
酸(citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。 1.4NO测定10mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式〔3〕。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、 2.5%磷酸),室温放置10min，545nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。 1.5肺M肿瘤杀伤活性测定在培养板内加入肺M悬液100μl/孔，实验组再加入2mmol/LNG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50μl/孔，置37℃，5%CO2培养箱培养4h，再加入含10%P815上清液的营养液100μl/孔，置37℃,5％CO2培养72h。每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl,混匀静置20min,在PG-3022酶联仪上用570nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。 1.6统计学处理所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t 检验，各指标进行直线相关分析。 2结果 2.1不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响不同剂量的INFγ与活化的肺M共同培养24h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。 图1INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响 fig1TheeffectofINFγonNOproductionand activityofiNOSbymacrophages
PEG 10mRNA 的抑制作用最强,表明靶mRNA 的 二级结构对siRNA 的功能有很大影响。 本研究中我们构建针对PEG 10基因的siRNA 真核表达载体,并通过酶切鉴定和测序鉴定,说明我们构建的针对PEG 10的真核表达载体是正确有效的,可以用于后续PEG 10基因功能的研究,以及沉默PEG 10后抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,从而为肝癌的基因治疗提供理论依据和实验工具。 参考文献: [1] Ryuichi Ono ,Shin K obayashi ,Hirotaka Wagat suma ,et al.A retrotransposon 2derived gene ,PEG 10,is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q 21[J ]. Genomics , 2001,73(2):2322237. [2] Noble A ,Towne C ,Chopin L ,et al.Insulin 2like growt h fac 2 tor 2Ⅱbound to vitronectin enhances MCF 27breast cancer cell migration[J ].Endocrinology ,2003,144(6):241722424.[3] Moorehead RA ,Sanchez O H ,Baldwin RM ,et al.Transgenic overexpression of IGF 2Ⅱindues spontaneous lung tumors :a model for human lung adenocarcinoma [J ].Oncogene ,2003, 22(6):8532857. [4] Vella V ,Sciacca L ,Pandini G ,et al.The IGF system in t hy 2 roid cancer :new concept s[J ].Mol Pat hol ,2001,54(3):1212 124. [5] Tsou AP ,Chuang YC ,Su J Y ,et al.Overexpression of a no 2 vel imprinted gene ,PEG 10,in human hepatocellular carcino 2ma and in regenerating mouse livers [J ].J Biomed Sci ,2003, 10(6Pt 1):6252635. [6] Hiroshi Okabe ,Seiji Satoh ,Y oichi Furukawa ,et al.Involve 2 ment of PEG 10in human hepatocellular carcinogenesis t hrough interaction wit h SIA H 1[J ].Cancer Research ,2003,63(12): 304323048. [7] 常莹,陶璐薇,陈孝平,等.肝癌组织中遗传印记基因PEG 10 表达的特异性及其意义[J ].