实验一酵母细胞的固定化 一、实验原理与目的 原理：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或者细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法，化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。 常用的包埋载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作为载体包埋酵母菌细胞。 目的：了解细胞固定化的原理；掌握酵母细胞固定化实验操作。 二、仪器与用具 仪器：50ml烧杯、200ml烧杯、玻璃棒、量筒、酒精灯、石棉网、针筒、三角瓶、水浴锅、恒温箱。 化学材料：活化酵母菌（酵母悬液）、蒸馏水、无水CaCl2、海藻酸钠、葡萄糖。 三、试剂配制 1、0.05mol/L的CaCl2溶液150ml； 2、海藻酸钠溶液：每0.7g海藻酸钠加入10ml水加热溶液成糊状； 3、10%葡萄糖溶液150ml。 四、实验方法与步骤 1、干酵母活化：1g干酵母+10ml蒸馏水→50ml烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。 2、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞，用玻璃棒充分搅拌混合均匀。 3、固定化酵母细胞：用20ml注射器吸取海藻酸钠与酵母细胞混合液，在恒定的高度（建议距液面12~15cm处，过低凝胶珠形状不规则，过高液体容易飞溅），缓慢将混合液滴加到CaCl2中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
4、固定化酵母细胞发酵：用5ml移液器吸取蒸馏水冲洗固定好的凝胶珠2~3次，然后加入装有150ml10%葡萄糖溶液的三角瓶中，置于25℃发酵24h，观察结果。 实验开始时，凝胶球是沉在烧杯底部，24h后，凝胶球浮在溶液悬浮在上层，而且可以观察到凝胶球并不断产生气泡，说明固定化的酵母细胞正在利用溶液中的葡萄糖产生酒精和二氧化碳，结果凝胶球内包含的二氧化碳气泡使凝胶球悬浮于溶液上层。 五、结果观察：打开瓶盖，闻气味，观察葡萄糖液中的变化。 六、思考题 1、酵母细胞活化的目的是什么？ 2、为什么凝胶珠需要在CaCl2溶液中浸泡一定时间？ 3、观察结果说明了什么问题？ 4、分析可能导致酵母细胞包埋效果不理想的原因。
酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌，外源蛋白的展示主要是借助于GPI锚的作用，GPI锚定蛋白的C端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成，前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上，其余蛋白则位于内质网腔中。在极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶的作用下ω位点裂开同时被GPI锚置换，并被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被切除，细胞蛋白被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C从细胞膜上释放并以GPI锚定形式与葡聚糖共价相连被转运至细胞壁外。图1展示的是通过α-凝集素系统转运目的蛋白到细胞表面的分泌途径。酵母表面展示技术具有表达偏差小，展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多，筛选、纯化、活性测定方便等优点。 目前，最常见的酵母表面展示系统包括：凝集素展示表达和絮凝素展示表达[5]。如图2所示，α-凝集素展示表达系统(图2A)是将外源基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接后插入质粒载体的分泌信号肽(Secretion signal，SS)下游，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌，由于融合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号(GPIanchor attachment signal)的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁上，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面；a-凝集素展示系统(图2B)与α-凝集素展示系统不同的是其具有由二硫键连接的Aga1和Aga2两个亚基，目的蛋白通过与Aga2形成融合蛋白，再通过Aga1末端的GPI结构使目的蛋白表达于细胞表面；絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因(flo1p)与外源基因融合，并将融合蛋白展示表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统：GPI锚定
教学准备 1. 教学目标 （一）知识与技能 1、识记固定化技术的常用方法 2、理解固定化酵母细胞的制备过程 3、知道固定化酶的实例 （二）过程与方法 1、固定化细胞技术 2、制备固定化酵母细胞的过程 （三）情感、态度与价值观 通过固定化技术的发展过程，培养科学探究精神，同时领会研究的科学方法。 2. 教学重点/难点 1、课题重点：制备固定化酵母细胞 2、课题难点：制备固定化酵母细胞 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 （一）引入新课 在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。如果你是工程技术人员，你如何解决这个问题？ （二）进行新课 1、基础知识
