收稿日期：2013－11－20;修稿日期：2013－12－04
基金项目：国家自然科学基金(31271836);湖南省研究生创新课题(CX2012B290)作者简介：魏一枝(1990－)，女，硕士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。通信作者：
邓洁红(1967－)，女，教授，博士生导师，研究方向为园艺产品深加工理论与技术，通信地址:410128湖南长沙市芙蓉区湖南
农业大学食品科技学院
，E-mail :hongjiedeng@163．com 。花色苷纯化分离及鉴定研究进展
魏一枝1，邓洁红1，2，王维茜1，刘永红
3
(1．湖南农业大学食品科技学院，长沙410128;2．食品科学与生物技术湖南省重点实验室，
长沙410128;3．湖南生物机电职业技术学院，长沙410127)
摘要：花色苷是高等植物中最重要的水溶性色素。因其种类繁多、来源广泛、安全无毒并有一定的
营养和保健功效而引起国内外的广泛关注，具有十分重要的开发价值和广阔的应用前景。文中介绍了国内外花色苷分离纯化(层析法、高速逆流色谱、膜分离法、固相萃取)、以及花色苷鉴定(高效液相色谱-串联质谱法，核磁共振法)的研究方法，并对各种方法进行了分析评价。对全面认识和开发利用花色苷具有一定的参考价值。
关键词：花色苷;纯化;分离;鉴定
中图分类号：TS264．4文献标志码：A 文章编号：1005－1295(2014)01－0050－05doi ：10．3969/j．issn．1005－1295．2014．01．013
Ｒesearch on Isolation and Identification of Anthocyanins
WEI Yi-zhi 1，DENG Jie-hong 1，2
，WANG Wei-qian 1，LIU Yong-hong 3
（1．College of Food Science and Technology ，Hunan Agricultural University ，Changsha 410128，China ；2．Key
Laboratory of Food Science and Biological Technology of Hunan Province ，Changsha 410128，China ；
3．Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic ，Changsha 410127，China ）
Abstract ：Anthocyanins are the most important water-soluble pigment in plants．It caused widespread concern at home and abroad because of its variety and wide range of sources ，safety and rich in nutrition and health effects ，it has a very important development value and broad application prospects．The present paper mentioned some methods for anthocyanin separation and purification （chromatography ，high-speed countercur-rent chromatography ，membrane separation ，solid phase extraction ），and identification （high performance liq-uid chromatography-tandem mass spectrometry ，nuclear magnetic resonance spectroscopy ）．
Key words ：anthocyanin ；purification ；separation ；identification
0引言
随着人们对食品安全意识的提高，开发和应
用天然色素已成为食品色素行业的发展趋势。花色苷是一种重要的水溶性色素，花色苷的定性与定量、生理活性与功能、高效提取与绿色分离技术
以及结构稳定性一直是研究的重点。花色苷的提
取技术已经发展得比较成熟，国外多采用盐酸化
甲醇、丙酮、硫酸、乙酸或盐酸水溶液提取［1－3］
，国
内多采用柠檬酸、盐酸水溶液和酸化乙醇作为提
取剂，如今超声波和微波技术也用来辅助溶剂提取。随着技术的发展，超临界、高压脉冲电场、酶法提取，及亚临界萃取技术也被应用于花色苷提
取。但如何更好地纯化、分离，以获得价格低廉、高纯度而且性质稳定的花色苷是研究的目标。由于花色苷应用、产品研发工业化需求的增加，过去的纯化分离方法已经不能满足市场的需求。因此本文将对纯化分离及鉴定的技术研究进行综述。
1花色苷纯化分离
一般来说，经过提取后的花色苷粗品中往往含有很多有机酸、糖等杂质，产品质量稳定性差、纯度不高。为了提高产品的色价和稳定性，需要对提取物进一步纯化。纸色谱、薄板色谱和柱色谱是较传统的分离方法。近年学者们利用高效液相色谱法，以及高速逆流色谱、膜分离法、反相高效液相色谱对花色苷成功地进行了纯化。
1．1层析法
层析法是应用最广泛的一类纯化技术。根据固定相的不同，柱层析分离的原理有所不同。目前大多采用凝胶、聚酰胺、硅胶、离子交换树脂、大孔树脂等。但聚酰胺层析在花色苷中应用不多，主要用于黄酮类化合物的分离纯化。
1．1．1大孔树脂层析
