病毒感染细胞实验整体 流程及原理 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
实验室安全管理制度及流程 一、实验室安全管理制度 ㈠要严格执行医疗管理法律、法规、医院医疗安全管理规定.加强实验室安全的监督和管理.对可能影响检验工作的安全隐患进行控制。 ㈡实验室和楼道内必须配置足够的安全防火设施。消防设备要品种合适.定期检查保养.大型精密仪器室应安装烟火自动报警装置。 ㈢走廊、楼梯、出口等部位和消防安全设施前要保持畅通.严禁堆放物品.并不得随意移位、损坏和挪用消防器材。 ㈣易燃、易爆药品专人专柜存放保管.并符合危险品的管理要求。剧毒药品应由两人保管.双锁控制.存放于保险箱内。建立易燃、易爆、剧毒药品的使用登记制度。 ㈤普通化学试剂库设在检验科内.由专人负责.并建立试剂使用登记制度。领用时应符合审批手续.并详细登记领用日期、用量、剩余量.并有领用人签字备案。 ㈥凡使用高压、燃气、电热设备或易燃、易爆、剧毒药品试剂时.操作人员不得离开岗位。 ㈦各种电器设备.如电炉、干燥箱、保温箱等仪器.以实验室为单位.由专人保管.并建立仪器卡片。 ㈧做好电脑网络安全工作.防止病毒侵入.防止泄密。 ㈨每天下班时.各实验室应检查水、电安全.关好门窗。等方 面进行安全检查.确保无隐患后.方可锁门离开。值班人员要做好节假日安全保卫工作。 ㈩检验过程中产生的废物、废液、废气、有毒有害的包装容器和微生物污染物均应按属性分别妥善处理.以保证环境和实验室人员的安全和健康。
（十一）任何人发现有不安全因素.应及时报告.迅速处理。 （十二）科主任要定期检查安全制度的执行情况.并经常进行安全教育。每月一次.召开医疗安全工作全员会议.总结发生的差错或事故.分析原因.排查医疗安全隐患和实验室不安全因素.提出整改措施。 二、实验室安全管理流程： ㈠工作人员和实验室安全的一般要求 1、实验室工作区内绝对禁止吸烟.杜绝易燃液体的潜在火种和传染细菌和接触毒物的途径。 2、实验工作区内不得有食物、饮料及可能摄入的其它物质。 实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。 3、眼睛和面部的防护：处理腐蚀性或毒性物质时.须使用安全镜其它保护眼睛和面部的防护用品。使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂.或有可能发生试剂溅溢的情况时.必须佩带护目镜、面罩。被血液或其它体液溅到,立即用大量的生理盐水冲洗 4、服装和个人防护装备：除要求符合实验室工作需要的 着装外.工作服应干净、整洁。所有人员在各一实验区内必须穿着遮盖前身的长袖隔离服或长袖长身的工作服。当工作中有危险物喷溅到身上的可能时.应使用一次性塑料围裙或防渗外罩。必要时佩戴手套、护目镜或面罩等。个人防护服装应定期更换以保持清洁.遇被危险物品严重污染.则应立即更换。盛放于能防渗的容器内。 5、在有可能发生液体溅溢的工作岗位.可加套一次性防渗漏鞋套。 6、工作人员佩戴工作帽.头发不外露。实验室操作不准佩戴首饰.防止污染。
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
ATCC? Number: CRL-2865? Price: $329.00 Designations: T47D-KBluc Depositors: VS Wilson Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: adherent Organism: Hom o sapi ens (human) Morpholog y: epithelial Source: Organ: mammar y gland; breas t Tissue: duct Disease: ductal carcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Cell T y p e: epithelialtransfected with reporter plas mid Permits/F orms: In addition to the MTA menti oned above, other ATCC and/or regulatory per mits may be required for the transfer of this ATCC material. Any one purchasing ATCC material is ultimatel y r esponsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the s pecific requirements for shipment to your loc ation. Reverse Transcript: N Age: 54 years adult HeLa Mar kers: N
