病毒感染细胞实验整体流程及原理
目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒
慢病毒
原理
慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
特点
1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
慢病毒包装简要流程：
1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
、腺病毒
原理
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
特点
1）几乎可以感染所有类型的细胞
2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒
3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.
5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
腺病毒包装简要流程
1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体
2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
、慢病毒和腺病毒的比较
2、构建目的基因到载体
构建手段
一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定
2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定
质粒载体
概念
能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子
特征
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化
连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
大肠杆菌感受态细胞的制备
1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）取菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h
3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min
4）4℃离心10min（4000r/min）
5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6）用冰浴的L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
7）4℃离心10min（4000r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
9）分装细胞，200ul一份，4℃保存
质粒DNA的转化
1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
2）离心管放到42℃保温90s
3）冰浴2min
4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）
5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min
6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落
质粒提取步骤
1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清
2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。
3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
5）12000室温离心10min，收集上清。
6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
7）12000转离心1min，弃滤液。
8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。
10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为），室温放置2min。
12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。
质粒提取步骤：吸取液体培养基于离心管中12000转离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充分的上下翻转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min——取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍——将制备管置回2ml离心管12000转离心1min——将制备管移入新的离心管中，加60~80ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min——移去制备管，将有质粒的离心管于4℃或是-20℃保存
4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）
名词解释
细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
共转染的操作步骤
第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：
1. 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+ psPAX2+
2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体2000
3. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min
4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
5. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。
第三天：
1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
第四天：
1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。
rpm 离心20min，滤膜过滤，去除细胞沉淀。
转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
病毒包装的原理
质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。
在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
5、慢病毒感染细胞
流程图
感染步骤
1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜
2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
荧光显微镜的操作流程
打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，
观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica）
注意事项内容
1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。
2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。
3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。
4.在加病毒后一般24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。
6、感染后的细胞检测方法
荧光初步检测
若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。
的提取及RT-PCR检测
原理
因为真核细胞DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA，，是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条途径来测定
提取步骤
加1mlTrizol，吹打后移至无菌的离心管中；加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀，12000转15min，可看到明显分层；取上层透明液体至新的离心管中，加等体积的异丙醇，混匀静置10min，12000转离心10min，弃上清，加1ml70%乙醇，12000转，离心10min，弃上清，风干剩余液体，最后加DEPC-水溶解RNA，电泳，粗步判定RNA纯度。
步骤：
RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA。
PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA。（具体步骤省略）
蛋白提取及Western检测
western-Bloting：蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处 理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化 （注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结
果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。
病毒感染的实验诊断 病毒感染的实验诊断（一） ●考点 病毒的生物学性状 病毒的实验室检查方法 常见病毒的感染 [讲义编号NODE70103300270100000101：针对本讲义提问] 【内容讲解】 第一节概述 一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。 仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。 病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。 在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。 [讲义编号NODE70103300270100000102：针对本讲义提问] 一、病毒的基本性状 （一）形态结构 1.大小和形状： 大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。 形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。 [讲义编号NODE70103300270100000103：针对本讲义提问] 2.结构 [讲义编号NODE70103300270100000104：针对本讲义提问] （二）病毒的增殖 病毒必须依赖宿主细胞，