在国内外分离纯化物质的若干方法中，利用大孔吸附树脂纯化天然植物色素是一种适合工业化生产的方法，该方法工艺简单，可不用或少用除乙醇之外的有机溶剂，安全性强，树脂再生容易，重复利用率高。国内外研究者应用大孔吸附树脂对多种植物色素进行了纯化。目前天然产物化学成分分离中最常用的树脂有三菱公司的HP系列、以及美国Ｒohn＆hass公司生产的Amberlite XAD系列。邓洁红在刺葡萄皮花色苷的研究中用了8种大孔吸附树脂发现HP-20树脂在纯化刺葡萄皮色素中，表现出良好的吸附性及洗脱性，优于其他几种树脂［4］。HP-20树脂静态吸附最优条件pH值为3、温度40?、其静态饱和吸附量达到32．0796mg/g湿树脂（色素原液浓度1．2357mg/ mL）。其解吸率可达到92%以上，树脂动态饱和吸附量达到39．00mg/mL湿树脂，色素液纯化后色价为原来的5．93倍。J．Chandrasekhar等在分离紫甘蓝中的花色苷时，基于洗脱剂液体的体积，解吸液体积及其中溶质的浓度做出了XAD-7的动态的吸附曲线和解吸曲线［5］，吸附的最佳工艺参数如下：在样品溶液中的花色素苷的浓度为0．21mg/mL，加工量为5．3BV，流速为2mL/min，温度为25?2?。解吸工艺的最佳参数：洗脱液的体积和流速为3BV（100%，v/v）乙醇和2mL/ min。为了检查最终产品（花色素苷）的稳定性，观察到纯化后糖的浓度，从初始224．7g/mL降低至0．07g/mL。色度值从34．05增加至46．67。表明花青素纯化后的稳定性增加。XAD-7HP显示最高吸附容量达0．84mg/mL，回收率92．85%。李杨等人以烟73酿酒葡萄为花色苷提取材料，采用HPLC分析方法，对10种树脂的吸附/解析效果进行了比较［6］。选定结果较优的XAD-7HP树脂进行纯化试验。花色苷的干物质中含量由处理前的48．16%提高到处理后的94．93%，色价由处理前的47．7提高到处理后的291．6，回收率为85．7%。在避光、pH值为3，4?的条件下存放7天，花色苷的保留率在95%以上，适宜于花色苷的短期保存。
1．1．2聚酰胺层析法
刘敬华等在蓝靛果花色苷分离纯化研究中以X-5纯化后的蓝靛果花色苷为原料［7］，以聚酰胺作为层析介质，以纯度和回收率为指标进行单因素试验，在此基础上应用响应面分析法，获得层析的最佳条件为：上样浓度为3．0mg/mL，上样体积为25mL，径长比为1?15，洗脱剂乙醇的浓度为60%，洗脱剂的流速为2mL/min，在此条件下纯化的花色苷的纯度达到34．85%，常规法用大孔树脂纯化的蓝靛果花色苷纯度大概在14% 18%，这样纯化的蓝靛果花色苷较大孔树脂纯化的花色苷纯度提高1倍左右，是未纯化的蓝靛果花色苷粗提物的14倍左右。
1．1．3凝胶柱层析法
凝胶层析也称排阻层析，工作原理是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。朱振宝等人初步研究了紫甘蓝花色苷在Sephadex LH-20凝胶层析柱上最佳的分离条件［8］，当以30%乙醇为洗脱液，流速为1mL/min时，紫甘蓝花色苷的分离效果最好。凝胶柱层析的优点是操作条件比较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处，但吸附力弱。刘亮等人采用柱层析法对荔枝果皮中主要的花色苷及低聚黄烷醇分离纯化时［9］，分别采用Amberlite XAD-16、ADS-17大孔树脂和Toyopearl TSKHW-40S柱层析相结合的方法纯化荔枝花色苷及低聚黄烷醇类化合物，分离纯化得
到1种花色苷和4种低聚黄烷醇化舍物单体，利用HPLC-MS、GC、NMＲ及CD等分析手段进行结构分析表明，纯化得到的花色苷为荔枝中主要的花色苷矢车菊素-3-芸香糖苷，以及4种低聚黄烷醇化合物。试验证实大孔树脂与Toyopearl TSKHW-40S凝胶柱层析相结合，可有效分离纯化荔枝中花色苷及低聚黄烷醇类化合物。同样，在其他天然产物的纯化分离中，研究者们也可利用结合层析的方法以得到更好的效果。
1．1．4离子交换树脂层析
目前在国内，离子交换树脂主要用于脂溶性化合物的纯化，管娜娜等在γ-氨基丁酸（GABA）的富集中采用0．02mol/L，pH5．6的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液进行富集后，采用D001大孔强酸性阳离子交换树脂对该富集液进行纯化试验［10］，调节富集液pH2．0，以2mg/mL的浓度上样吸附，2mol/L的氨水浓度进行洗脱，最终得到纯度为61．25%γ-氨基丁酸。邢庆超D-阿洛酮糖的分离纯化中采用001?7型阴阳离子交换树脂脱色脱盐，再通过DTF-Ca2+型离子交换树脂进行分离纯化［11］。得到最佳分离条件为柱温60?，10mL进样量，1mL/min流速。通过高效液相色谱测定，分离得到D-阿洛酮糖纯度为98．3%。在工业应用中，离子交换树脂的主要优点是处理能力大，脱色范围广，脱色容量高，能除去各种不同的离子，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低（虽然一次投入费用较大）。笔者认为利用夹带剂或者其他方法，也可以使离子交换树脂在花色苷的提取中发挥很好的作用。
1．2高速逆流色谱（HSCCC）
易建华利用HSCCC色谱法，采用正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水-三氟乙酸（2?2?1?5?0．01，V/ V/V/V）为溶剂系统，流速为2mL/min，主机转速设定为800r/min，紫外检测波长为254nm，并从紫甘蓝花色苷中分离得到得到3种化合物［12］。经HPLC检测，纯度分别为76．28%，45．46%，91．46%。李佳银等在试验中以新鲜紫锥菊花瓣为原料，用含0．1%HCl的60%乙醇为溶剂避光冷浸提取，经乙酸乙酯萃取和D101大孔吸附树脂（100mL，2cm?30cm）纯化后，得2．1g紫锥菊花色苷提取物干粉样品［13］。以水-正丁醇-甲基叔丁基甲醚-乙腈-三氟乙酸（6?3?2?1?0．001）为HSCCC分离溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，流速2．0mL/min，进样量160mg，通过一次分离得到2种花色苷单体化合物，经HPLC检测其纯度分别达95．1%（9．8mg）、98．2%（14．3 mg）。与传统的层析法相比，它具有高效、快速、操作简单、回收率高、制备量大等的优点，已经被广泛应用于天然产物的分离纯化和食品原料的开发利用等领域。
