实验蛋白质的定量测定方法
【实验预习】
1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法的优缺点。
2.试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。
3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？
4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？
一、Folin酚试剂法(Lowry法)
【实验目的】
1.学习Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。
【实验原理】
蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
【实验用品】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO4?5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
(2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸及100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置于棕色瓶
中暗处保存。使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释(约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。
(3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移至100毫升容量瓶中，准确稀释至刻度，使蛋白质浓度1mg/mL。
(4)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
【方法步骤】
1. 绘制标准曲线
取7支试管，按下表分别加入各试剂
各管加入Fo1in酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在500nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm 处测定光密度值。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。【注意事项】
注意要准确配制所用试剂，准确量取各溶液。
【实验报告】
总结实验结果，并分析评价实验结果。
二、紫外吸收法
【实验目的】
1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm 的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
【实验用品】
1.实验器材
试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度计。
2.实验试剂
(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／mL的酪蛋白溶液。
(2)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
【方法步骤】
1. 绘制标准曲线
取 7 支试管按下列各表加入各试剂：
试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。
【注意事项】
注意要准确配制所用试剂，准确量取各溶液。
【实验报告】
总结实验结果，并分析评价实验结果。
三、凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
【实验原理】
凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。
当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。
蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。
【实验用品】
1.实验器材
微量凯氏定氮仪1套；50mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠
2.试验试剂
(1)浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01mol／L)。
(2) 粉末硫酸钾—硫酸铜混合物：K2SO4与CuSO4?5H2O以3：1配比研磨混合。
(3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。
(4)样品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。
【方法步骤】
1.安装凯氏定氮仪。
2.消化：取4个50ml凯氏烧瓶并标号,各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品1mL，催化剂(K2SO4CuSO4?5H2O)200mg，浓硫酸5mL。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3号及4号瓶中各加1mL蒸馏水和与1、2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照。在通风橱内进行消化。
在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。撤掉火力，冷却至室温。
3.蒸馏：
(1)蒸馏器的洗涤：用水洗涤干净微量凯氏定氮仪，在蒸汽发生器中加入用几滴硫酸酸化的蒸馏水和几滴甲基红指示剂，用这样的水蒸气洗涤凯氏定氮仪。约15分钟后，在冷凝器下端倾斜放好装有硼酸
指示剂的锥形瓶，继续蒸汽洗涤 2 分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。移走锥形瓶，停止加热，打开夹子。
(2)蒸馏：取下棒状玻塞，用吸管吸取消化液，细心地插到反应室小玻璃杯的下方，塞紧棒状玻塞。将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸没在液体内。取30％的氢氧化钠溶液10ml放入小玻璃杯中，轻提棒状玻璃塞使之流入反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约 5ml。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧夹子，开始蒸馏。氨气进入锥形瓶，瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。变色时起记时，再蒸馏5分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面，继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净，再继续下一个蒸馏操作。待样品和对照均蒸馏完毕后，同时进行滴定。
4.滴定：用0.01moL／L的标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿色变淡紫色为滴定终点。
【实验结果】
其中：
A 为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；
B 为滴定对照液用去的盐酸溶液平均mL数；
C 为所取样品溶液的mL数。
【注意事项】
注意不要让浓硫酸粘到衣服或皮肤上。
【实验报告】
总结实验结果，并分析评价实验结果，总结实验经验。
四、二喹啉甲酸法(BCA法)
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
