组织病理切片的制作流程
1．取材
组织取材的方法是制作切片的一个重要程序, 根据教学、科研及外检的具体要求取自人体( 外科手术切除标本、活检标本、尸检标本) 或动物, 并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识, 还要掌握实际操作技术, 每个组织器官的取材都有一定的部位和方法, 不能任意切取组织作为制片材料, 不然, 无法达到教学、科研和临床诊断的目的, 具体要求如下:
(1)材料新鲜: 取材组织愈新鲜愈好, 人体组织一般在离体后, 动物组织在处死后迅速固定, 以保证原有的形态学结构。
(2)组织块的大小: 所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm, 以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部, 但根据制片材料和目的不同, 组织块的较理想体积也不同, 如制作病理外检、科研切片, 其组织块能够薄取0.1～0.2cm即可, 这样能够缩短固定脱水透明的时间, 若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm, 这样能够同一蜡块制作出较多的教学切片。
(3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利, 切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧, 以免因挤压而使组织、细胞变形。
(4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材, 病理标本取材按照各病变部位、性质的不同, 根据要求规范化取材。
(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构, 决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键, 如长管状器官以横切为好。
(6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等, 可用水冲洗干净后再放入固定液中。
(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后, 或多或少会产生收缩现象, 有时甚至完全变形。为此可将组织展平, 以尽可能维持原形。
2．固定
(1)小块组织固定法: 这是最常见的方法, 从人体或动物体取下的小块组织, 须立
即置入液态固定剂中进行固定, 一般, 标本与固定液的比例为1:4～20, 但组织块不宜过大过厚, 否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。
(2)注射、灌注固定法: 某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部, 或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管, 经血管分支到达整个组织和全身, 从而得到充分的固定。
(3)蒸汽固定法: 比较小而厚的标本, 可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片, 则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。
最常见的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。
3．脱水透明标本经过固定和冲洗后, 组织中含有较多的水分, 必须将组织块内的水分置换出来, 这一过程叫做脱水。无论是用石蜡切片, 还是用火棉胶切片, 都必须除去组织中所含水分, 因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容, 常见的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。
脱水的步骤是: 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度乙醇2小时, 此过程可用脱水机自控完成。
丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂, 但因其脱水能力很强, 对组织有剧烈收缩作用, 在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。因乙醇、丙酮等不溶于石蜡, 还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常见的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、水杨酸甲酯等。
4．浸蜡、包埋
(1)使石蜡浸入组织中, 取代组织中含有的透明剂。
(2)包埋: 将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中, 石蜡凝固后, 组织即被包在其中, 称蜡块, 此过程称为包埋。
5．切片和贴片
(1)修整蜡块: 可视其组织的大小, 在组织边缘约0.1～0.2cm处, 切去余蜡部分, 否则易造成组织皱缩不平。
(2)准备好切片用具: 切片刀、毛笔、眼科镊子( 弯) 、漂烘温控仪
(3)安装蜡块: 将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上。
(4)安装切片刀: 将切片刀安装在切片机的刀台上, 把刀台上的紧固螺丝旋紧, 使切片时不产生振动, 能保持一定的切片厚度。
(5)切片的厚度: 切片机的厚度调节器上刻有0～50μm或0～25μm, 可任意选择其厚度, 石蜡切片的厚度一般在4～6μm。
(6)切片
(7)铺片: 用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40～45℃的水面上, 借水的张力和水的温度, 将略皱的蜡带自然展平。
(8)贴片、烘片: 待切片在恒温水面上充分展平后, 将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水, 置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15～30分钟, 脱去溶化组织间隙的石蜡。
6．染色和封片常见的染色方法是苏木素-伊红( Hematoxylin-Eosin) 染色法, 简称H.E染色法。这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。苏木素是一种碱性染料,可使组织中的嗜碱性物质染成蓝色, 如细胞核中的染色质等; 伊红是一种酸性染料, 可使组织中的嗜酸性物质染成红色, 如多数细胞的胞质、核仁等在H.E染色的切片中均呈红色。
H.E染色程序如下:脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固