实验室安全操作规范流程为了顺利地做好实验，保证实验成功，保护实验仪器设备，维护每个师生的安全，防止一切实验事故，特制订本安全操作规程。 一、未进实验室时，任课教师就应对本次实验进行预习，掌握操作过程及原理，弄清所有仪器的性能。估计可能发生危险的实验，在操作时注意防范。 二、实验开始前，检查仪器是否完整无损，装置是否正确稳妥。 三、每次实验课，教师必须强调安全注意事项和操作程序。教育学生要遵守纪律，严格按规程操作，发现异常现象立即向老师报告。如果教师未强调注意事项和操作程序，意外事故责任由教师承担；如果学生违反安全注意事项和操作程序，意外事故责任由学生承担。 四、做学生实验时，实验设备和电路按要求连接好后，经老师检查无误，统一供电后方可进行实验。使用电器时要谨防触电，不要用湿的手、物接触电源。实验后任课教师应立即统一切断电源。 五、若发生触电现象，首先切断电源，采取必要的救护措施。
六、灯火加热时要注意安全。在酒精灯快烧尽、灯火还没熄灭时,千万不能注入燃料；酒精灯熄灭时，要用灯帽来罩，不要用口来吹，防止发生意外；不要用一个酒精灯来点燃另一个酒精灯，以免酒精溢出，引起燃烧。点燃的火柴用完后立即熄灭，不得乱扔。 七、在进行力学等实验时，应告诫学生所使用的导轨、配重等物品的坠落，防止意外事故的发生。 八、温度计要轻取轻放，如有破损立即报告老师，不得用手触摸，以免割伤或中毒。汞洒落时，应尽快收集起来，并用硫磺粉盖在洒落的地方。 九、严禁在实验室内吸烟或饮食。实验完毕要细心洗手。 十、演示实验所用实验器材及药品，必须由任课教师亲自领取和归还，不能由学生代领、代还，防止中途丢失而造成事故。 十一、实验完毕后教师离开实验室前，要认真检查门窗和水电，一切无误后方可离开实验室。 阳光学校
细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
Seahorse XF实验流程 （此为简略版实验流程，详细步骤参见培训手册） XF实验前一天 1.种细胞：将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培 养。注：细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。 2.预热仪器：打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃， 过夜预热。 3.> 4.水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回 培养箱中过夜水化探针。 Utility Plate上，置于37℃无CO 2 XF实验当天 1.准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物， 将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至，过滤，置37℃水浴中备用。 注：检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。 2.】 3.观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。 培养箱4.细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO 2中1小时。 5.配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度。 6.加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A，B，C，D 四个加药孔中。 注：根据实验设计选择所用加药孔数量。 7.\ 8.设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。 9.上机：开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate 一起放置到仪器托板上。 10.仪器自动校准探针。 11.换细胞板：当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。
12.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞 状态。 13.数据分析：采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。
细胞株管理规定 一、什么是细胞株？ 原代代培养物经第一次传代培养后的细胞，常被称为细胞系（cell line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系有一定差异的细胞系，常被称为该细胞系的亚系（subline）。 从一个经过鉴定的细胞系采用选择法或单细胞克隆进一步所得到的细胞群，常被称细胞株（cell strain）。由原细胞株进一步分离培养出的与原株性状不同的细胞群，又被称为亚株（substrain）。 二、细胞株管理规定 对已建立和经过鉴定的细胞株要进行严格管理，规定如下： 1.制度管理规定 A.细胞株应有专人负责保管，并由实验室负责人监督检查。更换保管人时应提 前做好工作交接，确保使用安全。 B.建立细胞株使用登记制度，记录细胞株的编号、名称、来源、冻存数量及日 期、取用数量及日期、剩余数量及保存方法。 C.细胞株长期保存应放置于液氮罐中，短时保存或过渡保存可置于-80℃冰箱 中。 D.保存的细胞株应定期复活、保种，即每半年对没有复苏过的细胞株进行维护， 复苏、培养和保存，并详细记录细胞株状态，如形态、生长速度、抗体分泌情况等。 E.细胞株不得外借，不得随便带出实验室。 F.细胞株的使用、保存、转移和销毁应符合相关部门的有关规定。 2．使用流程规定 A.如有新细胞株进入实验室，需告知实验室负责人并进行冻存保种； B.实验室人员需复苏细胞时，需提前向实验室负责人申请，经批准后方可复苏； C.设存取记录表，实验人员存取细胞时做好记录并把细胞复苏情况反馈至实验
