实验
重组门冬酰胺酶II的制备
与分析
组员：1144301 吴雅云1144302 王世静
1144303 奚建涛1144304 逄淑云
实验目的
1. 了解构建重组质粒的原理。
2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法。
3. 了解原核细胞表达重组蛋白载体的原理。
4. 掌握重组质粒的初步鉴定方法。
5. 了解重组工程菌发酵培养、诱导表达重组门冬酰胺酶II的原理。
6. 了解重组门冬酰胺酶II通过透析法脱盐的原理。
7. 掌握透析法的基本操作。
8. 了解离子柱交换吸附技术的原理。
9. 掌握离子柱交换吸附技术分离、纯化重组门冬酰胺酶II的方法。
实验原理
门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。目前临床上使用的L-ASP泛指来源于大肠杆菌的E.coil L-ASP II。从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coil天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pka/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. Coil L-ASP开辟了新的道路。
第一链cDNA合成用一个经修饰的olig（dT）引物CDSⅢ primer，SMARTⅢ寡核苷酸作为mRNA5＇端延伸出去的模板，当逆转录达mRNA5＇端时，逆转录具有模板不依赖性的在第一链cDNA3＇端加上几个C，与SMARTⅢ寡核苷酸3＇端的几个G配对，从而使寡核苷酸连接到mRNA5＇端。逆转录酶跳移并以SMARTⅢ寡核苷酸为模板，反转录至SMARTⅢ寡核苷酸的末端，而这种跳移常常发生在真核生物的mRNA帽子结构-m7GpppX，这样反转录出的cDNA包含mRNA完整的5＇及SMARTⅢ寡核苷酸的互补序列，再用PCR合成cDNA第二链，PCR的引物是CDSⅢ primer及SMARTⅢ寡核苷酸上的一段-5＇PCR Primer。那些过早终止逆转录的非全长cDNA因不具有SMARTⅢ寡核苷酸而不能作为模板被扩增，只有含全长mRNA和SMART Ⅲ寡核苷酸的cDNA才能在扩增反应中作为模板被扩增合成第二链cDNA〔3〕。然后经酶切与载体连接，从而构成了全长的cDNA文库。此文库所分离的cDNA克隆包含了相应mRNA分子完整的5＇非编码区序列，为研究目的基因在翻译水平上调控机理奠定了重要基础。
聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
制备感受态细胞原理：CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。
化合物诱导转化法原理：外源 DNA 与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨
酸等）、二价阳离子（Mg 、Ca 、Mn等）混合，再与受体细胞或原生质体混合，可使外源 DNA 进入细胞S.O.C比LB 培养基更有营养，因此导致细菌的快速生长;相对于LB 培养基，S.O.C 培养基中转化株不仅可以在其后的12 h 就观察到，而且转化效率较高，S.O.C 培养基比LB 培养基的效率高出10 ～30 倍。
大肠杆菌L 一天冬酞胺酶是胞内酶, 破碎细胞的方法较多, 菌体经冷丙酮抽提破壁后, 酶抽提率较高，而且易于大规模生产应用, 便于保存。
EDTA作为一种金属螯合剂,它能结合抽提液中的金属离子,从而减少金属离子对酶活性的影响,增加酶的稳定性[3]。同时,EDTA对细胞外层膜有一定破坏作用,使外层膜失去稳定性,大量脂多糖分子脱落,从而使外层膜出现洞穴。这些洞穴区域由内层膜的磷脂来填补,导致该区域通透性增强,使活性成分L-天门冬酰胺酶更易提取出来。
高效毛细管电泳，简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。
实验方法
一.目的基因获取
1.总RNA提取与鉴定严格按照操作手册说明书进行。提取RNA 经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，测定OD260和OD280,计算其纯度及比值。
2.cDNA合成和文库构建根据RNA浓度确定RNA模板量。按Clontech的Smart TM cDNA Library Construction Kit 使用手册进行，cDNA合成使用长距离PCR方法。依次加入SMART IV Oligonucleotide、3＇PCR Primer及dNTP，在反转录酶作用下合成第一链。再以第一链cDNA为模板，依次加入dNTP Mix、5＇PCR Prime、3＇PCR Primer、Advantage 2 Polymerase Mix 在 PCR仪上进行扩增，共30个循环。PCR产物经蛋白酶K消化、SfiI酶切以及CHROMA SPIN-400 column大小分级。按照cDNA：Vector=1：2/1：1/3：2三种方式进行连接。每一个连接建立一个独立的λ噬菌体包装反应。
3.文库质量鉴定事先制备好宿主菌的液体培养物，37℃，140r/min培养，直到培养液OD600至2.0。离心，弃上清，用MgSO4重悬沉淀。取3种连接方式不同稀释度的包装产物各100μl，分别与200μl宿主菌过夜培养物混合，在37℃培养10～15min，各加入5ml融化的LB/MgSO4 上层琼脂，混合，立即倒入37℃预热的LB/MgSO4平板上，水平涂布，冷却10min，37℃培养6～18h，计数噬斑，计算滴度（pfu/ml）=噬菌斑数×稀释因子×1000/稀释的噬菌体铺板体积（μl）。取2ml融化的上层琼脂，依次加入50μl IPTG和X-Gal贮存液、5μl 不同稀释度包装产物与宿主菌的混合物，计数蓝、白斑，计算重组效率=白斑数/（白斑数+蓝斑数）。
4.文库的PCR鉴定随机挑选了12个噬菌斑进行噬菌粒的转化及碱裂解提取质粒作为模板，分别依次加入5＇PCR Primer—CTCGGAAGCGCGCATTGTGTT ，3＇PCR Primer—GCCCTATAGTGAGTCGTAT， Advantage 2 Polymerase Mix进行PCR扩增，共35个循环。用1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