1.1固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 1.2固定化酶技术的优点： （1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离； （2）固定在载体上的酶可以被反复利用。 2、固定化酶的应用实例――生产高果糖浆 （1）高果糖浆的生产原理 （2）葡萄糖异构酶固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。 （3）高果糖浆的生产操作（识图4－5反应柱）： 从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应柱可连续使用半年。 （4）高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。 （5）生产高果糖浆需要葡萄糖异构酶；其作用是将葡萄糖转化为果糖；这种酶稳定性好，可持续发挥作用。 3、固定化技术的方法（识图4－6固定方法）： 细胞中含有一系列酶，在细胞正常生命活动的过程中，通过代谢产生所需要的代谢产物。 利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间的技术。 将酶和细胞固定化方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法。有。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。 可采用固定化细胞技术。
1．下图所示的固定化方式中，适宜固定化酶的是() A．①②③B．①② C．②③D．①③ 2．下列关于固定化技术的叙述，不正确的是() A．从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶更容易 B．固定化细胞比固定化酶对酶活性影响更小 C．固定化细胞固定的是一种酶 D．将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细胞 3．下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是() A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显 B．在固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧 C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件 D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物 4．在制备固定化酵母细胞的实验中，CaCl2溶液的作用是 () A．用于调节溶液pH B．用于进行离子交换 C．用于胶体聚沉 D．用于为酵母菌提供Ca2＋ 5．下列有关利用固定化酶技术生产高果糖浆的说法不正确的是() A．葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成的是果糖 B．从固定化酶反应柱下端流出的只有果糖 C．高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管疾病，对人类的健康更有益 D．酶溶解于葡萄糖溶液后，可从糖浆中回收 6．制备好的凝胶珠是否符合应用要求，常用的检测方法有() ①挤压法②摔打法③观察法④培养法
A．①②④B．①③④ C．②③④D．①②③ 【解析】检测凝胶珠是否合格，经常使用下列检测方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。还可以通过观察凝胶珠的颜色和形状来判断。 7．下列有关固定化酵母细胞及使用过程中，错误的是() A．干酵母活化的时间大约为1小时 B．将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞 C．检测是否有酒精发酵的有效指标之一为是否有气泡发生 D．将海藻酸钠与酵母菌的混合液缓缓滴加到氯化钙溶液中，即形成固定化细胞颗粒 8．关于固定化酶中酶的说法，正确的是() A．酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应 B．酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用 C．酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去D．固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点9．如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是() A．实验中所用的固定化果胶酶由海藻酸钠直接包埋获得 B．为防止杂菌污染，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌 C．通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行 D．固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新填装反应柱 【解析】酶的固定化一般不用包埋法，A错误；瞬间高温灭菌会使固定化酶失去活性，B错误；加入苹果汁后可关闭控制阀一段时间，再通过减慢苹果汁流出的速率，让底物与酶充分接触，使反应充分进行，C正确；固定化果胶酶可重复使用，D错误。 10．如图为固定化酵母细胞及其应用的相关图解，请据图回答问题：
细菌表面展示技术讲稿(详细 版) 标准化文件发布号：（9312-EUATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