常规苏木素染色中的对比染色是用伊红,近年来在英、美国家的一些实验室则采用焰红( phloxine) ,另外也有用桔黄G( OrangeG) 、比布里希猩红(Biebrich scarlet)、波尔多红(Bordeaux red)等作为对比染色。伊红为染胞质、胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒等常见的染料。
1 . 取材
取材的好坏, 直接影响切片的质量。医生在取材时, 首先要有一把锋利的取材刀, 在切割组织时要避免取材刀来回拖拉, 切取的组织块厚薄要均匀, 一般厚度以0.2 ～0.3cm为适, 较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点, 而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些; 淋巴结应修掉两侧球冠, 并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中
还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织, 如碰到不可避免的钙化组织, 应与技术室
讲明, 在切取纤维组织、肌肉、组织、胃肠道时, 应注意纤维及肌肉的走向, 取材
时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。
2 . 固定
固定是技术室工作的第一步, 也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓”固定”, 就是组织离体后, 用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和
位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败, 防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用, 使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质, 以保持原有的结构与生活时相仿。另外, 组织固定后, 均呈一定的硬化状态, 增加组织韧性, 而且不易变形, 有利于以后的组织处理。因此组织一旦离体必须及时固定, 固定液的量应为组织的5倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常见的固定液为10％福尔马林。笔者认为, 10％福尔马林由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响, 浓度被
降低致组织固定不足, 而高浓度的福尔马林, 降低了对组织的穿透性, 形成周围固定
好而中央固定不到的现象。经过实践, 本人认为以酸性12～15％的福尔马林最佳。大标本( 2cm厚) 一般需要6～12个小时, 小标本一般需要3～6个小时; 当室温低18℃时, 可在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5～4.5, 中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。因此, 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用, 但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的保
存作用, 因此在没有特别处理的情况下常规HE用12～15％酸性福尔马林也能够( 每
100毫升12～15％福尔马林液内加5毫升冰醋酸) 。骨髓、结缔组织固定以Bouin液
为佳, 经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液; 少数单位还可建立组织冷冻库, 以便适应各种特殊
的处理要求。
3. 水洗
固定后水洗( 10～20分钟) , 一般被很多人所忽视, 而水洗不彻底, 容易造成脱片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织, 更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内
抗原的保存
4 . 脱水和透明
所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来, 以利于有机溶剂的渗入, 这一过程称为脱水。脱水是否彻底, 直接关系到组织是否能充分透明, 而脱水过度( 原因是组织在纯酒精内时间过久, 发生组织质地发生变化) 容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温( 温度超过35℃) 、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关, 而忽视了与低浓度的酒精关系, 其实低浓度的酒精具有强大的穿透力, 比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水, 组织如果在低浓度酒精里充分脱水, 在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份, 因此, 仅需短时间就可完成, 如果这时不缩短纯酒精的时间, 便会引起组织发脆; 如果脱水时加温, 使用丙酮, 还可引起组织收缩, 并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内, 必须经过一种既能与脱水剂混合, 又能与石蜡相溶的媒介物质, 这个过程称透明。当前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆, 这个观点很片面, 在常温下, 如果不是时间过长( 超过２4小时以上) 二甲苯并不会引起组织过份发脆, 相反会使某些组织结构比较质韧的组织: 比如子宫肌瘤等相当好切) , 可是当二甲苯温度超过35℃以后, 极易引起组织发脆。因此本人认为, 大小标本最好分开脱水, 一般情况下, 大标本脱水时间( 室温18℃) 以80％酒精2小时、95％酒精( 2道) 各1个半小时至2小时、纯酒精( 3道) 各1个半小时至2小时, 二甲苯( 2道) 各30-60分钟为宜; 小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短, 与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现, 室温在12～15℃时, 可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时, 组织容易脱水, 可适当缩短脱水时间; 而室温低于该温度范围时, 应适当延长脱水时间( 如能保证在一个恒定的温度下最佳) 。更换试剂, 应以量为基础, 定量更换, 不能等到切片不好时再去更换。否则, 至少会有2～3批组织切片不好。根据我科经验, 如试剂用量为500ml, 每500个蜡块更换一次为宜。
5. 浸蜡