5.序列获得及分析将大肠杆菌BM25.8接种于10mlLB液体培养基，31℃，150 r/min 摇床中培养过夜，直到 OD600培养至1.1～1.4，加入100μl 1M MgCl2至终浓度为10 mmol/l；从平板上挑取分离较好的噬菌斑，接种于350μl 1×λ稀释缓冲溶液中，混合后37℃静置培养3～4h；在1.5ml离心管中加入200μl细菌过夜培养物及150μl噬菌体液，31℃静置孵育30 min后加入400μl LB培养液； 31℃，225 rpm/min摇床中培养1小时，取上清5μl 涂布于含100μg/ml 氨苄青霉素的 LB平板上，于31℃培养得单菌落。
碱裂解法提取质粒DNA
(1) 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。
(2)取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。
(3)菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置5-10 min。
(4)加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
(5)加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。 12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
(6)上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000rmp离心10min。（450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。）
(7)小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心12000rmp×10min。
(8)弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。
(9) 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
(10)将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。
注意事项
(1)提取过程应尽量保持低温。
(2)沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
将其中120个阳性克隆穿刺培养，进行全序列测定。所得序列去掉5＇和3＇端非编码区序列，用BLAST软件进行同源比对分析。
二.质粒构建
1.DNA操作技术
质粒DNA提取采用快速碱法; DNA限制酶切,凝胶电泳,末端补齐,脱磷酸化。
2.穿梭质粒载体pSUGV4的构建穿梭质粒载体pSUGV4的构建过程
用NdeI酶切质粒pUC18，然后从琼脂糖凝胶上直接回收pUC18片段；用EcoRI和KpnI 位点的同裂酶Asp718双酶切质粒pREP9,回收3.3kb的片段,该片段含有在枯草杆菌中起作用的复制起点和能有效地表达卡那霉素抗性的基因. 将以上两个片段的5’突起末端补齐 .用T4 DNA连接酶连接后转化E.coli XL1-blue,,在含有100*10-6g/mL氨苄青霉素的LM固体平板上筛选Ampr重组子。从挑取部分重组子提取质粒,再转化B.subtilisWB600,在含有40*10-6g/mL卡那霉素的MMCH固体平板上筛选kanr转化子,再从挑取部分转化子提取质粒,经BamHI和BglII酶切后获得期望的2.1kb和3.9kb的两个片段,将此重组质粒载体命名为pSUGV4. pSUGV4为6.0kb,它既能在E.coli中又能在B.subtilis中自主复制,在E.coli中的遗传标记为氨节青霉素抗性（Ampr）基因,在B.subtilis中为卡那霉素抗性（kmr）基因。根据质粒拷贝数越高对抗生素的抗性越强的原理,设计实验检查pSUGV4在 E.coli和B.subtilis中的拷贝数,结果表明,在E.coli中的pSUGV4 的拷贝数与pUC18相当,而在B.subtilis中的拷贝数略低于pREP9.
酶切
在PCR管中按照下列体系酶切质粒和PCR产物，加入如下物质：10×Buffer，Nco I，Hind III，Plasmid or PCR product，Nuclease-Free Water to final volume
如果是快酶，限制性内切酶量为1μl，如果是普通酶，限制性内切酶量增加到2 。酶切条件：37 ℃温育3h。
质粒不能完全用于酶切，要留样5μl左右，用做转化实验的空载体阳性对照。
PCR纯化参考试剂盒说明书，PCR纯化的片段长度分别为5.8kb（质粒酶切片段）和1.2kb （PCR酶切）。
电泳检测
加入5μl GOLDWAVE染色液体，插入小梳齿。
点样：2.5 μl样品+适量的Loading Buffer点样，DNA分子量Marker: DL2000 5 μl。电泳时间：120V恒压 30 min
连接
在PCR管中按照下列体系连接：T4 DNA Ligase ( 400 U/μl，NEB )，10×Ligase buffer，PCR product，Plasmid，Nuclease-Free Water to final volume
质粒和PCR纯化的片段电泳后，与DL2000 Marker的条带比较，确定其中的DNA含量。
每次取5 μl DL2,000 Marker电泳时，750 bp的DNA片段量约为150 ng，显示亮带，其余条带的DNA量约为50 ng。保温瓶16℃恒温过夜。当质粒和PCR产物的含量相当时，两者的末端摩尔浓度比例在1：5左右。
三．转化
制备感受态—TSB法
1.药品制备
1M Mg2+ (1M MgSO4 和 1M MgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。
TSB液（30mL/ 80mL菌液）（现配现用）：
PEG3350 3g
Tryptone 0.3g
Yeast extract 0.15g
NaCl 0.3g
2. 步骤：
（1）活化菌株
（2）挑单菌落培养于5mL 的液体培养基中
（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养
（4）370C培养3－4小时，OD600在0.4－0.6
（5）离心，去上清
（6）加入20mLTSB，重悬
（7）离心，去上清
（8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分装保存
注，整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。
转化—PEG转化法