细菌表面展示（bacterial cell－surface display）技术 的发展及应用 各位同学大家好，今天我们为大家带来的是：细菌细胞表面展示技术，严谨的科学定义是：指通过重组 DNA 技术，将外源功能蛋白表达并定位于特定细菌细胞的表面，以达到一定的研究与应用目的是一项新的蛋白质应用技术。这句话该怎么理解：一般基因工程需要把蛋白提取出来，最好是菌体可以把蛋白分泌到菌体外，表面展示技术是把目的蛋白表达在细胞表面，外源蛋白的这种表面锚定有4个好处：1.可以使特定的反应在细胞表面直接发生而提高反应效率，2.能克服某些大分子底物不能穿越细胞膜而进入胞内，3客服某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端，4.使产物的提取纯化过程简化。 接下来，我组将从发展史，菌体构建，技术应用，未来展望4各方面为大家介绍。 1.发展史 大多数生物技术都是经历了噬菌体——细菌——真核（酵母菌）的三个发展应用阶段，表面展示技术也不例外。包括：1985年Smith等人创建噬菌体表面展示技术，次年， Freudl 报道细菌表面展示技术，以及近年来兴起的酵母菌表面展示技术与杆状病毒表面展示系统。 噬菌体表面展示技术：该展示系统是最早发展起来的,历经20多年发展,现在最常用的噬菌体表面展示系统主要有:丝状噬菌体、K噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体展示系统。噬菌体表面展示技术具有表面展示技术的基本优点,而且技术发展相对成熟,但由于载体自身的限制,使得该展示系统存在着很大缺点。比如,外源蛋白的插入可能影响噬菌体的装配,使其失去感染力;多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达时存在不可预测的偏差性等。 酵母菌表面展示系统：酵母表面展示系统是近年发展起来的一种重要的真核蛋白表面展示系统。酿酒酵母是具有细胞壁的单细胞真核微生物,是目前常见的酵母表面展示系统载体蛋白来源。根据交配型的差异分为MATa和MATA两种单倍体,其细胞表面分别表达a或A凝集素,它们是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋白,可介导细胞间的性黏附使细胞融合。目的蛋白可分别与a或A凝集素融合,展示于酵母细胞表面。与细菌相比,酿酒酵母在表面展示技术上的应用具有许多优势:(1)具有公认的安全性;(2)其蛋白质折叠和分泌方式与哺乳动物相似,展示哺乳类蛋白优于细菌系统;(3)具有众所周知的发酵特性;(4)展示的蛋白质可通过糖基磷脂酰基醇(GPI)锚定或二硫键绑定在细胞壁上。因此,酵母表面展示系统是一种更为安全、高效的表面展示系统。但该系统也存在一些缺陷,例如酵母生长适温范围窄,主要的蛋白质后加工过程与哺乳动物细胞差异较大,重组酵母缺少选择标记等。2006年有人报道酵母的质量控制系统并不能区分表达完整折叠的蛋白和折叠结构缺陷型蛋白〔4〕,这也进一步表明了酵母表面展示系统在蛋白表达上还不完善,筛选出来的蛋白应用前可能还需要进一步分析研究。 杆状病毒表面展示系统：属于高等真核生物展示系统。该展示系统以杆状病毒为载体,外源基因插入病毒的衣壳蛋白基因或囊膜蛋白基因后经过加工处理,与衣壳蛋白或囊膜蛋白进行融合表达并在病毒粒子或感染细胞表面进行展示。作为一种真核生物展示系统,杆状病毒表面展示系统允许大片段外源基因的插入,能有效地在病毒粒子表面展示外源蛋白,而且可以对外源蛋白进行糖基化加工和折叠等翻译后修饰,尤其适合需进行特异的翻译后加工才能有效折叠和具有生物活性的高等真核生物细胞表面蛋白和分泌蛋白的展示。目前研究及应用最为广泛的杆状病毒表面展示系统是苜蓿尺蠖核型多角
课题4 酵母细胞的固定化 1、酵母细胞的活化是指（） A．让酵母细胞恢复运动状态 B．让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠 C．让酵母细胞内酶活性增强 D．让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 2、高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构它能将葡萄糖转化成果糖，而不能转化成其他物质。这是根据酶的特性中的（） A．特异性 B．专一性C．高效性 D．多样性 3、下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是 ( ) A．琼脂糖 B．醋酸纤维素 C．聚丙烯酰胺 D．聚乙烯树脂 4、关于固定化酶的叙述不正确的是 ( ) A．既能与反应物接触，又能与反应物分离 B．固定在载体上的酶可被反复利用 C．可催化一系列反应 D．酶的活性和稳定性受到限制5、下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( ) A．酶分子很小，易采用包埋法 B．酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶 C．细胞个大，难被吸附或结合 D．细胞易采用包埋法固定 6、制备固定化酵母细胞过程中，如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，这说明（） A．海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少 B．海藻酸钠的浓度偏高，固定的酵母细胞数目较多 Ｃ．海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较多 D．海藻酸钠的浓度偏高，固定的酵母细胞数目较少 7、下列关于固定化细胞的叙述，正确的是（ ） A．催化效率高，低耗能、低污染 B．对环境的条件非常敏感，容易失活 C．既能与反应物充分接触，又能与产物分离 D．成本低、操作简单，但反应效率可能很低 8、下列有关固定化酵母细胞制备步骤正确的是（ ）（多选）A．应使干酵母与自来水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B．配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C．向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D．将与酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成 9、研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤
浅谈酵母表面展示技术 摘要：酵母表达体系同时具有真核细胞翻译后蛋白加工修饰的过程与原核表达体系的特点，因此，以酵母为基础的表面展示体系在诸多展示系统中有独特的优势。本文主要对酵母细胞展示的理论基础、展示体系类型及应用研究的进展等进行了初步探讨。 关键字：酵母、表面展示、凝聚素、GPI Scott 和Smith 在1985年通过发现短肽链可以融合到丝状噬菌体的锚定蛋白上，却不影响其感染大肠杆菌的能力，最早提出表面展示技术，促进了噬菌体表面展示系统的发展[1]。自从丝状噬菌体表面展示技术创立以来，表面展示技术在很短的一段时间内得到快速发展，不同的实验室又分别发展T4 噬菌体、T7噬菌体、细菌、杆状病毒、酵母等表面展示系统。微生物细胞表面展示是通过将靶蛋白基因序列与特定的载体蛋白基因序列融合后导入微生物宿主细胞，靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位于微生物细胞表面，保持相对独立的空间构象和原有的生物学活性。微生物细胞表面展示系统包括细菌展示系统、噬菌体展示系统以及酵母展示系统。最早研究且比较成熟的系统是噬菌体展示系统，它是将外源的多肽与丝状噬菌体的次要外壳蛋白融合并展示在外壳表面，噬菌体展示系统目前主要用于从复杂的文库中分离特异性的配体、抗原、抗体，由于噬菌体颗粒较小，展示蛋白的大小和数量均有限。原核蛋白主要用细菌展示系统展示，革兰氏阴性菌外表面有外膜，外源蛋白与暴露在细胞表面的外膜蛋白、脂蛋白、菌毛蛋白或鞭毛蛋白的末端融合后得到展示[2]。酵母展示系统是比较理想的、应用最广泛的展示系统，其优势在于：遗传操作方便；能对表达的外源蛋白进行折叠、糖基化等翻译后修饰，因而适宜表达真核蛋白；另外，酵母可以在廉价的培养基中培养达到很高的细胞密度。 1 酵母表面展示系统原理 细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域都有广泛的应用前景[3]。 2 酵母表面展示系统基本组成 2.1 宿主细胞 酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展示异源酶作为全细胞催化剂[4]。另外，毕赤酵母对外源蛋白的O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好的稳定效果。 2.2 载体蛋白 酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类蛋白必需以β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有GPI 锚定区域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都属于
有机合成工艺小试到中试放大之关键 在生产过程中凡直接关系到化学合成反应或生物合成途径的次序，条件（包括物料配比、温度、反应时间、搅拌方式、后处理方法及精制方法等）通称为工 艺条件。 一、研发到生产的三个阶段 1、小试阶段：开发和优化方法 2、中试阶段：验证和使用方法 3、工艺验证/商业化生产阶段：使用方法，并根据变更情况以绝对是否验证 注：批量的讨论：中试批量应不小于大生产批量的十分之一 二、小试阶段 对实验室原有的合成路线和方法进行全面的、系统的改革。在改革的基础上通过实验室批量合成，积累数据，提出一条基本适合于中试生产的合成工艺路线。小试阶段的研究重点应紧紧绕影响工业生产的关键性问题。如缩短合成路线，提高产率，简化操作，降低成本和安全生产等。 1、研究确定一条最佳的合成工艺路线：一条比较成熟的合成工艺路线应该 是：合成步骤短，总产率高，设备技术条件和工艺流程简单，原材料来源充裕而 且便宜。 2、用工业级原料代替化学试剂：实验室小量合成时，常用试剂规格的原料 和溶剂，不仅价格昂贵，也不可能有大量供应。大规模生产应尽量采用化工原料和工业级溶剂。小试阶段应探明，用工业级原料和溶剂对反应有无干扰，对产品的产率和质量有无影响。通过小试研究找出适合于用工业级原料生产的最佳反应 条件和处理方法，达到价廉、优质和高产。 3、原料和溶剂的回收套用：合成反应一般要用大量溶剂，多数情况下反应 前后溶剂没有明显变化，可直接回收套用。有时溶剂中可能含有反应副产物，反应不完全的剩余原料，挥发性杂质，或溶剂的浓度改变，应通过小试研究找出回收处理的办法，并以数据说明，用回收的原料和溶剂不影响产品的质量。原料和溶剂的回收套用，不仅能降低成本，而且有利于三废处理和环境卫生。
细菌表面展示（bacterial cell－surface display）技术 的发展及应用 各位同学大家好，今天我们为大家带来的是：细菌细胞表面展示技术，严谨的科学定义是：指通过重组 DNA 技术，将外源功能蛋白表达并定位于特定细菌细胞的表面，以达到一定的研究与应用目的是一项新的蛋白质应用技术。这句话该怎么理解：一般基因工程需要把蛋白提取出来，最好是菌体可以把蛋白分泌到菌体外，表面展示技术是把目的蛋白表达在细胞表面，外源蛋白的这种表面锚定有4个好处：1.可以使特定的反应在细胞表面直接发生而提高反应效率，2.能克服某些大分子底物不能穿越细胞膜而进入胞内，3客服某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端，4.使产物的提取纯化过程简化。 接下来，我组将从发展史，菌体构建，技术应用，未来展望4各方面为大家介绍。 1.发展史 大多数生物技术都是经历了噬菌体——细菌——真核（酵母菌）的三个发展应用阶段，表面展示技术也不例外。包括：1985年Smith等人创建噬菌体表面展示技术，次年， Freudl 报道细菌表面展示技术，以及近年来兴起的酵母菌表面展示技术与杆状病毒表面展示系统。 噬菌体表面展示技术：该展示系统是最早发展起来的,历经20多年发展,现在最常用的噬菌体表面展示系统主要有:丝状噬菌体、K噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体展示系统。