组织透明后, 在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其它浸透剂( 如火棉胶、明胶等) 渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高( 超过60℃) , 在蜡内加
入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多, 都会导致组织发硬, 还会使组织内的抗
原受到破坏; 因此作者主张浸蜡用的石蜡熔点在56℃( 三道) , 第一道: 石蜡30分钟; 第二道: 石蜡90分钟; 第三道: 石蜡, 90分钟。浸蜡温度控制在56～58℃左右。( 第一道也可用硬脂酸石蜡1: 3混合浸蜡, 不但可软化组织, 特别适用于比较韧、硬的组织, 而且由于硬脂酸是弱酸性的, 对细胞核有媒染作用, 核浆比鲜明, 但容易脱片;
同时对疏松组织容易散片) 。有条件的能够每天打开第一道石蜡的盖子, 让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤, 以防附在组织上, 造成切片刀刀口受损, 或切片破碎和划痕增多。
6. 包埋
用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常见的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整, 二是方位。要求在包埋时, 应采用镊子轻压组织块拱起部份, 使之平贴于底部, 一般采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织, 应尽量放在一起, 并保证在一个平面上。修去两边的余蜡( 所谓的两边, 指切片时与切片刀垂直的两
侧) 。包埋时还应注意有无缝线, 纸絮, 如有一定要去除。胃黏膜活检标本, 不能按一般的规律取最大包埋面, 应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤, 留有杂质的石蜡, 容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56～58℃之间选择, 不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块, 到了夏天, 会粘在一起, 不利于资料的保存, 而且即使在冬天, 用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
7. 磨刀
要想切好一张切片, 首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术, 刀磨的好坏, 直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同, 但都要求用力均匀, 使刀口和磨刀石全面接触, 两手的用力点应在刀口上, 而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次, 每次仅需10～15分钟, 过长时间的磨刀, 容易把已经磨出的锋刃磨掉, 检查切片刀是否锋利, 用手试摸刀口的方法并不十分科学, 不但不能证明切片
刀是否真正锋利, 而且容易损害刀口, 最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后, 应将磨刀石用盖子盖好, 以防灰尘掉在磨刀石上, 用有灰的磨刀石磨刀, 会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机, 磨刀机用来开刀
锋和磨缺口的确不错, 但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握, 故效果并不理想。根据我们的经验, 真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片, 必须及时更换刀口。一个刀口切小标本不应超过20～25只蜡块, 切大标本不应超过10～15只蜡块。
8. 切片
切片的第一步必须粗切。粗切的厚度大约在５0～100微米左右, 质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些, 粗切致组织全部暴露后, 才进行细切。细切至组织块表面均匀一致, 无白点后, 再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和, 摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均, 机器磨损; 过慢会使切片增厚。切片厚度一般为3～5微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致, 切片的不完整, 常会将重要病变遗漏, 导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时, 应注意组织包埋的方向, 组织的层次, 纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行, 较难切的部分应放在上面, 如皮肤的表皮, 肿块的包膜, 胃肠道的浆膜等, 这样能够减少组织的
断裂现象。操作切片机时应用力均匀, 避免用力过重。对脱钙组织、骨髓, 以及已知的钙化组织, 应选用固定的刀口, 以减少其它部位出现缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口, 因为每切到一根笔丝, 就会增加一个缺口。切片厚度一般为4～6微米, 有人认为: 只要切片机刻度标着几个微米, 切出来的片子就是几个微米。其实不然, 当切片刀不锋利, 或切片时速度不匀, 或切的较慢时, 切的片子都会变厚,
只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下, 才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法: (1)组织发脆: 一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高, 并与组织本身质地也有关, 在切片时, 边切边用嘴向蜡片吹气, 可能会好些。(2)切片卷起, 可能是刀不锋利, 或刀锋在另一面, 或刀角度过大, 切片太厚等等。(3)蜡片弯曲: 可能是刀锋不均, 切片刀未磨直, 切片刀与蜡块不平行。(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高, 并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均: 可能是刀、刀座及蜡块未夹紧, 组织太硬, 或切片机主轴太向前, 或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕: 可能是刀有缺口, 石蜡内有杂质, 组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不连片, 切不下片, 切片很厚, 或者切片后蜡块发白, 内陷: 组织
