实验原理
BCA(bicinchoninic acid)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在562nm 处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。
实验准备
1. BCA定量试剂盒：含A液和B液
A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸钠，2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体混合后再调PH至11.25）B 液：4%硫酸铜
2.牛蛋白血清（BSA）
3.待测的蛋白样品
实验步骤
1.配置BCA工作液：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA 工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）
2.配置不同浓度的标准蛋白液（BSA），1ug/ul，2.5 ug/ul，5 ug/ul，7.5 ug/ul，10 ug/ul，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液（如待测样品溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。
3.取空白组（0ug/ul BSA）各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品5ul，加入96孔板。
PS：上图加样的量仅作为参考，蛋白液和BCA工作液的比例符合即可。
4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液，混匀，37度放置30分钟，（加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。PS：温度和放置时间可以调整，可在60度放置30分钟or室温放置2小时。
5.静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲线。
6.根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。
注意事项
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。
标准蛋白液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出现偏差，影响待测样品的浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置标准蛋白液，另一方面应使用精确度高的移液枪。
A液和B液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀，最后可见透明溶液。
为加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但切勿过热。
当结果出现空白组本身就有较高的背景，可用Bradford法重新测定蛋白浓度。
优缺点
优点：
测定快速简便，45分钟内完成
准确灵敏,检测浓度为5-200 mg/ml
干扰物质少，BCA法不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响，可兼容样品中高达5%的SDS，5%Triton X-100,5%的Tween 20
在一定浓度范围内，有良好的线性关系
检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝法蛋白定量
缺点：
与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够
蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果
BCA蛋白定量和Bradford法蛋白定量的区别：
1、Bradford法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA则没有选择性
2、BCA法蛋白浓度定量是二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuret reaction），一价铜离子和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。Bradford法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH 4 ) 2 SO 4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ） Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐
蛋白质定量的五种方法 令狐采学 方法一双缩脲法测定蛋白质浓度 [目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 [原理] 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 [操作] 取中试管7支，按下表操作。
各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算] (一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。 (三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。 [器材] 中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。 [试剂] (—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。 (二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加
水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。 (三)0.9％NaCl。 (四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg／m1作为蛋白质标准液。 (五)待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。 方案二Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 [目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 [操作] 取试管7支、编号、按下表操作：
定量蛋白质组学的方法有哪些？ 1背景和意义 从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病 理研究）已成为研究生命科学的主要手段。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。 2方法学介绍 目前较主流的定量蛋白质组学方法有 5 种，分别是Label-free 、 iTRAQ 、 SILAC 、 MRM(MRM HR) 、和 SWATH 。简述如下： 2.1Label-free Label-free 定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只 需要比较特定肽段 /蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变 化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。 Label-free 操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、 重复性要求较高，准确性也较标记定量差。因此，Label-free 技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。 