世界华人消化杂志,2005,13 (12):140821411. [8] Naito Y ,Yamada T ,Ui 2Tei K ,et al.siDirect :highly effec 2 tive ,target 2specific siRNA design software for mammalian RNA interference [J ].Nucleic Acids Res ,2004,32:W 1242 129. [9] Reynolds A ,Leake D ,Boese Q ,et al.Rational siRNA design for RNA interference[J ].Nat Biotechnol ,2004,22(3):3262 330. [编辑:刘红武] 收稿日期:2006202221;修回日期:2006204214基金项目:怀化市科技计划资助项目(0502) 作者单位:1.418000湖南怀化医学高等专科学校检验 系;2.中国科学院生物物理研究所结构与分子生物学研究 中心作者简介:张申(1955-),男,学士,教授,主要从事自由 基生物学研究 巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的NO 对共培养HL 60细胞凋亡的影响 张 申1,尹利华1,卫涛涛2 E ffects of Inducible Nitric Oxide Synthase Derived Nitric Oxide on Apoptosis of H L 60Cells Co 2cultured with RAW 264.7Macrophages ZHAN G Shen 1,YIN Li 2hua 1,WEI Tao 2tao 2 1.De partment of L aboratory Medicine ,H uai hua Medical College ,H uai hua 418000,China; 2.Center f or S t ructural and Molecular B iology ,I nstitute of B iophysics ,Chinese A cadem y of Sciences Abstract :Objective To study effects of inducible nitric oxide synthase (iNOS )2derived nitric oxide (NO )on apoptosis of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7macrophages.Methods Upon stimulation with lipopolysaccharide (L PS )and interferon 2 γ(IFN 2γ),inducible nitric oxide synthase gene was expressed in RAW 264.7macrophages ,which caused the consequent generation of nitric oxide.Effects of nitric oxide on HL 60cells viability ,expression of bcl 22and bax protein ,activity of Caspase 23and cell apoptosis were evaluated with M T T assay ,Western blot analysis ,fluorescence analysis ,flow cytometry (FCM ),trans 2mission electron microscopy (TEM )and DNA agarose gel electrophoresis.R esults The results showed that iNOS 2derived nitric oxide caused oxidative damage of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7mac 2rophages ,and decreased cell viability ,and evidently reduced expression of bcl 22and increased expression of bax ,and induced activity of caspase 23and DNA f ragmentation.Conclusion The results suggested im 2portant effect of iNOS 2derived nitric oxide on apoptosis of cells in RAW 264.7macrophages. K ey w ords : Inducible nitric oxide synthase ;Nitric oxide ;Apoptosis ;Mac 2 rophage 摘 要:目的 研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iN 2OS )来源的一氧化氮(NO )对共培养HL 60细胞凋亡的影响。 方法 以脂多糖(L PS )和γ2干扰素(IN F 2γ)诱导RAW 264.7巨噬细胞iNOS 基因的表达产生过量NO 为实验模型,通过