噬菌体表面展示技术具有表面展示技术的基本优点,而且技术发展相对成熟,但由于载体自身的限制,使得该展示系统存在着很大缺点。比如,外源蛋白的插入可能影响噬菌体的装配,使其失去感染力;多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达时存在不可预测的偏差性等。 酵母菌表面展示系统：酵母表面展示系统是近年发展起来的一种重要的真核蛋白表面展示系统。酿酒酵母是具有细胞壁的单细胞真核微生物,是目前常见的酵母表面展示系统载体蛋白来源。根据交配型的差异分为MATa和MATA两种单倍体,其细胞表面分别表达a或A凝集素,它们是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋白,可介导细胞间的性黏附使细胞融合。目的蛋白可分别与a或A凝集素融合,展示于酵母细胞表面。与细菌相比,酿酒酵母在表面展示技术上的应用具有许多优势:(1)具有公认的安全性;(2)其蛋白质折叠和分泌方式与哺乳动物相似,展示哺乳类蛋白优于细菌系统;(3)具有众所周知的发酵特性;(4)展示的蛋白质可通过糖基磷脂酰基醇(GPI)锚定或二硫键绑定在细胞壁上。因此,酵母表面展示系统是一种更为安全、高效的表面展示系统。但该系统也存在一些缺陷,例如酵母生长适温范围窄,主要的蛋白质后加工过程与哺乳动物细胞差异较大,重组
制备固定化酵母细胞（教案） 一、教学目标 1比较直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的优点和缺点。 2、尝试制备固定化酵母细胞，并了解利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。 3、能运用该部分内容解决一些实际问题。 二、教学重点与难点制备固定化酵母细胞 三、导入新课反馈练习1、2、3题，强调实验的重要性 四、知识回顾 1、列表比较直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化细胞催化反应，各有哪些优点和缺点, 并各举一例。 2、固定化酶和固定化细胞技术利用的方法有哪些？ 3、固定化细胞常用的方法是哪一种？为什么？ 4、催化大分子物质反应，应该采用固定化酶的方法还是固定化细胞的方法？为什么？ 五、实验操作步骤 1、酵母细胞的活化 称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞 混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化（问：什么是活化？活化后酵母细胞的体积会变） 2、配制0.05mol/L 的CaCl2 溶液 （问：为什么要配制CaCl2溶液？答：___________________________________________ ） 称取无水CaCl20.83g,放入200ml的烧杯中，加入150ml蒸馏水，使其充分溶解，待用。 3、配制海藻酸钠溶液（该实验成败的关键步骤） 称取0. 7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。 （问：为什么要小火或者间断叫热？_____________________________________________________ 海藻酸钠浓度不能太高，也不能太低。原因是：太高_______________ ,太低 ______________ ）4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
制备固定化酵母细胞（教案） 常州市新桥中学张琴娣 一、教学目标 1、比较直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的优点和缺点。 2、尝试制备固定化酵母细胞，并了解利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。 3、能运用该部分内容解决一些实际问题。 二、教学重点与难点制备固定化酵母细胞 三、导入新课反馈练习1、2、3题，强调实验的重要性 四、知识回顾 1、列表比较直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化细胞催化反应，各有哪些优点和缺点，并各举一例。 2、固定化酶和固定化细胞技术利用的方法有哪些？ 3、固定化细胞常用的方法是哪一种？为什么？ 4、催化大分子物质反应，应该采用固定化酶的方法还是固定化细胞的方法？为什么？ 五、实验操作步骤 1、酵母细胞的活化 称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化（问：什么是活化？活化后酵母细胞的体积会变） 2、配制0.05mol/L的CaCl2溶液 （问：为什么要配制CaCl2溶液？答：） 称取无水CaCl20.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml蒸馏水，使其充分溶解，待用。 3、配制海藻酸钠溶液（该实验成败的关键步骤） 称取0．7g海藻酸钠,放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌,将海藻酸钠调成糊状,直至完全溶化,用蒸馏水定容至10ml。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。 （问：为什么要小火或者间断叫热？ 海藻酸钠浓度不能太高，也不能太低。原因是：太高，太低）4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。（为什么要冷却？） 5、固定化酵母细胞 以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30分钟。 （为什么要浸泡30分钟？） 五、反馈练习（见学案） 六、教学反思 1、学生的实验结果并不理想，凝胶珠基本上都带尾巴，可能是海藻酸钠浓度太高或太低。而学生配的海藻酸钠浓度普遍太低，说明蒸馏水加得太多，做得较好的同学，加10ml蒸馏水溶解海藻酸钠后，再加3—5ml。