1．3膜分离法
膜分离技术是使用具有选择透过性的膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，物料依据滤膜孔径的大小而通过或被截留，选择性地透过膜，达到分离、提纯的目的。花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤（UF）、反渗透（ＲO）、电渗析（ED）等。Patil用溶剂提取提取红萝卜花色苷后用膜分离法有效脱醇并富集了花色苷，使花色苷含量从372．6mg/L提高到625．8mg/L［14］。之后在常温常压下采用渗透膜蒸馏的方法将其进一步浓缩至4850mg/L。
张亚红等采用D101大孔树脂和6000道尔顿分子量的超滤膜纯化技术对野生蓝莓花青素纯化后纯度可达35%以上［15］。试验中采用不同截留相对分子量的膜，不同规格超滤膜分离工艺，结果6000道尔顿的膜产品得率高达96．6%。万莹在紫薯花色苷的提纯工艺中分别对比砂芯过滤、微滤、超滤对紫薯花色苷色素粗提液纯化的影响［16］。确定了微滤－超滤联用的色素纯化工艺，且比对了纳滤与反渗透对超滤滤液的浓缩效果。膜分离纯化的花色苷色价和透明度高，稳定性好，容易实现连续化生产，生产过程劳动强度低，流程简单，但对设备要求高，纯化成本高，提取效率低。1．4固相萃取
固相萃取（Solid Phase Extraction SPE）就是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。这种方法曾突破性地应用在油脂中萃取胆固醇，吴钟玲等利用SPE使萃取纯化和结合态胆固醇的水解同时进行，大大简化了试验的操作步骤［17］。L．C．Kerio等在研究肯尼亚茶花青素的提取和鉴定中，用18C固相萃取（SUPELCO，SPE美国Sigma-Aldrich公司），经HPLC法检测，绿茶中花色苷浓度从198ug/mL上升至1193．4ug/mL，而红茶中的花色苷浓度由124．5ug/mL上升至590ug/mL［18］。陈亮等人在利用固相萃取时，采用Zorbax SB－18C色谱柱（250mm?4．6mm，5μm），以甲醇－5%甲酸水溶液为流动相纯化野生桑葚中的花色苷［19］。与液－液萃取相比固相
萃取有很多优点：固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象，它采用高选择性的吸附剂（固定相），能显著减少溶剂的用量，简化样品于处理过程，同时所需费用也有所减少。一般说来固相萃取所需时间为液－液萃取的1/2，费用为液－液萃取的1/5，有利于这种方法的工业化。
2鉴定
现已发现的花色苷有500多种，而且每年不断有新的花色苷被发现。花色苷的鉴定已经由过去的光谱分析法发展到了液质联用及核磁共振法。
2．1高效液相色谱-串联质谱法
高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）是目前花色苷鉴定中应用最为广泛的分析方法。陈亮等人在利用固相萃取纯化野生桑葚的花色苷后，再用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术鉴定了桑葚中3种花色苷并得到其相对含量［20］。舒希凯等人在鉴定芍药花色苷时首先用含0．1%盐酸的甲醇溶液提取芍药中的花色苷，经XDA-7大孔树脂纯化后，用高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行紫外-可见光谱和质谱分析鉴定出4种花色苷。杨智勇等人采用超高效液相-三重四极杆串联质谱法对我国紫色马铃薯品种“黑金刚”中花青苷进行组分和含量分析，鉴定出其中主要含有7种花色苷［21］。液质联用技术不仅克服了色谱法缺少标准品的缺陷，大大提高了花色苷鉴定的准确性，对高沸点、难挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定也具有独特的优势。
2．2核磁共振法（NMＲ）
E．Ferrari等利用NMＲ对红葡萄酒中的花色苷进行了鉴定［22］。舒希凯采用聚酰胺柱层析、C18柱色谱、高效制备液相色谱、高速逆流色谱等方法对芍药花分离得到16个化合物［23］，经过质谱、1H-NMＲ和13C-NMＲ并和参考文献对比，鉴定出16种化合物中的8种化合物是首次从在该种植物分出。闫倩倩利用LC-MS、1H-NMＲ和13C-NMＲ波谱分析［24］，鉴定出在以往的报道中以花色苷结合的方式存在于紫甘薯中为咖啡酰类物质，包括咖啡酰基奎宁酸和咖啡酰基二糖苷二类，5-咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-二咖啡酰基奎宁酸，而咖啡酰基-β-D-呋喃果糖基-α-D-吡喃葡萄苷和反式4，5-二咖啡酰基奎宁酸在紫甘薯的块根中还是首次发现。研究证明此方法具有极高的选择性，且制样方便，测定快速，重现性好。目前低分辨率NMＲ法已成为食品工业应用较为广泛的技术。
3结束语