27 第13卷 第8期 2011 年 8 月 辽宁中医药大学学报 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Vol. 13 No. 8 Aug .，2011 复方雄蚕蛾胶囊中总多糖和蛋白质含量测定 耿耘，马超英，李子阳，杨超，罗丽勤 （西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031） 收稿日期：2011-05-18 基金项目：四川省科技厅支撑计划资助项目（2008SZ0141）；四川省中医药管理局科技专项资助项目（2008-31）作者简介：耿耘（1959-）,女，河北石家庄人，教授，硕士，研究方向：中药药理学。 复方雄蚕蛾胶囊是由雄蚕蛾、枸杞子等3味药食两用中药组成的保健食品，临床应用证明其具有补肾壮阳、改善免疫及抗疲劳等功效，主要用于中老年人阳气亏虚、阴精不足或抗病能力下降、易疲劳等症者。为了有效地控制其质量，我们根据该保健食品中药物组成中的有效成分，采用检测该胶囊中多糖和蛋白质的含量来保证质量。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。现报道如下。 1 材 料 UV-265型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；微量定氮蒸馏仪一套（深圳三利仪器）；复方雄蚕蛾胶囊（由西南交通大学中药研究所提供，规格0.5g/粒，批号080915）；D-无水葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所，批号110833200503）。 2 方法与结果2.1 多糖含量测定 2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25mg，置250mL 量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻 度，摇匀，配制成每毫升中含无水葡萄糖0.1mg 的对照品溶液。 2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置具塞试管中，加水至2.0mL，各精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出后迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白。照紫外分光光度法，在490nm 波长处测定吸收度，以吸收度A 为纵坐标，对照品溶液质量浓度C(g ·L -1)为横坐标，得回归方程:Y=0.0141X+0.1642，r =0.9984，结果表明，无水葡萄糖在0.02~0.1g ·L -1范围内，其质量浓度与吸收度线性关系良好。2.1.3 供试品溶液的制备 取6颗胶囊，将其内容物置于三角瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀超声待糖全溶后，将杂质过滤，滤液置旋转蒸发仪中蒸发，蒸发完全后用无水乙醇溶解超声溶解充分，滤掉杂质，然后将滤液置旋转蒸发仪中蒸发，再用蒸馏水溶解，溶液移至250mL 摘 要：目的：建立复方雄蚕蛾胶囊质量控制的定性定量方法。方法：总多糖含量测定采用苯酚-硫酸显色 法[1]，在490nm 波长处测定吸收度，在0.02~0.1g·L -1范围内，其质量浓度与吸光度线性关系良好（r =0.9984）；蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[2]。结果：复方雄蚕蛾胶囊中总多糖的平均含量为5.9%，蛋白质平均含量为51.3%。结论：该方法操作简便、快速、灵敏度高和重复性好，可以作为复方雄蚕蛾胶囊的质量控制的定性定量方法。 关键词：复方雄蚕蛾胶囊；总多糖；蛋白质；含量测定 中图分类号：R-322 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2011) 08- 0027- 02Determination of Total Polysaccharides Content and Protein Content in Bombycidae Hung Capsule GENG Yun，MA Chao-ying，LI Zi-yang，YANG Chao，LUO Li-qin （College of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，Sichuan，China） Abstract： Objective ：To study the quality standard of bombycidae hung capsule. Method ：The contents of Total Polysaccharides were determined by phenol-sulfuric method [1] ,the detection wavelength was 490nm,from 0.02~0.1g ·L -1，The Linear Relationship was good between Concentrations and Absorbency of Total Polysaccharides（r =0.9984）；The content of Protein were determined by Micro - Kjeldahl method [2]. Result :The average contents of Total Polysaccharides was determined 5.9%，the average content of Proteinin was determined 51.3%，from Bombycidae hung Capsule. Conclusion ：The above method for the quantification was proved to have the advantages of simple operation, rapidity, high sensitivity and fine repetition, and it should be helpful for monitoring the quality control methods of Bombycidae hung Capsule. Key words：bombycidae hung capsule；total polysaccharides；protein；determination
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较 1．蛋白质的常规检测方法 1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大 1.2 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是3 分子的脲经180℃左右加热,放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合）,称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,因此可用来测定蛋白质含量。 测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg） 优点：较快速,干扰物质少,不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差； ②三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 1.3 Folin-酚试剂法 原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同,利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。 同时也由于Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比,由此可测定蛋白质的含量。 测定范围：20~250ug 优点：灵敏度高,对水溶性蛋白质含量的测定很有效 缺点：①费时,要精确控制操作时间； ②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、 糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应。