2.2 iTRAQ iTRAQ 定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记 和定量，将多肽的含量转化为 114、115、116 和 117 同位素的含量 (或 113、114、115、116、117、118、119 和121 的 8 标记 )，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋 白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。 iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外 蛋白等，且定量准确，可同时对8 个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别 适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。金开瑞质谱平台应用 iTRAQ 定量技术，可鉴定多达 6000 种蛋白（以人 HepG2 为例），重复样品间的蛋白表达量 相关性可达到0.95 以上。 2.3SILAC SILAC 定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型 )或稳定同位素(中性或重型 )标记的必 需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经 5-6 个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基 酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋 白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积 比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。 SILAC 属于体内标记技术，更接近样品真实状态，标记效率高达100% ，且标记效果稳 1
分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
1．蛋白质的常规检测方法 凯氏（Kjeldahl ）定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化, 含氮有机物分解产生氨, 氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收, 再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲（NHCONHCONH是3分子的脲经180C左右加热，放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。 测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg） 优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 Folin- 酚试剂法 原理：Folin- 酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Folin- 酚试剂中的磷钼酸- 磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下, 蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
测定范围：20~250ug 优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效 缺点：①费时，要精确控制操作时间； ②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨 酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和脲素均会干扰反应。 紫外吸收法 原理：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm 处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比）。此外，蛋白质溶液在280nm的吸光度值与肽键含量成正比，利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较 大的干扰。 定氮法、双缩脲法、Filon- 酚试剂法和紫外吸收法为常用的 4 种古老的经典方法。 1.5 考马斯亮蓝法 原理：染料考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）及芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度呈正比。 优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。 缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同有较大的偏 ，因此用于不同蛋白质测定时 差。
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]
蛋白质检测方法汇总 2010-04-26 12:00:38| 分类：蛋白电泳| 标签：|字号大中小订阅 本文引用自啸月天狼《蛋白质检测方法汇总》 更多相关资料请查看https://www.doczj.com/doc/d25946110.html, 蛋白质检测方法汇总 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。 了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑： ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH | + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法灵敏度时间原理干扰物质说明 凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～20mg 中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不
蛋白质含量测定法 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH |+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 170
2NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2) (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 171
粗蛋白测定方法—凯式定氮法 粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以 6.25就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂
尿蛋白定量与定性是怎样的 尿蛋白定量与定性是怎样的？正常人尿中含有少量蛋白质，主要为白蛋白，24小时尿中含量约为40～80毫克，最多不超过150毫克。由于量少，常规定性检查为阴性，故临床上习惯于说正常人尿液无蛋白质。当尿中蛋白质浓度超过150毫克，日时，尿常规定性检查己能将此蛋白检出，此尿即称为蛋白尿。蛋白尿是肾炎的主要表现之一。 尿蛋白定性能判断病人是否有蛋白尿，并能通过半定量分析粗略估计尿中蛋白质含量。常用的检测方法有加热醋酸法及磺基水杨酸法等。试验结果尿液若无混浊及沉淀则为阴性，以(-)表示;若出现不同程度的混浊或沉淀则为阳性，用(+)～(++++)作半定量估计。尿蛋白定性(半定量)结果与其相应尿蛋白浓度间大致对应关系已显示见表1。 1.肾小球性蛋白尿：肾小球性蛋白尿(glomerular proteinuria)是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白通透性增高所致。是临床最多见的类型。见于多种原发或继发性肾小球肾炎。是由于缺血、中毒、免疫病理损伤破坏了滤过膜的完整性;或由于滤过膜电荷屏障作用减弱而致。 2.肾小管性蛋白尿：在正常情况下经肾小球滤出的中小分子蛋白质，几乎全被肾小管重吸收。当肾小 管疾病时，蛋白质重吸收受障碍，小分子蛋白质就会从尿中排出，包括β2-微球蛋白、溶菌酶、核糖核酸酶等。由于血液中小分子蛋白质浓度很低，故此类病人尿蛋白总量一般不超过2g，有时仅10mg，也可以蛋白尿存在。 3.溢出性蛋白尿：在某些疾病中，血中小分子蛋白浓度增加，如本周氏蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等：若滤液中浓度超过肾吸收阈限，就可以排出，见于骨髓瘤、血管内溶血性疾病。 4.分泌性蛋白尿：尿中IgA排泄增多，见于肾小管间质性肾病;髓袢升支厚段受炎症及药物刺激时，分泌粘液蛋白(Tamm Horsfell蛋白，T-H蛋白)增多。 5.组织性蛋白尿：组织遭受破坏后可以释放胞质中各种酶及蛋白质，若分子量小，肾小球滤液中浓度超过肾小管吸收阈限，就则可自尿中排出。该项蛋白液可以直接从肾小管排出，如癌胚抗原——aFP、溶菌酶、肾小管基膜抗原等。 因此，测定蛋白质的大小及性质对临床很有意义。SDS据丙酰胺凝胶电泳的应用更有实际价值。 总之，如果你没有学过医，那我告诉你，蛋白尿只是一个症状而不是病，治疗蛋白尿关键是认识他，为什么会有蛋白尿。糖尿病高血压是不是控制好了。 尿蛋白测定，包括尿蛋白定性和尿蛋白定量。 尿蛋白定性的临床意义： 尿蛋白定性有生理性的，也有病理性，其阳性程度与肾损害程度不一定成正比。糖尿病患者尿中持续出现尿蛋白阳性，除外泌尿系感染、原发性肾病外，应考虑糖尿病肾病的诊断。有专家认为，糖尿病肾病早期蛋白尿呈间歇性，只在劳动或运动后为阳性反应。因此，运动后尿蛋白检验对诊断糖尿病肾病的早期发现有一定的意义。
蛋白质分析方法 1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 评价： 总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——>蛋白质含量 灵敏度低，误差大，耗时长。 2、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH 配制。 （2）双缩脲试剂：称以 1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
蛋白质定量得五种方法 方法一双缩脲法测定蛋白质浓度 [目得］掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制。 [原理] 双缩脲（NH 2CＯNHCOＮH 2 )在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物, 称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键（—ＣＯＮH—)在碱性溶液中也能与Cu２＋反应产生紫红色化合物。在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一.操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差，而且特异性不高.除—CONH—有此反应 外，—CＯNＨ 2、—CＨ 2 ＮＨ 2 、-CS－NＨ 2 等基团也有此反应。 [操作］ 取中试管7支，按下表操作． 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟.用5４0nｍ比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。 [计算］ （一）在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L),并求出人血清样本得蛋白质 浓度. （三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L)。 [器材] 中试管7支,l毫升刻度吸管3支,10毫升刻度吸管１支，水浴箱，７21型分光光度计、坐标纸。 [试剂］
(—)6Ｎ NaOH:称取240ｇ氢氧化钠溶于1000mｌ水中。 (二）双缩脲试剂:称取CuS0 4·5H ２ O 3。0克,酒石酸钾9.0 克与碘化钾５. ０克,分别溶解后混匀,加6ＮNaＯH l00mｌ，最后加水至1000mｌ,贮于棕色瓶中，避光，可长期保存.如有暗红色沉淀出现,即不能使用. （三)０、９%NａCl． (四）蛋白质标准液(１0ｍg／ｍ1),称取干燥得牛血清蛋白100、０mｇ，以少量生理盐水溶解后倒入ｌ0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成ｌ0mg/ｍ1作为蛋白质标准液。 （五)待测血清样本:将人血清或动物血清用生理盐水稀释１0倍后再测定。 方案二 Foliｎ-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度[目得］掌握Loｗry法测定蛋白质浓度得原理. [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cｕ2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合 物使酚试剂得磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度得线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质得浓度. [操作] 取试管7支、编号、按下表操作: 生理盐水 生理盐水 立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟.用６6０ｎm比色,测定光密度值. 操作注意事项： 1.按顺序添加试剂 ２.试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下(试剂甲)易被破坏,因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙(磷目酸）在破坏前即被还原。 ［计算］ （一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
STEP 2. 实验原理 BCA（bicinchoninic acid）是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子 的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在562nm 处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白 浓度。 STEP1 Protein + Cu』■—■ Cir 实验准备 1. BCA定量试剂盒：含A液和B液 A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸钠，2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体混合后再调 PH至11.25） B 液：4%硫酸铜 2. 牛蛋白血清（BSA） 3. 待测的蛋白样品 实验步骤 Ctr+BCA' ■00C
III 7lien cool Read恥6?啤 50 parts 4 1 part^B1* Mix working eaqent Mix well Spectrophotometer 1. 配置BCA工作液：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA 工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配） 2. 配置不同浓度的标准蛋白液（BSA）， 1ug/ul，2.5 ug/ul，5 ug/ul，7.5 ug/ul，10 ug/ul，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液 （如待测样品溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。 3. 取空白组（0ug/ul BSA）各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品5ul，加入96孔板。 0.1 ml sample + 2.0 ml working reagent PS :上图加样的量仅作为参考，蛋白液和 BCA工作液的比例符合即可 4. 向各孔的蛋白液中加入 300ul的BCA工作液，混匀，37度放置30分钟, （加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。PS:温度和放置时间可以 调整，可在60度放置30分钟or室温放置2小时。 5. 静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲 线。 Incubate: 30 min. at 37 C