有关花色苷的纯化分离方法已日渐成熟，逐渐由层析技术（包括柱层析，聚酰胺层析，硅胶层析，离子交换树脂层析，大孔树脂层析）向膜分离等高新技术转变，而花色苷的鉴定逐渐由过去单一的色谱法向联用技术转变。这些技术不仅能够提高提取纯化过程中花色苷稳定性，而且其快速高效精准的特点，为研究者节约了时间及成本。另外，随着人们对食品安全问题关注度的提高，合成色素的使用越来越受到限制，天然色素的优越性日趋明显。天然色素较高的使用安全性和功能性，具有更加广泛的发展空间和前景。
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（上接第37页）
（2）高容量电容器低压充放电可以获得较高的单次脉冲能量和脉冲磁场峰值强度；当充电电压为400V时，脉冲磁场的峰值强度可以达到4T 左右；
（3）电容限流的充电方式可以提高脉冲电源的充电效率，可编程控制技术可以实现脉冲磁场的自动充放电。
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槐花米中芦丁的提取与鉴定 背景知识 芦丁（Rutin）又称芸香苷，广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica L 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高(含量可达12-16%)，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水形成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有3分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10 000；沸水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又可析出，因此，本实验采用碱提取酸沉淀法提取芦丁。 芦丁具有维生素P样作用。能维持血管的正常通透性，减低血管的脆性，缩短流血时间，可作为高血压病的辅助治疗剂。亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。
一、实验目的 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作；熟悉芦丁、槲皮素的结构性质和检识方法。 二、实验要求 独立完成实验，从槐花米中提取出芦丁并进行鉴定。 三、实验原理 芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制。 四、实验材料和器皿 【器皿】 烧杯（500ml）2个，试管2个，布氏漏斗1个，玻璃棒1根，抽滤瓶1个，滴管，移液管（10ml）1根，洗耳球1个，滤纸，pH试纸，电热炉，真空抽滤机。 【材料】 槐米花30 g，饱和石灰水，0.4%硼砂水溶液，镁粉，pH试纸，浓盐酸，95%乙醇，10% α萘酚乙醇溶液，浓硫酸，蒸馏水。 五、实验内容 操作步骤： 称取30g槐花米于研钵中研成粉状物，置于500mL烧杯中，加入饱和石灰水，加热至沸，并不断搅拌，煮沸30分钟后，趁热抽滤。然后用浓盐酸调节pH值为4~5。放置1-2h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用水洗涤2~3次，得到芦丁的粗产物。 流程图：
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
2011届本科生毕业论文 题目芦丁的提取分离及鉴定作者单位陇东学院化学化工学院指导老师胡浩斌 作者姓名张娜娜 专业班级2007级化学本科(2)班提交时间二〇一一年四月
2011届本科生毕业论文 芦丁的提取分离及鉴定 张娜娜，胡浩斌 （陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000）摘要：目的以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。 关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定 Extraction, Seperation and Identification of Rutin Zhang Nana, Hu Haobin (College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu) Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method W ith the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result With water formulation,Buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) method of extraction rutin backflow separation,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yield,high sensitivity. determination method is simple to rutin rapid. Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification 引言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要， 1