每次买的海藻酸钠批次不同，需要加的蒸馏水的量也不同，所以在学生实验前老师都要预先做一遍。 2、学生在溶解海藻酸钠时加了蒸馏水还没充分搅拌就加热，所以出现海藻酸钠有的形成硬块没有溶化的现象，今后实验过程中要加强这方面的指导。 3、用高考题引入，效果较好，强调实验的重要性很有说服力。 2009-6-12 制备固定化酵母细胞（学案） 班级姓名 一、学习目标 1、比较直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的优点和缺点。 2、尝试制备固定化酵母细胞，并了解利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。 3、能运用该部分内容解决一些实际问题。 二、学习重点与难点制备固定化酵母细胞 三、知识回顾 1、列表比较直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化细胞催化反应，各有哪些优点和缺点，并各举一例。 2、固定化酶和固定化细胞技术利用的方法有哪些？ 3、固定化细胞常用的方法是哪一种？为什么？ 4、催化大分子物质反应，应该采用固定化酶的方法还是固定化细胞的方法？为什么？ 四、实验操作步骤
诱导培养基配制Selective scFv (or Fab or ligand) Induction Media 1x (SG-CAA)成分： 5 g/L casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050) 1 g/L galactose 1 g/L raffinose（棉子糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成）0.05 g/L glucose 7g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520) 2.7 g/L Na2HPO4 3.7 g/L NaH2PO4 配制方法： 10X 10%半乳糖 称取100g溶于1000ml水中 ②推荐过滤除菌高压灭菌 10X 10%棉子糖 ①称取100g溶于1000ml水中 将 ②推荐过滤，高压灭菌即可 20%葡萄糖 ①称取200g溶于1000ml水中 ②推荐过滤除菌，根据经验，高压灭菌即可 10X 10%半乳糖 10X YNB ①称取70g溶于1000ml水中 过滤除菌 1X SG – CAA ①称取 5 g 酪蛋白水解物 2.7 g Na2HPO4(6.8g Na2HPQ4.12H2O) 3.7g NaH2PO4( 4.8. NaH2PO4.2H2O) ②加入500ml水中，定容至700ml高压灭菌 ③加入10X 10%半乳糖100ml、10X 10%棉子糖100ml 、20%葡萄糖2.5ml、 10X YNB100ml混匀 4度保存。有效期为1-2个月 抗体诱导展示实验步骤： 对照设置： pYD说明书参考对照设置：
合成路线查询; 1 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 可用结构式查找 2 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/default.asp 可用结构式查找 3https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/depts/chem ... tice/medialib/data/ 反应类型查找 4 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/reaction/index.h 有机人名反应 5 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 支持结构式查询 6 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/reactions.htm 类型反应推荐 免费外文全文 1 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 2 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bjoc/home/home.htm 3 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/patent.htm 专利下载 4 http://www.thieme.de/connect/en/ 5 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 6 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 7 http://www.abc.chemistry.bsu.by/current/fulltexto.htm 8 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/More_Res.html 9 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 化合物（原料）查询 1 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/chemistry/ 2 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/chemdata/index.aspx 3 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 4 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 5 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 6 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/products/67-68-5C.htm 