室负责人，实验室负责人需监督实验人员做好细胞株使用记录情况； D.若复苏细胞人员复苏同一株细胞株两次均未成活，需通知负责人进行检查和 复苏，如贮存细胞确实出现问题，则及时清理。 三、细胞保存 A.冻存条件：90%FBS+10%DMSO，4℃冰箱预冷； B.冻存方法： 4 ℃（30-40min）→-20 ℃（1-2h）→-80 ℃（过夜/24 h以上，可短时保存 1-3个月）→液氮（永久保存； C.填写冻存记录表 四、细胞复苏 A.水浴锅37℃预热 B.从细胞冻存管理表中查找并记录所需细胞在液氮罐中的位置。 C.液氮罐中快速取出细胞，迅速放入水浴锅中融化，并持续晃动，避免因受热 不均产生冰晶，损伤细胞，融化时间为1～2min； D.将细胞悬液移至离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，混匀； E.1200rpm/min，离心5min F.弃去上清液，加入新的培养液重悬，移至细胞培养瓶中，显微镜下观察细胞 形态，37℃培养箱培养。 G.次日，更换培养液继续培养，待其铺满培养瓶面积80%及以上，可尽心传代。 四、液氮罐的使用 A.开启液氮罐时，戴好防冻棉手套，防止冻伤； B.提前确定细胞保存位置，避免提篮在外停留时间过长； C.填写复苏记录表，负责人做好整理保藏记录，禁止短期内使用同一株细胞的 多管细胞，复苏后使用细胞的同时需补充细胞株库存，写明细胞名称、冻存时间、冻存人等细节。 五、附件 1.细胞冻存记录表 以50L液氮罐所配的6个提篮，每个提篮6层抽屉柜，每个抽屉柜5*5个冻存管。
细胞实验的基本操作 【细胞培养】 一、细胞的复： 非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复。细胞复的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作如下： 1、实验前准备： 1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。 1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 2、取出冻存管及迅速解冻： 2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台。 3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟； 4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮； 5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。 6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养
基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。 二、细胞的传代： 培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。 1、贴壁细胞的传代 具体操作如下： 1.1、传代前准备： 1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅预热。 1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台 1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。 1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后能放入超净台。 1.1.7、从培养箱取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察 细胞，并做好记录。 1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。 1.2、胰蛋白酶消化：
精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。
4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题