9 紫甘薯花色苷组分抑制小鼠肝脂质过氧化的研究 王霞1,2，王花丽2，孟宇竹2 1.天津科技大学 (天津 300457)； 2.河南质量工程职业学院 (平顶山 467000) 摘要研究紫甘薯花色苷（APSP）中两种主要成分组分Ⅰ和Ⅱ的抗氧化活性，采用TBA荧光法测定其对小鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用及对Fe 2+-H 2O 2诱导的小鼠肝组织匀浆脂质过氧化的抑制作用。实验结果表明，APSP组分Ⅰ和Ⅱ均可抑制小鼠肝自发性脂质过氧化中MDA的生成，此抑制作用呈良好的剂量效应关系；APSP组分Ⅰ和Ⅱ可抑制Fe 2+-H 2O 2诱导的小鼠肝组织匀浆脂质过氧化中MDA的生成，说明可抑制·OH诱导的氧化作用，此抑制作用呈剂量效应关系。并且APSP组分Ⅰ抑制小鼠肝自发性脂质过氧化中MDA的生成和抑制Fe 2+-H 2O 2诱导的小鼠肝组织匀浆脂质过氧化中MDA的生成的抑制率高于组分Ⅱ。 关键词紫甘薯花色苷组分；抑制；脂质过氧化 The Study on APSP Components Inhibitting Lipid Peroxidation of Rat Liver Wang Xia 1,2，Wang Hua-li 2，Meng Yu-zhu 2 1.Tianjin University of Science & Technology （Tianjin 300457）； 2.Henan Quality Polytechnic （Pingdingshan 467000） Abstract To study the antioxidant activities of Fra Ⅰand Fra Ⅱ in APSP. Inhibitory effect on lipid peroxidation of liposome spontaneous and induced by Fe 2+-H 2O 2 of rat liver tissue homogenates in vitro were tested by TBA fluorescence method. The Fra I and Fra II from APSP could restrain the spontaneous oxidation of oleic acid; inhibit the generation of MDA in oxidation of liposome which was spontaneous or induced by Fe 2+-H 2O 2 in rat liver tissue homogenates, obviously in a dose-effect relationship. At the same time, the Fra I has the stronger capability of inhibiting the generation of MDA and restraining the spontaneous oxidation of oleic acid than that of Fra II. Keywords APSP ；inhibit ；lipid peroxidation 紫甘薯花色苷(Anthocynins from Purple Sweet Potato，APSP)是从紫甘薯的块根中浸提出来的一种天然红色素，色泽鲜艳，无毒，无特殊气味，与其它同类色素相比性质较稳定，具有多重营养、药理和保健功能，是一种开发前景广阔的天然食用色素资源。 Kinnosuke(1992年)等鉴定紫色甘薯的两种花色苷化学结构为被咖啡酸和阿魏酸酰化的矢车菊素-3-槐糖苷-5-葡糖苷和芍药素-3-槐糖苷-5-葡糖苷[1]。 孙晓侠对紫甘薯花色苷进行了分离纯化及结构初步鉴定，同样得出了两种主要成分组分Ⅰ和Ⅱ分别为被一分子咖啡酸和一分子阿魏酸酰化的矢车菊素-3-槐糖苷-5-葡糖苷和被一分子咖啡酸和一分子对羟基苯甲酸酰化的芍药素-3-槐糖苷-5-葡糖苷，并对紫甘薯花色苷的混合组分进行了体外抗氧化活性的研究[2]。试验采用荧光法分别对组分Ⅰ和Ⅱ进行抗氧化活性研究，并比较它们抗氧化能力的强弱。1 材料与方法1.1 实验材料 通过柱层析和高效液相色谱分析分离纯化得到 紫甘薯花色苷组分Ⅰ和Ⅱ，其纯度分别为86.4%和84.2%；雌性小鼠，体重(20～25) g。1.2 实验方法 1.2.1 组分Ⅰ和Ⅱ抗氧化活性体外实验 1.2.1.1 对小鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用（TBA荧光法）[3] (1)溶液的配制 10%三氯乙酸(TCA)：称取10 g TCA用蒸馏水溶解后，定溶至100 mL； 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)：称取0.67 g TBA，用蒸馏水配制成100 mL（50℃水浴或室温下溶解，静置，用上清液）。 (2)组织匀浆的制备 取正常昆明种小鼠，禁食16 h后，脱臼处死，迅速取出内脏组织(心、肝、脾、肾)，用冷生理盐水(4℃)洗净血液，于冷生理盐水中剪碎，加冷生理盐水冰浴下于DY89-Ⅰ型电动玻璃匀浆机中匀浆，制备10%组织匀浆，稀释制备1%组织匀浆。 (3)样品处理 将紫甘薯花色苷组分Ⅰ和Ⅱ的干燥的粉末分别溶于蒸馏水,稀释成具有浓度梯度的溶液。 基础研究
实验二芦丁的提取及鉴定 （一）概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。实验目的和要求 实验目的 ①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ②通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 要求 ①要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。 ②能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 试验方法 芦丁的提取与分离（见下图） 芦丁的鉴定 ①芦丁的定性反应 取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ②芦丁的紫外光谱解析 取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。