1、37 下预热固体S.O.C 和含氨苄青霉素的S. O. C （最终浓度100 ug mL）平板1 h(SOC 培养基比LB培养基更营养，细菌生长较快。且能提高转化效率) 。
2、取100 μL 感受态细胞并加入1μg/μL 质粒0 .5μL 。加入DMSO 或PEG800040 % 1 μ
L （提高转化效率）。在冰上放置30 min。 42℃处理90 s ，冰上放置30mi n。
3、加入400 μL 液体S.O.C 培养基， 37℃下在摇床上培育45 mi n ，将混合液的一半涂在含有氨苄青霉素的预热的平板上，另一半混合液涂在没有氨苄青霉素的对照板上。在
S.O.C平板培养基上37 培养过夜( 12 ～16 h)。
四．工程菌的发酵培养
LB液体培养基
发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L， pH7.0，高压灭菌。
用于蛋白分离纯化的重组菌所含质粒是pET22b-AnsB。
发酵条件：
1.种子菌培养：从甘油管中取400 μl菌液接种到50ml LB液体培养基中（含Kanamycin
50 μg/ml ）调节pH在7-7.5，37℃摇床中（250rpm）培养16h。
2.取10 ml种子液体，接入到装有200 ml玉米浆质培养液的500 ml三角瓶中，25 ℃
摇床中（150 rpm）培养4h后，加入乳糖至终浓度为10 mmol/L（200ml 中加入4ml 0.5mol/L 的乳糖），培养过夜。
3.在4 ℃下，6000 rpm离心15min收集菌体。
五．菌体破碎与酶纯化
1.丙酮破壁将大肠杆菌的发酵液离心, 弃上清, 获得含有L- 天门冬酰胺酶的菌体细胞。用20倍菌体体积的丙酮分3 次加入菌体细胞中, 每次搅拌10min。离心, 收集沉淀, 室温下吹干、粉碎。
2.稀盐提取将干粉状菌体溶解在10 倍体积的提取液中( 其中含100mM 的氯化钠,
30mM 的EDTA), 调pH6. 0, 室温下搅拌30min。离心, 收集上清液。
3.透析将透析袋预处理后，夹好夹子，检查透析袋是否漏，不漏用滴管将提取液装进透析袋，用缓冲液透析，刚开始20—30min换一次透析液，三四次后可以延长时间，透析8h。
4.CM-Sephadex层析柱纯化将上清酶液过用10mM、pH6.0的磷酸缓冲液平衡的
CM-Sephadex层析柱,用50mM、pH8.8的磷酸缓冲液洗脱,收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液。
5.DEAE-Sepharose层析柱纯化将洗脱液调pH7.0,过用10mM、pH7.0的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱,用50mM的磷酸缓冲盐洗脱,收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液。
6.亲和层析柱纯化先将Sepharose CL-6B凝胶偶联上配基L-天门冬酰胺,再用10mM、pH
7.0的磷酸盐缓冲液平衡。将酶液调pH7.0后,过亲和柱。用10mM的甘氨酸洗脱,收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液。
六．蛋白含量测定
紫外吸收法
操作步骤
1.标准曲线的绘制：
取8支试管，按下表编号并加入试剂：
试剂（ml）\管号0 1 2 3 4 5 6 7
蛋白质标准液（1mg/ml）
蒸馏水
4.0
0.5
3.5
1.0
3.0
1.5
2.5
2.0
2.0
2.5
1.5
3.0
1.0
4.0
混匀。在280nm处测定各管溶液的吸光度值。以0号管调零，以蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出蛋白质标准曲线。
2.蛋白质样品溶液，在280nm处测得吸光度值，从标准曲线上查出其浓度。
注意事项
1.蛋白质的最高吸收峰可因pH的改变而发生变化，因此要注意保持待测蛋白质溶液的pH值与标准蛋白质溶液一致。
2.测定液必须澄清，以免造成结果误差。
3.本法需用石英比色杯。
七．酶活力测定
菌体的处理：吸取1ml箘液入EP管，12000 rpm离心5 min，收集菌体弃上清液，加入
蒸馏水1 ml洗涤，混悬，12000 rpm离心5 min，弃上清。重复上述操作2-3次，加入pH 8.4硼酸缓冲液1 ml混悬。
准备一组（5支）蒸馏水准备管：取10 ml 的洁净试管5支，每管加 3.5 ml蒸馏水。另取5支10 ml的洁净试管，分别加入0.04 mol/L天冬酰胺底物，0.1 mol/L pH 8.4硼酸缓冲液各1 ml，37 ℃水浴5 min，分别加入细胞悬液、酶提取液、硫酸铵分级沉淀物、离子交换洗脱液及去离子水（作为对照）20 μl。反应15 min后分别加入50 % 三氯乙酸1 ml 终止反应。再从终止反应管中各支取500 μl进蒸馏水准备管，每管分别加入与25 % NaOH 以1:1配好的奈氏试剂1 ml显色，500 nm处测OD值。
计算：酶活力（U）=[（OD×1000）/(0.07×15X)] ×(3+X/1000)
X为取样体积（本实验为20 μl）
八．蛋白纯度测定
高效毛细管电泳
1.仪器的预热和毛细管的冲洗：打开仪器和配套的工作站。工作温度设置为13℃，不加电压，冲洗新毛细管，用的是浓度0.1 mol/L NaOH和分离缓冲液冲洗毛细管各5分钟。
2.标样以及未知浓度酶溶液：用浓度为80mmol/L的磷酸钠溶解制备浓度为0.1mol/L。
3.以pH 7.0的80mmol/L磷酸钠作为分离介质，并以0.22um滤膜过滤，超声脱去空气后备
（每次电泳前用0.1mol/L NAOH 用。检测波长214nm，分离电压12Kv,温度13℃，压差进样10s。
溶液，分离缓冲液冲洗柱体各5min）标准品测定前经过1000r/min离心脱气2min以Water BASELINE系统处理数据。
4.换成实验所得产品重复上述步骤。
5. 完成实验以后，用0.1 mol/L NaOH冲洗毛细管10 min, 二次水冲洗5min。
6.对比两次实验所得到的图谱，对比重组门冬酰胺酶2所处的峰判断实验所的产物的纯度。
参考文献
1.大肠杆菌一枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建四川大学学报 (自然科学版)
2.吴敬、赖龙生、刘景晶、吴梧桐.——重组L-门冬酰胺酶II的提取纯化工艺. Chinese Journal of Pharmaceuticals 2000,31(2)
3.刘景晶、金健勤、戴海滨、吴梧桐——大肠杆菌L 一天门冬酸胺酶的提取和纯化
4.{12}刘红,潘红春.抗癌药物L-天冬酰胺酶及其研究进展. 四川轻化工学院学报,2000,13(2):31-36.