体外培养细胞的种类和命名 体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。 （三）克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain） （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 （五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。 （六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
细胞结构和功能的实验研究方法 在高中生物学的教学中，通过切实可行的实验研究方法，深入认识细胞结构和功能，是十分必要的。这主要包括使用显微镜观察和分级离心等技术的运用。 一、细胞形态结构的观察——显微镜观察法 显微镜是中学生物实验教学中的最常用的仪器。熟练地使用高倍显 微镜观察不同细胞的结构和功能，是高中生物课程标准要求的重要的实 验操作技能。 1 显微镜的结构和使用原则 1.1 显微镜结构和功能的熟悉 目镜长度与放大倍数成“反比”，即目镜越长，放大倍数越小；目镜 越短，放大倍数越大。 物镜长度与放大倍数成“正比”，即镜头越长，放大倍数越大。 焦距调好后，镜头与盖玻片的距离越远，物镜越短，放大倍数越小；反之，放大倍数越大。 显微镜的放大倍数为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 显微镜下视野（是指在显微镜下一次所能观察到的被检玻片标本的范围）中所看到的物象为真实物象的倒立放大的虚象。 由于低倍物镜的通光量比高倍物镜的通光量大，所以低倍镜下的视野较明亮；而高倍物镜下，虽然放大倍数大，实际观察到的标本区域小，视野较暗 例1使用显微镜时，所选用的物镜倍数愈大，则下列哪一项叙述不正确？（C ） A．物镜前端愈接近玻片标本B．物镜前端的透镜片直径愈小 C．物镜的镜筒长度愈短D．物镜下视野的亮度愈小 1.2 显微镜的使用程序和原则： 1.2.1操作的基本程序：取镜——安放——对光——制片——观察 1.2.2把握好几个原则： ①用眼原则：左眼注视目镜，右眼睁开。这样，一可减轻左眼疲劳，二可方便绘图。 ②物镜选用原则：先低倍后高倍，由低倍到高倍。可用低倍物镜观察清楚的就勿需使用高倍物镜。 ③准焦螺旋使用原则：先粗后细，由粗到细。 1.2.3显微镜下视野出现异物几种情况的判断： 如移动装片异物不动，说明不在装片上；转动转换器，换上高倍镜，仍可观察到，说
实验室安全管理制度 一．目的：在规范临床实验室的安全管理。 二．适用范围：实验室和工作人员安全的一般要求，防火、用电、化学危险物品、微生物的安全要求，以保证实验室的安全运作，将事故控制在最低限度。 三．实验室安全管理程序 一．目的：在规范临床实验室的安全管理。 二．适用范围：实验室和工作人员安全的一般要求，防火、用电、化学危险物品、微生物的安全要求，以保证实验室的安全运作，将事故控制在最低限度。 三．工作程序： l工作人员和实验室安全的一般要求 1．1吸烟 实验室工作区内绝对禁止吸烟。点燃的香烟是易燃液体的潜在火种；香烟、雪茄或烟斗都是传染细菌和接触毒物的途径。 1．2食物、饮料及其它 实验工作区内不得有食物、饮料及存在“手接触可能的其它物质。实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。食物应放置在允许进食、喝水的休息区内。 1．3化妆品 实验工作区内禁止使用化妆品或进行化妆，并建议经常洗手的实验人员使用护手霜。 1．4眼睛和面部的防护 处理腐蚀性或毒性物质时，须使用安全镜其它保护眼睛和面部的防护用品。但允许面罩或工作人员在实验室的危险区内不要佩戴隐形眼镜，除非同时使用护目镜或面罩。使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的情况时，必须佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。 1．5服装和个人防护装备 除要求符合实验室工作需要的着装外，工作服应干净、整洁。所有人员在各一实验区内必须穿着遮盖前身的长袖隔离服或长袖长身的工作服。当工作中有危险物喷溅到身上的可能时，应使用一次性塑料围裙或防渗外罩。有时还需要佩戴其它防护装备如：手套、护目镜、披肩或面罩等。个人防护服装应定期更换以保持清洁，遇被危险物品严重污染，则应立即更换。盛放被污染的实验服和工作服，应用合适的、有标识并能防渗的包装。清洗时应用足够高的温度和足够长的时间以获得良好的去污效果。 不得在实验室内设值班床，严禁在实验室内住宿。 1．6鞋 在各工作区内，应穿舒适、防滑、软底并能保护整个脚面的鞋。在有可能发生液体溅溢的工作岗位，可加套一次性防渗漏鞋套。帆布鞋可吸收化学物品和有传染性的液体。 1．7头发和饰物 留长发的工作人员应将头发盘在脑后，佩戴帽子。以防止头发接触到被污染物和避免人体脱屑落人工作区，不得佩戴有可能被卷入机器或可随人传染性物质的饰物。 1．8胡须 蓄有胡须的男性工作人员必须遵守上项(1.7)规定。 1．9洗手 实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者前后、以及在进食或吸烟前都应该洗手。接触血液、体液或其它污染物时，应立即洗手。 1．10眼睛冲洗
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数