收稿日期 :2013－11－20; 修稿日期 :2013－12－04 基金项目 :国家自然科学基金 (31271836 ; 湖南省研究生创新课题 (CX2012B290 作者简介 :魏一枝 (1990－ , 女 , 硕士 , 研究方向为农产品加工及贮藏工程。通信作者 : 邓洁红 (1967－ , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向为园艺产品深加工理论与技术 , 通信地址 :410128湖南长沙市芙蓉区湖南 农业大学食品科技学院 , E-mail :hongjiedeng@163．com 。花色苷纯化分离及鉴定研究进展 魏一枝 1, 邓洁红 1, 2, 王维茜 1, 刘永红 3 (1．湖南农业大学食品科技学院 , 长沙 410128; 2．食品科学与生物技术湖南省重点实验室 , 长沙 410128; 3．湖南生物机电职业技术学院 , 长沙 410127 摘要 :花色苷是高等植物中最重要的水溶性色素。因其种类繁多、来源广泛、安全无毒并有一定的 营养和保健功效而引起国内外的广泛关注 , 具有十分重要的开发价值和广阔的应用前景。文中介绍了国内外花色苷分离纯化 (层析法、高速逆流色谱、膜分离法、固相萃取、以及花色苷鉴定 (高效液相色谱 -串联质谱法 , 核磁共振法的研究方法 , 并对各种方法进行了分析评价。对全面认识和开发利用花色苷具有一定的参考价值。 关键词 :花色苷 ; 纯化 ; 分离 ; 鉴定
中图分类号 :TS264．4文献标志码 :A 文章编号 :1005－1295(2014 01－0050－ 05doi :10．3969/j．issn．1005－1295．2014．01．013 Ｒesearchon Isolation and Identification of Anthocyanins WEI Yi-zhi 1, DENG Jie-hong 1, 2 , WANG Wei-qian 1, LIU Yong-hong 3 (1．College of Food Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128, China ; 2．Key Laboratory of Food Science and Biological Technology of Hunan Province , Changsha 410128, China ; 3．Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic , Changsha 410127, China Abstract :Anthocyanins are the most important water-soluble pigment in plants．It caused widespread concern at home and abroad because of its variety and wide range of sources , safety and rich in nutrition and health effects , it has a very important development value and broad application prospects．The present paper mentioned some methods for anthocyanin separation and purification (chromatography , high-speed countercur-rent chromatography , membrane separation , solid phase extraction , and identification (high performance liq-uid chromatography-tandem mass spectrometry , nuclear magnetic resonance spectroscopy ． Key words :anthocyanin ; purification ; separation ; identification 0引言 随着人们对食品安全意识的提高 , 开发和应
实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定 芦丁(Rutin)亦称芸香甙(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L。)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达12%~16%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性。临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 槐花米中主要化学成分的结构及性质： 1.芦丁(Rutin) 淡黄色细小针状结晶，℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。 