5.新疆雪莲全长cDNA文库构建及序列分析*王博王志方付建红崔春生新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆乌鲁木齐 830000
6.培养条件对大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的影响 Influences of Incubating Conditions on E.coli Accumulating L-asparaginase
[期刊论文] 范志华, 梁鹏, 樊秀花, 张爱琳, 陈一江, FAN Zhi-hua, LIANG Peng, FAN Xiu-hua, ZHANG Ai-lin, CHEN Yi-jiang - 《天津农学院学报》 2008年4期
7.L-天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进——蔡丽萍杨冠东卢勇涛1 杜少平
(广州市瑞星生物工程有限公司广州510250;1广东省口腔医院广州510280)
8.重组天门冬酞胺酶11纯化过程的毛细管电监测——张晓丹吴敬周国华古国良中国生物制品杂志2000年第13卷第1期
重组天冬酰胺酶II研究进展 摘要L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广。目前，利用重组DNA技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述。 关键词L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化 Ⅰ引言 L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有30年了[1]。L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3），此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2]。由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶），而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3]。 目前，L-天冬酰胺酶分为I型和II型，尤其是II型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶II）。天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2]。本文主要就L-天冬酰胺酶II的表达与制备进展进行综述。 Ⅱ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究 1961年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5]。目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1]。 尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开。 1．表达菌株的构建 1995年，为了填补国内空白，刘景晶[8,9,10]等率先进行工程菌E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了天冬酰胺酶高效表达的基因工程菌
货号: QS1807 规格：50管/24样谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GS（EC6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。 测定原理： GS在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂四：10mL×1瓶，4℃避光保存。 样本测定的准备： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
·论著· 培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病临床应用中的安全性评估 李颖宪莹苏庸春温贤浩管贤敏肖莉王玥于洁 作者单位：400014重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤科 通讯作者：于洁，Email ：yujie167@yahoo．com 【摘要】目的评估培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL ）临床应用中的安全性。方法本研究中所有ALL 患儿都使用CCLG 2008方案规范诊治；接受培门冬酶治疗的条件是：（1）左旋 门冬酰胺酶（L- Asp ）皮试阳性；（2）L-Asp 使用后出现不良反应。先后共有32例患儿由于对大肠杆菌L- Asp 过敏而使用培门冬酶替代化疗共46次。使用培门冬酶治疗前和治疗后1周检查肝肾功能、凝血功能、淀粉酶、心肌酶谱、心电图和腹部B 超，临床观察和检测使用培门冬酶后脏器功能和不良反应发生的情况。结果46例次中无一例发生致死性不良反应。8例（17%）有转氨酶异常；总胆红素增高4例，以直接胆红素升高为主；血清总蛋白降低5例。8例（17%）有血浆纤维蛋白原 浓度异常，7例降低，临床无凝血功能障碍和血栓等表现。7例（15%）有心血管系统受累，包括血 压升高（1例）、 心率减慢（2例）、CK-MB 增高（5例）、肌钙蛋白增高（1例）、心电图异常（4例）。7例（15%）出现肾功能异常，以尿素氮增高（6例）为主，临床未发现肾功能不全的表现。3例（7%）发生高血糖症，无急性胰腺炎的病例发生。46例次培门冬酶治疗中，仅1例（2%）发生了典型的过 敏反应， 以明显的风团样皮疹伴瘙痒为主要表现，有一过性喉头异物感，经吸氧、镇静等处理后很快缓解。结论培门冬酶在很大程度上克服了L- Asp 过敏反应致使用受限的弱点；培门冬酶的不良反应发生率低，发生不良反应的程度轻，安全性较高。推荐培门冬酶作为对L- Asp 过敏的ALL 患儿的替代治疗。其疗效有待进一步观察。 【关键词】培门冬酶；急性淋巴细胞白血病；儿童；安全性 Safety assessment of pegaspargase in the clinical treatment of acute lymphoblastic leukemia in children LI Ying ，XIAN Ying ，SU Yongchun ，WEN Xianhao ，GUAN Xianmin ，XIAO Li ，WANG Yue ，YU Jie．Department of Hemooncology ，Children's Hospital ，Chongqing Medical University ，Chongqing 400014，China Corresponding author ：YU Jie ，Email ：yujie167@yahoo．