脱水不佳。补救办法: 可先将蜡块溶解, 取出组织, 放入加热水浴的丙酮内( 80℃) , 30～60分钟, 再进行透明浸蜡包埋切片, 可能会好一点。
9. 展片与捞片
展片水温应在42℃至47℃之间, 这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高, 会引起组织细胞散开, 水温过低, 切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯, 也会造成石蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子, 一碰到热水, 片子上的皱摺就无法再展开, 这有二个方法能够解决: 第一、能够在切片时边切边向蜡片吹气, 这样的片子就会非常平整, 放到热水里就会自然展开, 比较方便快捷, 但这样的片子会略微厚一点; 第二、在切完片子后, 先把切片放在30%酒精水溶液中, 让酒精的张力自动把皱摺展开, 然后再将切片移到热水, 这样的片子会较薄;如酒精浓度过高, 容易引起切片破碎, 出现裂隙, 像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开, 故不能用此法。最后捞片时玻片要干净, 要选择那些完整、无皱摺的切片, 粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
10. 烤片和脱蜡
烤片, 一般在60℃的温箱内烤片0.5～1小时左右, 温度过高, 会引起切片细胞收缩; 时间太短(少于20分钟), 容易造成脱片。脱蜡也相当重要, 如果脱蜡不干净, 切片不易着色或着色不匀, 因此, 脱蜡用的二甲苯要经常更换, 一般用3道二甲苯, 每500ml液体, 处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时, 必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡, 或将二甲苯放入温箱内预热( 37℃左右) 脱蜡, 最高不得超过60℃。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯, 至水。
11. 染色
苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定, 一般为5－15分钟。经水略洗后, 用盐酸酒精分化, 分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后, 可用温水或自来水蓝化, 并充分水洗( 流水冲洗5分钟以上) , 以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液( 释氨水、肥皂水等) 促蓝, 尽管蓝化效果很好, 但从实践的结果来看, 用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存, 容易褪色。最后入伊红复染( 5－20秒) 。HE染色的关键在于深浅适度, 对比鲜明, 一般有经验的, 肉眼就能判断, 但偶而也会出现失误, 因此用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的
组织病理学技术 组织病理学技术 一. 实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二. 实验目的 1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变 3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二.实验材料 1. 实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2. 实验试剂：福尔马林、酒精（50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四.实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1. 取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区域和可疑 灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。
病理组织切片的制作过程 1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 (2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm 即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。 (7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 2．固定 (1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 (3)蒸汽固定法：比较小而厚的标本，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。 最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。
组织病理切片以及HE染色 （一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining ，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可 用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。 （二）实验步骤： 一、制作切片 1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。 2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋 组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。组织染色后也要进行透明。最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。 组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。用其他浸
透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程 称为浸透或透入。为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52- 56Co 组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。用于包埋的石蜡熔点一般为60C左右。但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。 3、切片、制片 石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片 机，以前者为多用。切片厚度一般为3-5卩m切片时先将组 织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30%的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40C恒温热水器中。也可直接将组织切片移入40C的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60C烤片30-60min后即可进行染色。 二、HE染色 1. 二甲苯脱蜡2X 10 min ;