溶解度： 水：1:100(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:650(冷)，1:60(热) 吡啶：1:(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 2. 槲皮素(Quercetin) 即芸香甙甙元，为黄色结晶，mp.313℃~314℃(含2分子结晶水)，316℃(无水物)。溶解度： 乙醇：1:290(无水乙醇)，1:23(热) 可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。 3. 皂甙 粗品为白色粉末，mp.210℃~220℃(分解)。易溶于水、吡啶，能溶于200倍的甲醇中。酸水解后得白桦脂醇、槐二醇二种皂甙元及葡萄糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸内酯。 (1) 白桦脂醇(Betulin) 无色针晶，℃~252℃。能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二） 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
综合化学实验: 芦丁的提取分离和鉴定 芦丁简介: 芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophora japonica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。 中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。 芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 补充知识:
花青苷种类、提取及检测 一.种类 花色素均具有类黄酮的基本结构，由两个苯环和一个含氧杂环组成的(C6-C3-C6)C15化合物(如图)，根据B环羟基化和甲基化位置和数目的不同而将花色素主要分为六类:天竺葵色素((Pelargonidin)、矢车菊色素((cyanidin)、芍药色素(peonidin)(3＇-甲基矢车菊色素)、飞燕草色素(delphinidin)、矮牵牛色素(petunidin)(3＇,5＇-甲基飞燕草色素)和锦葵色素(malvidin)( 3＇,5＇-二甲基飞燕草色素)。不同植物中花色素发生糖苷化的位点(C3、C5和C7位等)和数目的差异，及酞化程度的不同使植物中存在着不同的花色素普，其结构复杂，但都以这六种花色素为基本结构(Grotewold，2006)。 二.提取 国内外学者对花青苷的提取做了大量研究，提取目的及目标花青苷不同，提取方法略有差异。花青苷易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶液，花青苷的稳定性受酶、温度、氧气、光、pH值、金属离子等理化性质的影响，在中性和碱性条件下不稳定。 提取过程常采用酸性溶液，酸能够破坏植物细胞膜并溶解水溶性色素，甲醇溶液提取效率高于乙醇及水溶液。花青苷一般用于食品着色，考虑到甲醇的不安全因素，一般选用体积分数为1%的乙醇溶液。采用盐酸酸化可保持提取液pH值较低，阻止无酰基花青苷的降解。随着盐酸被浓缩，pH 值升高，导致花青苷的降解。为获得更接近于天然状态的花青苷，采用弱有机酸或中性溶剂做初步提取，弱有机酸多用甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸和酒石酸，中性溶剂一般采用丙酮作提取剂。粗提后的花青苷提取液浓度很低，浓缩时一般不超过40℃，时间也不宜太长。 1. 2. 花青苷含量的测定：用0.1%的盐酸甲醇浸提叶片2 h后,测657nm、530nm处的吸光度。 3.
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材
一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.
实验一槐米中芦丁的提取、分离和鉴定 一、概述 槐米系豆科植物槐树（Sophora japonica L.）的花蕾（槐米）。具有清热、凉血、止血的功效，用于治疗便血、痔血，尿血、血淋，崩漏，赤血痢下，风热目赤，痛疽疮毒，还可用于预防中风。近年来被用作治疗高血压的辅助药物。 药理实验证明，槐花米具有调节毛细血管的渗透作用，抗炎作用，解痉、抗渍疡作用，影响脂质代谢，抗菌等多种生物活性。槐花米中主要含有黄酮苷，皂苷、甾醇和鞣质等成分，其中芦丁(Rutin)含量最高，达12～20%。 主要化学成分的结构及理化性质： 芦丁（rutin）：C 27H 30 O 16 ·3H 2 O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子 水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C 15H 10 O 7 ·2H 2 O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结 晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 二、实验部分 （一）实验目的 1、通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物提取分离的原理和操作。 2、掌握酸水解将芦丁生成槲皮素的方法。 3、掌握芦丁与槲皮素的鉴别方法，聚酰胺薄膜的操作方法，电子天平的使用方法。 （二）实验原理 1、芦丁的提取原理：芦丁中含有多个酚羟基，具有酸性，故用碱提酸沉法。 2、芦丁的分离原理：芦丁在沸水中溶解，在冷水中析出。 3、芦丁的鉴定原理：芦丁与槲皮素分别为黄酮类化合物的苷与苷元，用Molish反应可以进行鉴别，也可以利用聚酰胺的氢键吸附性质进行定性分析，Rf值也应不同。 （三）实验药材、仪器与试剂 1、药材：槐米50g(每组)。