com 【Abstract 】Objective To observe and evaluate the safety of pegaspargase in the clinical treatment of acute lymphoblastic leukemia （ALL ）in children．Methods All the patients in our study were treated with CCLG2008．The indications of pegaspargase is ：（1）positive skin test of L-Asp ；（2）adverse reaction after L-Asp treatment．A total of 32cases with Escherichia coli L-asparaginase allergy were treated with pegaspargase 46times instead of chemotherapy．The liver and renal functions ，coagulation ，amylase ，myocardial enzyme spectrum ，electrocardiogram （ECG ）and abdominal ultrasound were detected before and after treatment．The adverse reactions of pegaspargase was also observed．Results All the patients were treated with pegaspargase．No fatal adverse reaction was observed．Abnormal transaminase levels were · 751·中国小儿血液与肿瘤杂志2012年8月第17卷第4期J China Pediatr Blood Cancer ，August 2012，Vol 17，No．4
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定 【原理】 谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。 【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ； 反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）： 内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ； 反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）： 反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。 【方法】 1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算： GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)＝t V P A ?? 式中 A —540nm 处的吸光值； P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）； V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）； T —反应时间（h ）。
培门冬酶治疗ALL患者过程中的不良反应分析 发表时间：2017-12-29T09:39:03.630Z 来源：《中国误诊学杂志》2017年第24期作者：吕丽娜 [导读] 左旋门冬酰胺酶是一种用于化疗的关键药物之一，在应用于治疗ALL患者中具有重大的意义[1]。 右江民族医学院附属医院广西百色 53300 摘要：目的：观察培门冬酶（PEG-ASP）应用于初治急性淋巴白血病患者（ALL）中，并对其不良反应发生进行分析。方法：随机选取本院自2014年12月至2016年12月间诊断为急性淋巴细胞白血病（BCR-ABL阴性）的80例成人患者作为研究对象，并根据诱导化疗中培门冬酶的用药次数将其分为培门冬酶1次组（n=40）与培门冬酶2次组（n=40），对预后差组患者应用2次培门冬酶，对预后好组患者应用1次培门冬酶，观察并记录化疗后疗效，以及治疗期间培门冬酶的不良反应发生及严重程度。结果：经VDCLP化疗后，两组疗效无显著差异（P>0.05），且所有患者均未出现较为严重的不良反应发生。结论：在诱导化疗ALL患者的VDCLP方案之中，应用1次与2次培门冬酶治疗患者均具有治疗效果，但应用2次培门冬酶不良反应较为明显。 关键词：急性淋巴细胞白血病；培门冬酶；不良反应 左旋门冬酰胺酶是一种用于化疗的关键药物之一，在应用于治疗ALL患者中具有重大的意义[1]。国内外被广泛应用的门冬酰胺酶制剂为天然大肠杆菌源性L-asp、天然菊欧文菌源性L-asp以及培门冬酶。培门冬酶是新一代的门冬酰胺酶制剂，为聚乙二醇与L-asp的共价结合物。它既保存了L-asp的活性，同时又显著的降低了L-asp免疫原性[2]与半衰期较长[3]等的特点。本次研究，通过对培门冬酶应用诱导化疗ALL患者过程中的不良反应进行观察分析，取得了满意效果，报告如下。 1 一般资料与方法 1.1 一般资料 随机选取本院自2014年12月至2016年12月间诊断为急性淋巴细胞白血病（BCR-ABL阴性）的80例成人患者作为研究对象，并根据诱导化疗中培门冬酶的的用药次数将其分为培门冬酶1次组（n=40）与培门冬酶2次组（n=40），对预后差组患者化疗过程中应用2次培门冬酶，对预后好组患者化疗过程中应用1次培门冬酶。其中男47例，女33例，年龄为22-70岁，平均年龄为（36.44±3.13）岁，按预后危险度分组预后好组40例，预后差组40例。经核实，两组ALL患者基线资料无显著差异（P>0.05），具有可比性。 1.2 方法 对所有患者进行VDCLP方案进行化疗，其中培门冬酶1次组具体方案为：应用药物长春新碱，剂量为1.4mg/m2，方式为静脉注射，应用时间为d1与d8；应用药物柔红霉素，剂量为40mg/㎡，方式为静脉注射，应用时间为d1、d2、d3；应用药物环磷酰胺，剂量为750mg/㎡，方式为静脉滴注，应用时间为d1；应用药物强的松，剂量为40mg/m2?d，方式为口服，应用时间为d1-d14；应用药物培门冬酶，2500U/（m?次），方式为肌内注射，应用时间为d7。 培门冬酶2次组具体方案为：应用药物长春新碱，剂量为1.4mg/m2，方式为静脉注射，应用时间为d1、d8、d15、d22；应用药物柔红霉素，剂量为40mg/㎡，方式为静脉注射，分别于d1、d2、d3、d15、d16、d17应用；应用药物环磷酰胺，剂量为750mg/㎡，方式为静脉滴注，应用时间为d1、d15；应用药物强的松，剂量为40mg/m2.d，方式为口服，应用时间为d1-d28，d15开始减量；应用药物培门冬酶，2500U/（m?次），方式为肌内注射，应用时间为d7、d21。 1.3 判定标准 观察并记录两组患者在化疗过程中出现的相关消化道症状、皮肤粘膜损伤及过敏等常见的不良反应。根据《血液病诊断及疗效标准》，对患者诱导缓解情况进行记录，分为完全缓解、复发以及死亡。 1.4 统计学处理 SPSS19.0处理数据，计量资料以（ ±s）计量资料以表示，行t检验，计数资料以（%）表示，行X2检验，检验标准以P<0.05为数据比对有统计学意义。 2 结果 2.1 两组疗效比较 根据结果表明，两组疗效比较无统计学差异（P>0.05），对比详情见表一。 2.2 两组不良反应比较 两组患者在接受培门冬酶治疗期间，d7、d15及d21各时间的血尿淀粉酶及血脂肪酶均为正常水平，且无胰腺炎发生。血糖检测未发现有血糖增高病例，而2次组有14例（35.00）与1次组有10例一过性低血糖（25.00）。2次组共发现有7例（17.50）恶心呕吐与4（10.00）例厌食，1次组共发现5例（12.50）恶心呕吐与2例（5.00）厌食，组间比较无显著差异（P>0.05）。 3讨论 L-ASP是通过将门冬酰胺水解为门冬氨酸与氨，从而将血浆中的Asn消耗殆尽，以此对肿瘤细胞蛋白质合成进行阻断，有效的发挥抗肿瘤效应。由于正常人细胞中含有Asn合成酶，自身能够进行蛋白质合成且不会受到血浆中Asn水平的影响[4]，因此L-ASP对正常细胞不会造