蛋白质的测定方法比较 一、分光光度法 1、测定原理： 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2、测定步骤： ①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 ③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm 比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ④试样测定：吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL 比色管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸
蛋白酶活性测定方法 一蛋白酶活力单位定义 1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。 二测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 三应用范围 本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。 四测定条件 4.1 底物：酪蛋白 4.2 pH： 3.00 4.3 温度： 40℃±0.5℃ 4.4 保温时间： 10min 五仪器 5.1 紫外分光光度计 5.2 超级恒温水浴40±0.2℃ 5.3 秒表 5.4 分析天平：感量0.0001g 六试剂和溶液 6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L 称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB 601配制。 6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L 按GB 601配制。 6.1.6 缓冲溶液 a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。 b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸(80%～90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL, 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 6.1.7 l0 g/L酪素溶液 称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。 6.1.8 l00μg/mL L-酪氨酸4)标准溶液
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制 ①浓硫酸：分析纯，95.5% ②80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） ③5%苯酚：取苯酚100 g，加铝片0. 1 g和碳酸钠0. 05 g，常压蒸馏,收集182℃馏分。称取 该馏分(100%苯酚)5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中， 冰箱中冷藏储存备用。 ④标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g经105℃干 燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。 2、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入6%（5%，9%）苯 酚0.5ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同 样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL）0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 6%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3 注意事项 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋
白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
分光光度法测定蛋白 酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na 2CO 3 ）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl 3 COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O） 0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用 1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测 定。
第九章多糖的测定 第一节淀粉的测定 ●一、测定淀粉含量对于决定用途具有重要意义： ●1、淀粉是供给人体热量的主要来源。 ●2、淀粉在食品中的作用是作为增稠剂、胶体生成剂、保潮剂、乳化剂、粘合剂等。 ●二、淀粉的测定方法： ●（一）淀粉的物理检验法：淀粉因其品种不同，淀粉的大小和形状也不同。用显微 镜分析法可鉴别不同品种的淀粉。 ●（二）淀粉含量的测定方法： ●1、酶水解法： ●（1）概念：淀粉用麦芽淀粉酶水解成二糖，再用酸将二糖水解为单糖，然后测定由 水解所得到的单糖。（还原糖） ●（2）常用于液化的淀粉酶是麦芽淀粉酶。它是?—淀粉酶和?—淀粉酶的混合物。 ●（3）酸直接水解法：淀粉的测定方法也可采用酸直接水解法，但酸水解法不仅是淀 粉水解，而且也能分解半纤维素，结果产生了具有还原力的木糖、阿拉伯糖等单糖，使淀粉测定所得的结果较实际含量偏高。 ●（4）酶水解法的优点：在一定条件下，用?—淀粉酶处理样品，则能使淀粉与半纤 维素等某些多糖分开来。因为?—淀粉酶具有严格的选择性，它只使淀粉液化变成低分子糊精和可溶性糖分，而对半纤维素不起作用。在用?—淀粉酶液化淀粉除去半纤维素等不溶性残留物后，再用酸水解使生成葡萄糖，所得结果比较准确。这种酶水解作用，叫作选择性水解。 ●（5）酶水解法测定淀粉的具体步骤： ●a:样品的处理：将磨碎样品置漏斗中，用乙醚50ml分数次洗涤，除去脂肪，再用10% 乙醇洗去可溶性糖分，先5次。 ●b:酶水解：将滤纸上残留物用水移至烧杯内，水浴加热直到淀粉糊化。冷却至60℃， 加麦芽汁20ml在60℃保温1小时，再重复加热冷却，保温冷却过滤，将滤液定容250ml。 ●c:酸水解，吸取滤液加入1：4硫酸，放在120—130℃油浴中保持沸腾5—6min用 40%NaOH 滴定至碱性。 ●d:用非林氏试剂测定葡萄糖含量，同时做空白试验。 ●e:计算：淀粉=[（A-B）*0.9*100]/[W*(50/250)*(V/100)*100] A:样品中淀粉相当于还原糖重量（mg) B:空白相当于还原糖的重量0.9：还原糖换算为淀粉因数 V/100：样液酸解后稀释100ml取Vml W：样品重量（g） 第二节纤维的测定 ●植物性食品内含有粗纤维，它集中存在于谷类的麸、糠、果蔬的表皮及其纤维样组 织之中。从现代营养学的观点来看，我们膳食中每天需要摄入一定数量的纤维（称为膳食纤维），它可防止包括阑尾炎、心脏病和结肠癌等多种疾病，所以，深入了解膳食纤维的特性及其分析方法更具有迫切的现实意义。此外，粗纤维的含量是果蔬制品的一项质量指标，借此可以鉴定果蔬的鲜嫩度。例如：青豌豆按其鲜嫩程度分为三级，其粗纤维含量分别为：一级1.8%左右，二级2.2%左右，三级2.5%左右。 ●一、概念： ●粗纤维：指动物饲料中那些对稀酸、稀碱难溶的，家畜（特别是反刍动物）不容易
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤] 1．标准曲线的绘制： 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量