以特殊的自我复制方式进行增殖。 病毒的复制周期： 吸附、穿入、脱壳、生物合成、 组装与成熟、释放6个阶段。 [讲义编号NODE70103300270100000105：针对本讲义提问] 异常增殖： 顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。 缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。 干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种 [讲义编号NODE70103300270100000106：针对本讲义提问] （三）噬菌体 以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。 噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。 噬菌体感染细菌后产生两种后果： 溶菌周期和溶源性周期。
protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析
以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
1.收集细胞； ～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
ATCC? Number: CRL-2865? Price: $329.00 Designations: T47D-KBluc Depositors: VS Wilson Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: adherent Organism: Hom o sapi ens (human) Morpholog y: epithelial Source: Organ: mammar y gland; breas t Tissue: duct Disease: ductal carcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Cell T y p e: epithelialtransfected with reporter plas mid Permits/F orms: In addition to the MTA menti oned above, other ATCC and/or regulatory per mits may be required for the transfer of this ATCC material. Any one purchasing ATCC material is ultimatel y r esponsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the s pecific requirements for shipment to your loc ation. Reverse Transcript: N Age: 54 years adult HeLa Mar kers: N
细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 1 “细胞增殖”相关知识的建构（2 课时）一、减数分裂与基因的分离、自由 组合定律请画出能体现基因自由组合现象的细胞分裂图像 例1、（08 江苏）某种昆虫长翅（A）对残翅（a）为显性，直翅（B）对弯翅（b）为显性，有刺刚毛（D）对无刺刚毛（d）为显性，控制这3 对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体基因型如下图所示，请回答下列问题。（1）长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传是否遵 循基因自由组合定律，并说明理由。。（2）该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞的基因型为____________。（3）该昆虫细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有。（4）该昆虫细胞分裂中复制形成的两个D 基因发生分离的时期 有______ 。（5）为验证基因自由组合定律，可用来与该昆虫进行交配的异性个体的基因型分别是 _______________________________________________ ____________________________ 。二、细胞分裂与可遗传变异请画出可遗传变异种类的概念图苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 2 1、基因重组（非同源染色体的自由组合、交叉互换）例2、（07 广东）在减数分裂中每对同源染色体配对形成四分体，四分体中的非姐妹染色单体 之间经常发生交换。实验表明，交换也可以发生在某些生物体的有丝分裂中，这种现
象称为有丝分裂交换。图39—1 是某高等动物一个表皮细胞发生有丝分裂交换的示意图，其中D 和d，E 和e，F 和 f 表示某对同源染色体上的三对等位基因。图39—1 交换 过程示意图（左：交换前的染色体；右：交换后的染色体）（1）请问该细胞在发生有丝分裂交换后，产生几种基因型 的子代表皮细胞？并分别写出基因型 _______________________________________________ __________________。（2）如果不考虑该生物产生配子时发生的交换，那么该生物产生的配子有几种基因型？并 写出基因型 _______________________________________________ _____________。（3）如果图39—1 是该生物的精原细胞在产生精细胞时发生减数分裂交换后的结果，请问由它产 生的配子类型有几种？并写出基因型 ______________________________。（4）如果细胞在减数分裂和有丝分裂中都发生交换，你认为哪一种分裂方式对于遗传多样性的贡献更大？为什么？ _______________________________________________。 2、染色体变异（染色体结构变异、染色体数目变异）例 3、（10 苏州高二期末）右下图表示某生物体的细胞进行减数 分裂过程中，其中联会的两对染色体之间出现异常的
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
细胞株管理规定 一、什么是细胞株？ 原代代培养物经第一次传代培养后的细胞，常被称为细胞系（cell line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系有一定差异的细胞系，常被称为该细胞系的亚系（subline）。 从一个经过鉴定的细胞系采用选择法或单细胞克隆进一步所得到的细胞群，常被称细胞株（cell strain）。由原细胞株进一步分离培养出的与原株性状不同的细胞群，又被称为亚株（substrain）。 二、细胞株管理规定 对已建立和经过鉴定的细胞株要进行严格管理，规定如下： 1.制度管理规定 A.细胞株应有专人负责保管，并由实验室负责人监督检查。更换保管人时应提 前做好工作交接，确保使用安全。 B.建立细胞株使用登记制度，记录细胞株的编号、名称、来源、冻存数量及日 期、取用数量及日期、剩余数量及保存方法。 C.细胞株长期保存应放置于液氮罐中，短时保存或过渡保存可置于-80℃冰箱 中。 D.保存的细胞株应定期复活、保种，即每半年对没有复苏过的细胞株进行维护， 复苏、培养和保存，并详细记录细胞株状态，如形态、生长速度、抗体分泌情况等。 E.细胞株不得外借，不得随便带出实验室。 F.细胞株的使用、保存、转移和销毁应符合相关部门的有关规定。 2．使用流程规定 A.如有新细胞株进入实验室，需告知实验室负责人并进行冻存保种； B.实验室人员需复苏细胞时，需提前向实验室负责人申请，经批准后方可复苏； C.设存取记录表，实验人员存取细胞时做好记录并把细胞复苏情况反馈至实验
室负责人，实验室负责人需监督实验人员做好细胞株使用记录情况； D.若复苏细胞人员复苏同一株细胞株两次均未成活，需通知负责人进行检查和 复苏，如贮存细胞确实出现问题，则及时清理。 三、细胞保存 A.冻存条件：90%FBS+10%DMSO，4℃冰箱预冷； B.冻存方法： 4 ℃（30-40min）→-20 ℃（1-2h）→-80 ℃（过夜/24 h以上，可短时保存 1-3个月）→液氮（永久保存； C.填写冻存记录表 四、细胞复苏 A.水浴锅37℃预热 B.从细胞冻存管理表中查找并记录所需细胞在液氮罐中的位置。 C.液氮罐中快速取出细胞，迅速放入水浴锅中融化，并持续晃动，避免因受热 不均产生冰晶，损伤细胞，融化时间为1～2min； D.将细胞悬液移至离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，混匀； E.1200rpm/min，离心5min F.弃去上清液，加入新的培养液重悬，移至细胞培养瓶中，显微镜下观察细胞 形态，37℃培养箱培养。 G.次日，更换培养液继续培养，待其铺满培养瓶面积80%及以上，可尽心传代。 四、液氮罐的使用 A.开启液氮罐时，戴好防冻棉手套，防止冻伤； B.提前确定细胞保存位置，避免提篮在外停留时间过长； C.填写复苏记录表，负责人做好整理保藏记录，禁止短期内使用同一株细胞的 多管细胞，复苏后使用细胞的同时需补充细胞株库存，写明细胞名称、冻存时间、冻存人等细节。 五、附件 1.细胞冻存记录表 以50L液氮罐所配的6个提篮，每个提篮6层抽屉柜，每个抽屉柜5*5个冻存管。
流式细胞技术检测细胞周期分布 1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀； 2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。重复此步骤2次，以除去胰酶； 3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜； 4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇； 5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。 6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。 2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平 1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常 2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内； 3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育15min； 4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育； 空白：Annexin V—FITC结合液200ul 双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI 单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC 190ul结合液+10PI 5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。