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
参考教案：紫甘薯花青素提取、纯化及鉴定 食品都有一定的颜色特征,色泽的好坏直接影着消费者对食品的可接受性以及对其品质的评在食品加工业中常用的食用色素有合成色素和然色素两大类。合成色素是由人工合成方法所制的有机色素,具有较好的稳定性,着色强度高、经使用方便等优点。然而,随着医学毒理学和生物究的不断深人,发现曾允许使用的人工合成食用素中,大多数对人体都有不同程度的伤害,有的甚有致畸致癌致突变作用,在使用上逐渐受到限制。 天然食用色素即是源于天然资源的食用色素是从果蔬、动物及矿物质中提取得到或天然存在色素的合成复制品。如：类胡萝卜素、花青素、醌类色素、藻蓝素等，大多数天然色素对人体无毒无害,具有维生素活性,富含人体所需的营养物质,有些还对人体有医疗保健的作用。同时,绝大部分的天然色素着色自然,能更好地模仿天然物颜色,并具有特殊的芳香气味,添加到食品中会带来愉快的感觉,更能引起消费者的注意。因此,研究与开发无毒的天然食用色素已成为食用色素发展的总、趋势。 花青素(Anthocyanidins)属酚类化合物中的类黄酮类，是一种水溶性色素，一般存在于植物花瓣、果实的组织中及茎叶的表面细胞与下表皮层。其色泽随 pH不同而改变，由此赋予了自然界许多植物明亮而鲜艳的颜色。在自然状态下，花青素在植物体内常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等形成糖苷，称为花色苷(Anthocyanin )。现有资料表明花青素有二十余种，在植物中常见的有六种，即天竺葵色素(Pg)、矢车菊色素(Cy)、飞燕草色素(Dp)、芍药色素(Pn)、牵牛花色素(Pt)和锦葵色素(My)。它是由一定数量的儿茶素、表儿茶素缩合而成的聚合体，其分子结构中由于含有不对称碳原子(2位或 2，3位)，因此具有旋光性。花青素具有很强的极性，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，但不溶于乙醚、氯仿、苯等。另外，由于分子中有大量的酚羟基存在，因此具有弱酸性，可溶于碱性水溶液。 原花青素(proanthocyanidins)也是广泛存在于许多植物中的一大类聚多酚类化合物，其结构主要由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，因在一定条件下能分解为花青素而得名。按其聚合度的大小，可把原花青素分为低聚物(二～四聚体)和高聚物(五聚体以上)两类，其中尤以低聚原花青素(Oligomeric Proanthocyanidins，简称OPCs)的研究较多、作用较肯定。【*】 【*】张小军，夏春镗等，原花青素的资源及研究进展，2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集，2468-2483 紫色甘薯为旋花科一年生草本植物，具有多种营养、药理和保健功能, 紫甘薯红色素(PSPC, purple sweet potato color)是从紫甘薯的块根和茎叶中浸提出来的一种天然红色素,具有多种营养、药理和保健功能,是一种理想的天然食用色素资源。 紫色甘薯色素的主要成分为氰定酰基葡糖苷和甲基花青素酰基葡糖苷。研究表明, 紫甘薯红色素具有花青素类色素的一般通性,色调和稳定性易受pH值的影响;酸性时色素稳定,呈红色或紫红色,而碱性时不稳定,呈黄绿色;在酸性介质中色素在可见光区的最大吸收峰为540 nm。紫甘薯红色素的固态呈紫黑色，其稀酸液为鲜艳透亮的深红色， 1%色素液呈红。紫甘薯色素结构中所含的多个酚羟基，使它具有亲水性，能溶于水和无水乙醇、甲醇等低级醇类，不溶于石油醚和菜油等。又因PSPC分子中毗喃环1位上有一四价氧原子，使其紫甘薯色素的制备及生物学活性研究又具有碱的性质，因此PSPC在酸性溶液中极为稳定。花青素分子式：C15H11O6 ，分子量：287.246，结构如下： 植物中常见的花青素
实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别 一、实验目的 （1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。 （2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 二、实验原理 芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。溶解度情况如下： 水：1:10000(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:300(冷)，1:30(热) 吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。 三、实验内容 （一）芦丁(芸香苷)的提取 1. 取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH 8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤
蛋白质的提取与纯化 一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等
中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。