7 [url]https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/dictionary-search/results.do?id=131392&disp=&si= 谱图查询 1 [url]http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng免费查询质谱、氢谱、碳谱、红外光谱、拉曼光谱 2 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/scdb/ 可查谱图和其他各种数据 有机论坛 1 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bbs/ 小木虫 2 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 科学网论坛 3 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/ 有机化学论坛 4 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html, 鸭绿江 5 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bbs/index.php 化学信息论坛 6 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bbs/index.php 诺贝尔 7 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bbs/index.html 丁香园 8 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bbs子午学术论坛 9 https://www.doczj.com/doc/d52432767.html,/bbs/ 网上读书园地论坛
枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis) 是一种典型的好氧型的革兰氏阳性细菌，也是研究的最早且最深入的一种芽胞杆菌。其中枯草芽胞杆菌168是最早发现的可作为转化的芽胞杆菌菌株，随后对其遗传转化和表达系统做了深入的研究。1997年，日本和欧洲的几个实验室联合完成了枯草芽胞杆菌168 基因组的测序［1］。枯草芽胞杆菌有两个生长时期: 孢子休眠期和生殖生长期。在营养缺乏等胁迫的环境下，枯草芽胞杆菌进入休眠期形成具有抗逆作用的芽胞，在营养充足的环境下，芽胞又会进入生殖时期，即芽胞萌发重新生长成为枯草芽胞杆菌。芽胞抗逆性非常强，在高温和酸碱等极端环境下亦能生存，由于其独特的生理特性，使之成为新型的蛋白质或酶类药物表达载体而倍受关注。由于枯草芽胞杆菌是一种非致病性的益生菌，因此其可以作为一种生物安全的展示外源蛋白的宿主。目前利用该菌株已成功表达了破伤风毒素［2 ～4］、不耐热肠毒素［4］、乙醛酸脱氢 芽孢杆菌属和梭菌属在受到外界应力时如营养缺乏情况下自身母细胞会形成一种休眠体即芽孢,它可以抵御外界环境因素的攻击。年前发现炭疽芽孢杆菌的芽孢即使将其置于沸水中蒸煮一断时间后,它仍能存活下来,这一有趣的现象吸引了科学家们开始探究芽孢的耐热和抵御其他外界环境因素攻击的作用机制。()枯草芽孢杆菌芽孢芽孢杆菌属()在饥饿或环境恶劣等逆环境下,为了抵御外界不良应力这时它的营养细胞会形成一种近椭圆形的休眠体结构即芽孢。芽孢的结构由内到外依次是核心、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁。芽孢的核心一般含有大量的染色体、酶和,但含水量却很低,主要是由于它内部的大部分
水分子都被吡啶二羧酸复合体取代掉了。芽孢的外壁由肽聚糖构成,与营养细胞的肽聚糖组分很类似,仅在于含量上有差别。芽孢的衣壳由至少种以上的蛋白构成,这些蛋白也被称为芽孢衣壳蛋白,它们具有抗酶解和抗药物的功能,主要受一系列调控基因和结构基因控制。芽孢的外壁从结构上又可细分为基底层、内层、外层和层四个部分(图)。芽孢诱导产生的整个过程大概需要将近八个小时。芽孢的形成受一系列调节酶如激酶和磷酸酶、细胞周期及其他机制调控 芽孢形成的步骤可简单地描述成如下几个过程:第一步,包括、和在内的组氨酸感受激酶开始活化,这时组氨酸感受激酶以扩展磷转移的方式运载磷,并促使转录因子发生磷酸化。实际上,诱发芽孢产生的调控过程很简单,因为只需要调控上游的表达就可以实现,并且都不需要考虑它的营养是否缺乏。磷酸化调控的调节子基因很多,包括参与不均等分裂的相关蛋白和参与芽孢形成的σ因子蛋白。不均等分裂会使营养细胞分化成个间隔区,大的是母细胞,而小的则是前孢子。前孢子最终演化为成熟的芽孢。随后,母细胞以一种类似吞噬作用的方式逐渐包裹前孢子。待吞噬完成后,被母细胞吞并的前孢子则被覆盖上了一个双分子层膜。与此同时,还产生了两个外部的保护结构:一个是前孢子内膜与外膜间肽聚糖组装成的核质;另一个是由衣壳蛋白质构成的芽孢最外保护层。实际上,肽聚糖的前体起初是在母细胞中合成的,然后它翻转穿过前孢子外膜进入外膜与内膜间的空间,但是这种翻转机制目前仍不太清楚。最后,母细胞破裂释放成熟的芽孢进入环境中。此时的芽孢能够快速发芽并可通过吸收营养恢复它的增殖能力。
实验一酵母细胞的固定 化 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