蛋白质的定量测定数据分析方法Preface 本方法只是个人的总结，一家之言，有问题请提出。相信广大同学自有深刻领悟！另外，由于某家实验做的不咋地，这是某家唯一的心血了-_-b，希望大家珍惜某家微薄的劳动成果。 10月24日重订By 周骥Pricinples 1、实验数据分析采用Excel或Origin作最小二乘分析，相信大家都会，这就不赘述了，只是强调分析时要选用截距为0的分析，即默认分析一般为y=kx+b，其中b ≠0，但此处标准曲线应选用b=0的情况，这两种分析出的k值是不同的。 (1) 对于Excel，要使所求回归值不含b项，按LINEST(Y,X,FALSE,TRUE) 设定即可，其中Y和X分别为所求对象的Y组和X组（本实验即吸光度A和蛋白浓度c）。 (2) 对于Origin，在linear fitting时选择fix intercept（固定截距），设定值为0，这样就只会给出slope（斜率）。此外，默认给出的是Adj R-Square（相关系数平方），需要开方才能得到R。目前发现，Origin8.0和Origin7.5界面有所差异，大家自己摸索一下。 2、对于Bradford法，有A=Kc（A：吸光度，c：蛋白浓度，K：吸光系数，即回归斜率），回归分析可以得到K，由此可从样品A求出c来，关键在于标准液的c的确定。 理论上，我们加入的是0~0.5ml的标准蛋白液，适量加入蒸馏水，并加入显色试剂后，体积最终为5.5ml，用UV测得的吸光度A即为此稀释后的溶液的浓度，对样品液也是一样，所以计算时应代入稀释的浓度来测算。 然而，这样计算是很繁琐的，毕竟除以5.5很难得到合适的数据。实际上，观察并进一步计算可以发现，由于显色试剂每次加入的浓度和体积是一样的，而加入前试液的体积也是一样的（0.5ml）。因为，我们是通过标准曲线求出A=Kc，只要A-c 正确的一一对应即可，K值大小不影响两者关系，所以完全没有必要将显色试剂的量计入，直接用0.5ml代入计算即可。 这样，已知标准BSA浓度为250μg/ml，由加入关系可得1~5管对应的蛋白容量/0.5，即0、50、100、150、200、250（μg/ml），从而代入A可求为c=250*V 蛋白标准液 出合适的K。又因为样品液直接加入0.5ml样品原液，所以可得到样品原液浓度为：A样品/K。 3、上述方法同样适用于Lowry法，谭师兄所测标准曲线的横坐标即采用不考虑5.5ml显色试剂，直接用1ml试液计算的方法，由上述已知计算所得浓度恰好可以符合图中情况。而样品液中，加入样品原液0.2ml，蒸馏水0.8ml，即稀释5倍。 /K)*5。 因而，Lowry法测算样品原液浓度为：(A 样品
蛋白质定量分析的十种方法（上） 1、凯氏定氮及分光光度法蛋白质定量分析 利用蛋白质含氮量进行检测的经典方法，定量精准，但操作繁琐，仅用于标定蛋白质标准品和校正其他测定方法。凯氏定氮法有半微量法、微量法及全量法。样品与H2SO4一同加热消化，分析有机物，释放出的NH3与结合，碱化蒸馏使氮游离，硫酸吸收，HCI或H2SO4标准溶液滴定，从而计算蛋白质的含量。该方法是以Hantzsch反应为原理所建立的一种测试蛋白质含量的新分光光度法。适用于各类食品中蛋白质的测定，且不需要特殊的凯氏定氮装置。取样少，消化时间短，精密度高准确度好，适用于大批样品同时测定，亦适用于微量蛋白质分析，是一种蛋白质快速、准确定量的新途径。 2、双缩脲法蛋白质定量分析 双缩脲法简便易行，但检测灵敏度相对较低，最低测定值100ug。必须在测定前先使蛋白完全沉淀，除去干扰物质，才能得到较准确的结果。除三氯乙酸作沉淀剂外，还可用钨酸、磷钨酸和Tsuchiya试剂，双缩脲法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近、干扰物质少，不受温度的影响。但灵敏度低，0.01吸光度相当于166.7ug蛋白，且操作复杂，很难用于自动化仪器分析。 3、Lowry法蛋白质定量分析 结合双缩脲法中铜盐反应与Folin-ciocalteau试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基Tyr和Try的迅速反应与肽链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应。而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色，在波长750nm处测定Amax. 4、BCA法蛋白质定量分析 BCA法的灵敏度为0.5-10ug/ml，其最低测定值与反应温度有关。有37摄氏度和60摄氏度2种反应温度：在37摄氏度时，一般适用于浓度较高的样品，但是色氨酸、络氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化；在60摄氏度时，一般适用于浓度较低的样品，色氨酸、络氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化，因此能大大提高检测灵敏度。 资料来源：网络平台分享，由百泰派克生物科技整理 百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，为广大科研工作者提供生物蛋白质定量分析服务，欢迎咨询！
蛋白质定量的五种方法 方法一双缩脲法测定蛋白质浓度 [目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 [原理] 双缩脲(NH 2CONHCONH 2 )在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为 双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外， -CONH 2、-CH 2 NH 2 、-CS-NH 2 等基团也有此反应。 [操作] 取中试管7支，按下表操作。 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算] (一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。 (三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。 [器材] 中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。
[试剂] (—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。 (二)双缩脲试剂：称取CuS0 4·5H 2 O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0 克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。 (三)0.9％NaCl。 (四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg ／m1作为蛋白质标准液。 (五)待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。 方案二 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度[目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 [操作] 取试管7支、编号、按下表操作： 生理盐水 生理盐水 立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。 操作注意事项： 1．按顺序添加试剂 2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。 [计算]