谷氨酰胺合成酶活性的测定 一．试剂 （1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖） 称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。 （2）酶反应液 1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。 2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液） 除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。 （3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液） 称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。 （4）40mmol/L ATP溶液
称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。 二．实验步骤 （1）粗酶液的提取 取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液 （2）GS活性的测定 取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。三．结果处理及计算 GS活性[A540/(g·h）]= A540为540nm处的吸光度； m 为样品质量（g）； Vt为粗酶液总体积（mL）； Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）； t 为反应时间（h）。
培门冬酰胺酶化疗的不良反应及其护理 发表时间：2013-04-25T13:30:00.200Z 来源：《医药前沿》2013年第8期供稿作者：赵静徐晓军严桂芳 [导读] 培门冬酰胺酶是近年来应用于急性淋巴细胞白血病（ALL）化疗的新药。 赵静徐晓军严桂芳（浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科浙江杭州 310003） 【摘要】培门冬酰胺酶是近年来应用于急性淋巴细胞白血病（ALL）化疗的新药。本文通过对我院20例应用培门冬酰胺酶化疗的ALL患儿临床资料的回顾性分析明确护理要点。培门冬酰胺酶注射后90%患儿出现低纤维蛋白原血症，一般在注射后7天左右降至最低点。此外还可出现过敏反应、低蛋白血症、高血糖等表现，严重者出血过敏性休克。因此，培门冬酰胺酶化疗过程中应警惕过敏反应。要定期监测凝血功能、生化指标、血糖，做好饮食控制及对症支持治疗。 【关键词】急性淋巴细胞白血病培门冬酰胺酶护理儿童 【中图分类号】R473.73【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）08-0234-02 左旋门冬酰胺酶是急性淋巴细胞白血病治疗中的关键药物，对于提高患者的长期生存率具有重要作用[1]。但由于其为异种蛋白，化疗过程中需要反复应用，因此存在较高的过敏率（可达25～30%）[2]。培门冬酰胺酶（PEG-Asp）是由水溶性人工合成的化学聚合体PEG与门冬酰胺酶蛋白共价连接而成，它能有效降低门冬酰胺酶过敏反应的发生，且疗效相当[3]。本文总结了本院近半年来20例应用培门冬酰胺酶化疗的病例，对其副反应及护理措施报道如下。 1.临床资料 1.1 病例：201 2.7-2012.11在我院血液肿瘤科住院应用培门冬酰胺酶化疗的急性淋巴细胞白血病患儿20例。其中男性13例，女性7例，中位年龄7.3岁（2.1岁～15.3岁）。 1.2 应用方法：培门冬酰胺酶根据体表面积给药，剂量为2500 IU/m2，每14天应用一次。用法为肌内注射（一般选择双臀部肌肉），单一部位注射剂量应小于2ml，若使用量超过2ml，则需要多部位注射。 1.3 不良反应监测：注射后严密观察有无过敏反应表现。每日监测血糖，每周至少两次监测生化（白蛋白、球蛋白、肝功能、肾功能、淀粉酶）、凝血谱（纤维蛋白原，凝血酶原时间[PT]，活化的部分凝血活酶时间[APTT]，出血时间，D-二聚体）和血气电解质。 1.4 结果：20例患儿中，18例（90%）患儿在培门冬酰胺酶注射后1-2周内出现不同程度的低纤维蛋白原血症，15例患儿的最低水平在1.0g/L以下。纤维蛋白原一般在注射后7天左右降至最低点，虽然反复输注血浆或纤维蛋白原，但90.9%患儿的低纤维蛋白原血症持续至2周或更长时间（图1）。14例患儿出现APTT延长，5例患儿出现出血时间延长，本组患儿汇总并未出现PT延长的患儿。3例患儿出现低白蛋白血症。1例患儿出现继发性高血糖，经过饮食控制后血糖降至正常水平。3例患儿出现过敏反应，2例为皮疹，1例出现过敏性休克。本组病例未出现急性胰腺炎表现。 2.护理体会： 2.1 过敏反应： 2.1.1 药物准备：根据药物说明书，培门冬酰胺酶在注射前无需进行皮试。但临床应用过程中确实存在一定比例的过敏反应，严重者出现过敏性休克。因此在注射的时候，应准备好抢救用的药物和设备。如地塞米松等糖皮质激素类药物、肾上腺素、苏打等药物及供氧系统、吸痰器、加压面罩等设备。 2.1.2 过敏反应的观察：药物过敏反应的表现比较多样。轻者出现皮肤潮红、风团样皮疹伴瘙痒、眼睑口唇肿胀。有喉头水肿者出现刺激性咳嗽、胸闷、气急及喘憋症状。有过敏性休克者可表现为心悸、出汗、面色苍白、四肢厥冷、脉搏细速及血压下降。部分患者甚至以意识状态改变及神经系统症状为主要表现。 2.1.3 过敏反应的处理：对于单纯皮肤黏膜表现者，可根据医嘱口服非那根等抗过敏药物，外用炉甘石洗剂，继续观察有无病情进展。对于呼吸道症状者，立即给予吸氧，监测血氧饱和度，必要时根据医嘱给予激素、肾上腺素及支气管扩张剂的雾化吸入，乃至静脉应用激素及肾上腺素等抗过敏药物。对于出现过敏性休克者，应立即生理盐水扩容、静脉应用激素及肾上腺素等药物、吸氧、勤监测血压至病情缓解，并继续观察至少48小时以防病情反复。对于有过敏表现者，应常规监测血压。 2.2 凝血功能异常： 培门冬酰胺酶应用后，90%的患儿可以出现凝血功能异常，因此，需要加强凝血谱的监测，每周至少检查2次凝血谱，持续2周以上。