实验一酵母细胞的固定化 一、实验原理与目的 原理：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或者细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法，化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。 常用的包埋载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作为载体包埋酵母菌细胞。 目的：了解细胞固定化的原理；掌握酵母细胞固定化实验操作。 二、仪器与用具 仪器：50ml烧杯、200ml烧杯、玻璃棒、量筒、酒精灯、石棉网、针筒、三角瓶、水浴锅、恒温箱。 化学材料：活化酵母菌（酵母悬液）、蒸馏水、无水CaCl 、海藻酸钠、葡 2 萄糖。 三、试剂配制 1、L的CaCl2溶液150ml； 2、海藻酸钠溶液：每0.7g海藻酸钠加入10ml水加热溶液成糊状； 3、10%葡萄糖溶液150ml。 四、实验方法与步骤 1、干酵母活化：1g干酵母+10ml蒸馏水→50ml烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。 2、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞，用玻璃棒充分搅拌混合均匀。 3、固定化酵母细胞：用20ml注射器吸取海藻酸钠与酵母细胞混合液，在恒定的高度（建议距液面12~15cm处，过低凝胶珠形状不规则，过高液体容易飞溅），缓慢将混合液滴加到CaCl2中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。 4、固定化酵母细胞发酵：用5ml移液器吸取蒸馏水冲洗固定好的凝胶珠2~3次，然后加入装有150ml10%葡萄糖溶液的三角瓶中，置于25℃发酵24h，观察结果。
酵母细胞的固定化 固定化酶和固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)常用的几种固定方式 ①包埋法，能将酶或者细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中。 ②化学结合法，能将酶分子或者细胞相互结合或者结合到载体上。 ③物理吸附法，能将酶或者细胞吸附在载体表面上。 一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。（因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。） (3)常用的载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 (4)优点 ①固定化酶：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。一定程度上避免了高温、强酸、强碱和有机溶剂等对酶活性的影响，从而提高催化效率，降低生产成本，提高产品质量。 ②固定化细胞：与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。（优势：操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收。不足：大分子物质难以自由通过细胞膜。）
用固定化微生物细胞来生产酶，具有生产成本低，周期短，产量大等优点。微生物产生的酶可以分为分泌在细胞外的胞外酶和包含在细胞内的胞内酶。利用胞内酶时，需要将细胞破碎后，将酶分离纯化，但提取后酶的活性和稳定性往往都会受到很大的影响。将微生物细胞限制或定位于特定空间位置，即将微生物制成固定化细胞后，既能避免复杂的细胞破碎、酶的提取和纯化过程，又能使酶的活性和稳定性得到较大提高，固定后的微生物细胞可以作为固体催化剂在多步酶促反应中发挥连续催化作用，同时，催化反应结束后又能被回收和重复利用。 实验操作 1．制备固定化酵母细胞 (1)固定方法：包埋法。 (2)载体：海藻酸钠。 (3)实验操作 2．用固定化酵母细胞发酵
有机合成发展及趋势 摘要：总结了有机合成的发展及未来的趋势，特别介绍了绿色合成化学的进展及存在的问题。关键词：有机合成, 发展, 趋势, 绿色合成化学 The development and trend of organic synthesis Abstract: The development and trend in future of organic synthesis are summarized, especially introducing the development and problems of green synthesis chemistry. Key words: Organic Synthesis, Development, Trend, Green Synthesis Chemistry 1828年德国科学家F.维勒利用无机物氰酸铵成功合成出了动物代谢产物尿素，开创了一个新的化学领域—有机合成。有机合成是指利用化学方法将简单的化合物或单质制备成新的有机物的过程。伴随着越来越多的化学工作者的研究，有机合成已经经历了180年的发展历史。 总体而言，有机合成化学的发展可以划分为两个阶段：第二次世界大战前的初创期和第二次世界大战后的辉煌期。 有机合成的第一阶段主要是以煤焦油为原料合成染料及药物等，如霍夫曼（A.W.Hofmann）发现的苯胺紫，费歇尔（Emil Fischer）合成的六碳糖的各种异构体以及嘌呤等杂环化合物，拜耳（A. Von Baeyer）合成的有机染料靛蓝等。越来越多的化合物的合成，为有机合成的辉煌发展奠定了坚实的基础。 从二战结束到二十世纪末，有机合成进入了空前发展的辉煌时期，涌现出了一批杰出的有机合成大师。如喹啉全合成的完成者R.B.Woodward，同时他还合成了生物碱马钱子碱、麦角新碱、利血平；甾体化合物胆甾醇、皮质酮、黄体酮以及羊毛甾醇；抗生素青霉素、四环素、红霉素及维生素B12。E.J.Corey则在总结有机合成规律与合成设计方面做出了巨大贡献，他从合成目标分子出发，根据其结构特征和对合成反应的知识进行逻辑分析，并利用经验和推理设计出适当的合成路线，提出了反合成分析，并运用这种方法合成出了银杏内酯、大环内酯、前列腺素类化合物以及白三烯类化合物。 如今，有机合成已经成为化学领域中最为重要的学科之一，其研究内容遍布材料、能源、环保、生命等各个学科，在社会文明发展与人们日常生活中发挥着极其重要的作用。 上世纪90年代，Seebach “Organic Synthesis-Where now?”的文章论述了当时的有机合成以及发展趋势[1]，他认为从大的反应类型上讲有机合成已经难有新发现，当然新的改