货号: QS2303 规格：50管/48样胰蛋白酶（Trypsin）试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。 测定原理： 胰蛋白酶催化水解BAEE的酯键，生成BA，BA在253nm处有吸收峰，通过测定253nm 吸光度增加速率，即可计算出胰蛋白酶的活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到253 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于37℃水浴预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入10μL蒸馏水，100μL试剂二，900μL试剂三，迅速混匀于253nm测定0s和60s的吸光度A1和A2，△A空白= A2-A1。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入10μL粗酶液，100μL试剂二，900μL试剂三，迅速混匀于253nm测定0s和60s的吸光度A3和A4，△A测定= A4-A3。 胰蛋白酶活性计算公式： (1) 按照蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃每毫克蛋白质每分钟催化253nm处吸光值增加1为1个酶活单位。 胰蛋白酶（U/mg prot）= (△A测定-△A空白) ×V反总÷（Cpr×V1）÷T =101×(△A测定-△A空白) ÷Cpr Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），10μL=0.01 mL；V反总：反应总体积，1.01mL；T：反应时间（min），1min。 （2）按照样本质量计算 活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化253nm处吸光值增加1为1个酶活单位。 胰蛋白酶（U/g鲜重）= (△A测定-△A空白) ×V反总÷（W×V1÷V2）÷T 第1页，共2页
诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与寄生虫感染 转载自中国科技信息网 一氧化氮(NO)在体内由L－精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下生成。它是一种重要的信使分子, 参与血管、气道平滑肌的调节,神经递质的传递,细胞杀伤, 肿瘤细胞的溶解及内分泌激素的释放过程, 与许多疾病的发生、发展密切相关; 既在机体多个系统多种细胞中具有广泛的生理功能，又可能参与多种疾病的发生过程。NOS是合成NO的唯一限速酶，寄生虫感染时，动物机体内由其诱发产生各种细胞因子，细胞因子激发一氧化氮合酶基因,其转录产生iNOS (inducible nitricoxide synthase)mRNA,由iNOSmRNA 指导一氧化氮合酶生成。本文就NOS的类型和iNOS的表达及NO的生成和NO对寄生虫的作用以及影响NO抗寄生虫感染的因素做一简要综述。 1 NOS的类型和iNOS的表达及NO的生成 许多研究表明,NO 是一种重要的细胞内信使和新的神经递质, 又是效应分子[1]。它介导并调节多种生理机制, 在呼吸系统、神经系统、炎症和免疫反应中起着重要的作用, 但也导致病理生理状态。由于NO 可在数种哺乳动物细胞内产生, 在体内又具有广泛的生理作用, 因而这种化学结构如此简单的小分子被美国《Science》杂志评为1992 年年度分子[2]。NOS 根据所在组织类型，在细胞中的分布，效应方式，组织表达，对Ca 2＋/钙调蛋白的依赖性及对不同激动剂的反应，可分为以下3种类型[3]: I型:神经型NOS （ncNOS )，首先于脑组织中发现，所产生的NO为神经递质，也可能作为神经和血管之间的间介物。为结构表达。Ⅱ型:可诱导型NOS (iNOS)，主要存在于单核/巨噬细胞系统、肝脏、平滑肌、神经胶质细胞中，另外在内皮细胞、神经元中也有分布。为非结构表达。Ⅲ型:上皮型NOS(ecNOS)，存在于血管内皮细胞，与ncNOS类似，为结构表达，对Ca2＋/钙调蛋白依赖，分布于胞浆中。在心脏、肠、肾、肝脏和脑等重要脏器的血流量调节以及血管舒张的局部信号机制中占有重要地位。 目前普遍认为, 与抗寄生虫感染密切相关的为iNOS, 主要存在于Mφ中, 也存在于中性粒细胞、神经小胶质细胞和肝细胞等多种细胞内, 细菌脂多糖(LPS)和多种细胞因子都可诱导其高水平表达iNOS。一旦被诱导, iNOS 接着能在相当长时间内以恒定的速度合成大量的NO。由此产生的NO 能选择性地作用于寄生虫或寄生虫感染的细胞, 在局部或全身发挥抗寄生虫作用[4]。Hibbs 等[5～7]在1987 年提出了NO的生化合成途径: 在此途径中, 细胞因子可由寄生虫感染所致。杨志伟等[8] (1999) 发现经血吸虫感染家兔, 虫卵肉芽肿周围有iNOS和巨噬细胞强阳性反应物, 虫卵肉芽肿周围聚集有巨噬细胞、肥大细胞, 并有肿瘤坏死因子TNF－α和表皮生长因子EGF 存在。龙小纯、李雍龙等[9]对小鼠感染血吸虫后不同时间的肝组织总RNA进行RT-PCR，结果表明，未感染血吸虫的小鼠肝组织iNOS的转录表达为阴性，感染后21d,肝组织出现iNOS的转录表达，提示日木血吸虫能诱导宿主肝组织iNOS的转录。还有学者发现在肺内特别是寄生虫周围的炎性组织中有高水平iNOSmRNA[10],表达iNOS基因缺陷小鼠(iNOS-鼠)感染枯氏锥虫后,其体内NO的产生明显减少,并减弱了杀锥虫能力[11]。证实iNOS是合成NO的关键酶。 2 NO抗寄生虫感染的作用机制 在寄生虫感染中,NO一方面能杀死寄生虫,起保护机体的作用,另一方面可能产生相反的作用。关于NO的抗寄生虫作用的确切机制尚不清楚,多数学者认为NO作用于寄生虫的关键代谢酶,使其失活,而发挥抗寄生虫的作用[12]。人们知道,NO与一般的生物效应分子不同,其不需与特异性受体结合,因具有脂溶性,可直接进入寄生虫体内发挥杀伤作用。NO抗寄生虫感染的作用机制可能有二种，一种是NO与寄生虫体内多种代谢酶的活性部位Fe-S基团结合形成铁-亚硝酰基复合物,造成铁离子的丧失和酶活性的抑制,致使能量的产生和DNA的合成受阻,从而干扰寄生虫的生理代谢。NO抗寄生虫作用的另一机制为通过与氧自由基作用。