对于单纯低纤维蛋白原血症者，可补充法布莱士或血浆，对于纤维蛋白原降低合并PT、APTT延长者，应积极输注血浆。护理过程中注意观察患儿有无鼻衄及牙龈出血、消化道及泌尿道出血、颅内出血征象。尽量减少有创操作机会，集中采血，采血后注意局部延长按压时间。但另一方面，由于门冬酰胺酶导致活性蛋白C的合成减少，从而引起纤维蛋白溶解能力下降，机体处于高凝状态，有导致深静脉血栓的风险[4]。因此，应用过程中需要测量深静脉置管附近及对侧肢体的周径，观察有无肿胀及疼痛不适。 2.3 继发性高血糖： 在化疗方案中，培门冬酰胺酶常与激素合用。因此，在应用培门冬酰胺酶前应检查血糖和/或尿糖，排除原发性糖尿病或化疗引起高血糖可能。应用过程中，每日晨起监测血糖，若 >7.0 mmol／L，立即报告医生进行必要的处理。出现血糖异常增高者，根据医嘱必要时停用化疗。一般首先采用饮食疗法进行控制，饮食应有规律，定时定量，少量多餐，控制每日摄入的热卡，宜食各种清淡新鲜蔬菜和豆类、低脂、高蛋白、适量纤维素的食物，禁忌进食辛辣刺激、油炸、食物。饮食控制不佳者，需要静脉应用胰岛素控制者。同时对于化疗后胃纳差的患儿应警惕发生低血糖。 2.4 急性胰腺炎： 临床研究表明培门冬酰胺酶应用期间胰腺炎的发生率在1.5%左右[4]。其主要的临床表现为腹痛，上腹部为主。故化疗期间应注意观察患儿有无腹部症状，必要时告知医生查血尿淀粉酶、腹部B超或CT。培门冬酰胺酶化疗期间的合理的饮食管理对于胰腺损害的预防具有重要作用。在应用培门冬酰胺酶过程中及用药前后应选择低脂蛋白、清淡易消化食物，然后逐步过渡到普通饮食。 2.5 出院宣教： 培门冬酰胺酶应用比较方便，只需一次肌注，效应可维持2周。部分病人会在化疗方案中其他药物疗程结束时选择出院，而此时培门
左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴白血病的观察及护理 发表时间：2013-10-12T08:44:55.670Z 来源：《医药前沿》2013年第27期供稿作者：王娟 [导读] 10例患儿有1例会出现过敏反应，4例胃肠道反应，2例肝功能损害，6例骨髓抑制，2例皮肤粘膜损害，无其它不良反应。王娟（山东省枣庄市市中区枣庄市立医院内六科 277100） 【摘要】观察左旋门冬酰胺酶治疗急性淋巴白血病毒副作用并实施有效护理。方法对10例小儿急性白血病患者进行门冬酰胺酶药物化疗，门冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病关键药物之一，并能提高疾病缓解率和患儿生存率但存在毒副作用。结果本组患儿病情缓解有效延长生存期。结论对应用左旋门冬酰胺酶的得患儿形精心护理，是减少毒副作用的主要措施。 【关键词】白血病急性左旋门冬酰胺酶毒副作用护理 【中图分类号】R473.72 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）27-0303-02 门冬酰胺酶是治疗急性淋巴性白血病的关键药物之一，在提高儿童急性白血病的持续完全缓解起着重要作用，并与ALL患儿的无病长期存活有着密切关系，但是门冬酰胺酶有多方面不良反应，如坏死性胰腺炎、血糖升高、血液系统异常、消化道反应、门冬酰胺酶相关脑病、过敏反应等。现我院血液科至2010年1月—2011年6月对10例患儿采用门冬酰胺酶治疗ALL进行观察及护理现报告如下： 1、资料与方法 1.1 临床治疗与方法：本组男4例、女6例，年龄3-10岁，平均6.5岁，10例均为两次使用门冬酰胺酶，均在诱导缓解巩固治疗阶段后，骨髓化验检查完全缓解后应用门冬酰胺酶治疗。 1.2 方法：于巩固治疗1—3周，血常规、尿常规，肝肾功能正常后经行10天一疗程。 2、结果 10例患儿有1例会出现过敏反应，4例胃肠道反应，2例肝功能损害，6例骨髓抑制，2例皮肤粘膜损害，无其它不良反应。 3、护理 3.1 心理护理：注射前医生与家属应进行沟通将门冬酰胺酶治疗的重要性及可能发生的不良反应告知家属，征得同意后方可进行，此时患儿及家长缺乏相关知识认识有局限性。尤其是儿童心理独特性在化疗过程中护士要体贴患儿及家属做好耐心细致的解释工作，分散患儿注意力与患儿交谈消除患儿恐惧，陪伴看图书，鼓励患儿及家属表达其情绪并耐心解答他们提出的相关问题，树立患儿及家属治疗的信心，并安排患儿信赖熟悉有良好沟通技巧的护士进行护理，使患儿对护士产生信赖感。 3.2 病情观察：门冬酰胺酶溶液是一种酶类制剂易容起变态反应。首先要严格执行无菌操作，正确配制皮试液现配现用，准确判断门冬酰胺酶皮试结果，每次门冬酰胺酶注射剂量严格标准执行，不能够过量，准确及时调节滴速，严密观察患儿病情变化及患儿反应，用药开始20分钟内有专门护士守护在床边进行观察，如无不良反应以后每15-20分钟巡视一次护士要与患儿沟通。听取不适主诉，询问时尽量不使用暗示性语言如是否感到心慌、胸闷、憋气、瘙痒等。主要通过客观表现观察患儿的过敏症状，观察患儿生命体征变化，如若出现皮肤发痒、心慌、面色苍白、烦躁不安等症状要立即停药，通知医生及早处理。因此用药后密切观察患儿病情变化以防过敏反映的发生。 3.3 皮肤粘膜损害：应用门冬酰胺酶化疗时如若多次注射或药物外渗会引起静脉炎或皮肤坏死固应注意：（1）保护血管：首先要选择大血管使用BD小号静脉留置针以防患儿易动而引起血管损伤，安排穿刺技术精湛，患儿信赖熟悉的护士给予穿刺，确保一次成功。静脉注射时要先用生理盐水冲洗，确定针头位置完全在静脉内方能注射药物。如果出现或疑有外渗，应立即停止注射并迅速回抽，由原位抽取3ml 血液后局部冷敷，然后用25%MgSO4湿敷，以防发生坏死，应用L-Asp化疗后引起口腔黏膜损害的要交替使用双氧水，洗必泰和制霉菌素护理口腔感染疗效好，能有效抑制口腔溃疡发生。 3.4 胃肠道反应：本组患儿有4例不同程度地恶心、呕吐和演示，要安慰患儿，分散患儿注意力，与患儿交谈，看图画书，用和蔼的语言与患儿交流（给患儿家属饮食指导，配合工作）用药前给予胃复安类药物静滴，较重者使用止吐剂口服恩丹西酮片或静推恩丹西酮。指导家属注意饮食卫生，少食多餐，宜进清淡、新鲜、少渣，刺激性小的饮食，勿进甜食和易产气食物如牛奶成豆制品等，进食前后休息一段时间，当患儿恶心、呕吐的不要让其进食。 3.5 肝功能受损，L-Asp对肝功能有损害作用，本组有2例用药后一至二月转氨酶升高，因此用药时应观察患儿患儿有无黄疸，用药前要检测肝功能，转氨酶偏高者慎用或不用，鼓励患儿饮水利于毒素排出，并使用护肝药物如甘利欣或谷胱肝肽等药物治疗，本组两例经治疗后肝功能恢复正常。 3.6 骨髓抑制：任何化疗药物均可引起，多数化疗药物抑制骨髓至最低点时间为7～14天，护肤时间为之后的5～10天，要将患儿安排在单人房间，限制过多谈事，保持环境舒适、安静，每天给予空气流通、紫外线消毒病室，从化疗开始到停止化疗2周应加强消防感染和出血措施，护理人员在操作时要严格无菌操作化疗中必须定期查血常规，每次疗程结束必要时做骨髓穿刺，及时观察疗效及骨髓受抑制情况，但白细胞<2.0X109/L，血小板<300×109/L时应给予提升白细胞药物，并加强营养。 参考文献 [1]贺秋平，张春霞.小儿左旋门冬酰胺酶过敏反应的抢救与护理8例，中原医刊，2005，32（22）：93. [2]卢愿，孙立荣，吕淑华等.左旋门冬酰胺酶的副作用及处理（附43临床病例分析），中国小儿血液，2004，9（1）：25-27.
乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达 刘俊红1,2,刘顺谊2,殷志敏2 (1.安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000) (2.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097) [摘要] 以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L 2谷氨酸:氨连接酶,Glutam ine Synthetase,GS EC 6131112)蛋 白表达宿主菌株BL21(DE3)(pET3C /谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助S DS 2P AGE 分析方法,对于用乳糖 诱导由T7lac 启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究,分别比较了最佳诱导起始生长量、 所需乳糖的浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素及不同培养基等参数对重组产物表达的影响.实验结 果表明,对于T7lac 启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,诱导产物的 表达量、可溶性及酶活与I PTG 诱导产物基本接近.本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌谷氨酰 胺合成酶工业化生产提供了一定的参考依据. [关键词] 谷氨酰胺合成酶,原核表达,乳糖,I PTG [中图分类号]Q 78 [文献标识码]A [文章编号]100124616(2006)0320066205 Expressi on of Reco m b i n an t Glut am i n e Syn thet a se i n Escherich ia coli I nduced by Lactose L i u J unho ng 1,2,L i u S hunyi 2,Yi n Zh i m in 2 (1.College of L ife Science,Anhui Nor mal University,W uhu 241000,China ) (2.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210097,China ) Abstract:L 2Glutam ine is mainly p r oduced by fer mentati on,rarely by enzy me reacti on .Gluta m ine Syn 2 thetase gene is a mp lified fr om Bacillus Subtilis gnd cl oned int o p r okaryotic exp ressi on vect or pET3C .Af 2 ter the transf or mati on of this recombinant p las m id int o BL -21(DE3),Lact ose and I PTG (is op r opyl 2 β2D 2thi ogalact o 2pyranoside is op r opylthi o 2β2D 2galact oside )are used t o induce gene exp ressi on at 37℃re 2 s pectively .Both of the m can induce the exp ressi on of the Gluta m ine Synthetase gene efficiently .The in 2 fluences of culture conditi on such as the lact ose concentrati on,gr owth mediu m compositi on,the durati on of the inducti on and the re -additi on of lact ose on the exp ressi on of the recombinant p r otein are analyzed in detail .The inducti on efficiency of lact ose is basically the sa me as that of I PTG,which p r ovides the evi 2 dence that lact ose could be a p r om ising inducer in the future large scale p r oducti on of recombined Gluta 2 m ine Synthetase . Key words:Gluta m ine Synthetase,p r okaryotic exp ressi on,lact ose,I PTG 收稿日期:2005211228. 基金项目:国家教委留学回国人员基金(2002S WXS BJBC22)、南京师范大学人才基金(2001S WXXG QB914)资助项目. 作者简介:刘俊红,女,1970—,博士研究生,讲师,主要从事细胞生物学的学习与研究.E 2mail:liujunhong700911@yahoo https://www.doczj.com/doc/d44941846.html, 通讯联系人:殷志敏,1963—,教授,博士生导师,主要从事生物化学及细胞生物学的教学与研究.E 2mail:yinzhi m in@njnu .edu .cn 0 引言 L 2谷氨酰胺是一种对人体十分有益的氨基酸衍生物,它在氨基酸代谢中具有极其重要的地位,已广泛应用于营养补给、抗疲劳、胃肠道功能修复和提高人体免疫等方面,其市场需求量日渐增长. 目前国内外主要以发酵法生产L 2谷氨酰胺.近年来,酶法合成L 2谷氨酰胺已开始有少量研究[1,2],在 第29卷第3期2006年9月 南京师大学报(自然科学版)JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science ) Vol .29No .3Sep,2006
注射用左旋门冬酰胺酶 【药品名称】 通用名称：注射用左旋门冬酰胺酶 英文名称：L-Asparaginase for Injection 【成份】 LEUNASE注，系1瓶中含左旋门冬酰胺酶冷冻干燥品5000K.U.临用时溶解的注射剂。LEUNASE注，系1瓶中含左旋门冬酰胺酶冷冻干燥品10000K.U.临用时溶解的注射剂。（1K.U.是指LEUNASE在37C分解左旋门冬酰胺并在1分钟产生μmole时的量。）【适应症】 急性白血病（包括慢性白血病的急性转化例）、恶性淋巴瘤。 【用法用量】 通常，将1日量每公斤体重50-200 KU连日或隔日静脉滴注。应随年龄及全身状态适宜增减。 【不良反应】 成人似较儿童多见。1较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退等，过敏反应的主要表现为突然发生的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿。严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至致死。在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药为低。过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有在皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。另在某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。患者如感觉剧
烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。其他尚有食欲减退、恶心、呕吐、腹泻等。2少见的有血糖过高、高尿酸血症、高热、精神及神经毒性等。血糖过高患者有多尿、多饮、口渴症状，其血浆渗透压可能升高而血酮含量正常。高血糖经停用本品，或给适量胰岛素及补液可以减轻或消失，但少数严重的可以致死。高尿酸血症常发生在开始治疗时，由于大量肿瘤细胞快速破坏，致使释放出的核酸分解的尿酸量增多，严重的可引起尿酸性肾病、肾功能衰竭。取自大肠杆菌的门冬酰胺酶含的内毒素可引起高热、畏寒、寒战，严重的甚至可致死。精神及神经毒表现为程度不一的嗜睡、精神抑郁、精神错乱、情绪激动、幻觉，偶可发生帕金森综合征等。其他尚有白细胞减少、免疫抑制、口腔炎等。3罕见的有低纤维蛋白原血症、凝血因子Ⅴ、Ⅷ等减少、颅内出血或血栓形成、下肢静脉血栓及骨髓抑制等。凝血因子减少与本品抑制蛋白质合成有关。4其他：尚有血氨过高、脱发等。对出现的不良反应的性质要仔细分析，凡有可能引起严重后果的，应立即停用本品，并结合具体表现给相应的治疗措施，危急的要积极抢救。食欲不振，恶心，呕吐，腹泻，头晕，头痛，嗜睡，精神错乱.血浆蛋白低下和血脂质过高或过低，氮质血症和肝功损害。骨髓抑制，白细胞及血小板减少，贫血，凝血障碍，局部出血，感染等.有心血管系统症状，脱发，蛋白尿。个别可发生胰腺炎。可引起过敏反应，用前须作皮试。本品可引起过敏反应，且可发生于最初疗程，皮试并不能完全预测过敏反应的发生。反应包括：皮疹、荨麻疹、关节炎、呼吸窘迫等，半数患者可出现骨髓抑制症状。其他副作用包括发热、出血、消化道反应、肝肾功能损害、胰腺功能障碍、精神神经症状等。因可出现过敏反应，初次使用及经1周或1周以上间隙再次使用时，均应作皮内试验。皮试阳性反应者作初次治疗以及对过敏反应属高危对象而仍有必要再次使用本药作重点治疗者，给予首剂前均应进行脱敏。一旦发生过敏应即用肾上腺素、吸氧和静注类固醇。用此酶治疗期间有发生各种感染的危险性，特别是革兰阴性菌感染增多。
谷氨酰胺合成酶活性测定 原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min，上清液即为粗酶液。2.反应 1.6ml 反应混合液B，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算：GS 活力(A·mg －1 protein·h －1 )＝式中A—540nm 处的吸光值；P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；T—反应时间（h）。