病理组织切片的制作 卢文丽吴中华方肇勤 （2007/01/04） 一、器材（按一小组，约4-6人） 眼科镊：直无勾10cm 、弯无勾10cm各5把； 组织镊；12.5cm 2把； 眼科剪：直尖10cm 4把； 解剖剪：cr/14，4把； 普通双面刀片：10片/盒×1盒； 染色架：5个； 染色缸：1000ml，14-15个； 切片盒：50片/盒×3盒或100片/盒×2盒； 37度、60度恒温箱：各1个； 磨砂载玻片：50片/盒×3盒； 盖玻片：100片/盒×2盒； 广口瓶：30ml或60ml×20个； 滴管及配套吸头：4个； 玻璃漏斗：φ90 3个；玻璃搅棒：2支 普通粗孔大张滤纸：20张； φ90mm玻璃培养皿：4个； 中号普通毛笔：2支； 烧杯：500ml 、1000ml 各1个； 量筒：100ml、500 ml、1000 ml各1个； 组织切片机及配套刀片：4台； 摊片用水浴锅：2台； 生物切片石蜡：5盒，熔点：56-58℃； 电子天平：1台； 酒精灯：150ml，4台； 脱水篮：1-2个； 打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸、乳胶手套、口罩、医用纱布足量。 二．试剂 苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶×1瓶； 37%~40%福尔马林液：500ml/瓶×1瓶； 冰醋酸：AR，500ml/瓶×1瓶； 无水乙醇：AR，500ml/瓶×10瓶； 二甲苯：AR，500ml/瓶×10瓶； hematoxylin苏木色素（苏木精）：10g/瓶×1瓶； 酸性品红（曙红丫水溶）：25g/瓶×1瓶； 碘酸钠：AR，500g/瓶×1瓶；柠檬酸：AR，500g/瓶×1瓶; 水合氯醛：AR，250g/瓶×1瓶;铵矾（ALNH4(SO4)2·12H2O）或钾矾（ALK(SO4)2·12H2O）：500g/瓶×1瓶 蛋白甘油（甘油/鸡蛋清=1/1）：50ml 中性树胶：100g/瓶×2瓶。若中性树胶过于粘稠，可与二甲苯按7/3的比例稀释。 蒸馏水：5000ml
病理科常规切片（HE切片）质量PDCA管理循环案例示范病理切片质量的好坏关系到病理诊断质量和水平的高低，正确的病理诊断往往取决于准确的显微镜下观察，因此病理切片质量的好坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。一张好的病理切片与标本的固定、取材、脱水、包埋、切片、染色等环节有密切的关系。过去，我科一直严抓病理切片质量，每月都随机抽查30例常规切片进行质量评价，总体来说切片质量较高，基本达到诊断的要求。但是每月的切片质量检查或多或少总发现存在一些缺陷，如切片刀痕、裂隙、气泡、胶液外溢等。 目的：通过检查常规切片质量，发现存在影响切片质量的问题，查找原因，提高切片质量。 数据收集：参照《临床技术操作规范病理学分册》中的常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准（见表1），对今年1-7月常规病理切片进行质量分级评定（每月随机抽查30例常规切片，见表2），总的优级率87.1%，优良率97.6%，总体达标。 表1 常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准 优质标准满分（分）质量缺陷减分 组织切面完整，内镜咬检、穿刺标本切面数10 组织稍不完整：减1～3分；不完整： 减4～10分；未达到规定面数：减5 分 切片薄(3～5μm)，厚薄均匀10 切片厚(细胞重叠)，影响诊断：减6～ 10分；厚薄不均匀：减3～5分
切片无刀痕、裂隙、颤痕10 有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断： 减2分；有刀痕、裂隙、颤痕，影响 诊断：减5分 切片平坦，无皱褶、折叠10 有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2 分；有皱褶折或折叠，影响诊断：各减 5分 切片无污染10 有污染：减10分 无气泡（切片与载玻片间 /盖片与切片、载玻片间）， 盖片周围无胶液外溢 10 有气泡：减3分；胶液外溢：减3分 透明度好10 透明度差：减1～3分；组织结构模糊： 减5～7分 细胞核与细胞浆染色对比清晰10 细胞核着色灰淡或过蓝：减5分红(细 胞浆)与蓝(细胞核)对比不清晰：减5 分 切片无松散，裱贴位置适当10 切片松散：减5分；切片裱贴位置不 当：减5分 切片整洁，标签端正粘牢，编号清晰10 切片不整洁：减3分；标签粘贴不牢： 减3分；编号不清晰：减4分 合计100 注：切片质量分级标准：①甲级片：≥90分（优）；②乙级片：75～89分（良）；③丙级片：60～74分（基本合格）；④丁级片：≤59分（不合格）
HE染色标准化操作程序 一、目的 保证病理切片质量，以达到准确的病理诊断。 二、范围 石蜡包埋组织 三、试剂，仪器 酒精、二甲苯、苏木素、伊红、盐酸酒精、脱水机、包埋机、切片机、漂烘仪、染色机。 四、工作流程 （一）制片前 制片前过程从标本送到实验室至包埋结束为止。包括： 1.标本的交接编号记录及检查 （1）实验室人员收检标本时人必须认真执行查对制度，包括：送检标本种类和数量与送检单上填写的是否一致；容器上的联号或姓名与送检单上是否符合；固定液的种类（通常要求为10％中性缓冲甲醛液）和量是否符合要求；送检单是否按规定用墨水笔逐项填写清楚。若发现有错误、疑问或不符合要求时，应立即查询清楚和适当处理，在合格后方可签名接收。如标本已干涸、腐败或其它明显不符则不应接收。接收标本应在初级人员接收后，再由中级人员和主检或具体负责人员复核，以确保没有差错发生。 （2）收到标本后应按标本顺序逐一在申请单上编上病理检查号，并在标本容器外壁贴上相应的号码，然后按号码先后顺序排列放好，再在申请单上打上收到日期。将收检的标本，按申请单逐一向负责处理的医师交代清楚，包括标本种类、数量、临床诊断及有无特殊注意事项等。 （3）取检过程中，实验室人员应认真记录填写好工作单，包括标本号、块（包）数、有无特殊处理、标本名称，如标本全取、标本过小等均应记录在案以备日后查对。对一些易碎、小而少的标本应用尼龙丝小袋或擦镜纸包裹好后再做上机处理，以防丢失。标本的取材块通常控制在2cm×2cm×0.3cm左右。标本取检多于一个包埋块者，在标本病理检查号后缀写-1或-2等，以便于查找校对。取好的标本应及时浸泡在指定的固定液中，来不及取完的标本特别是大标本应缝上号码投入固定池内以备次日再取。标本取检完后，自报告发出之日起，通常规定小标本保留1月以上，大标本保留6月以上。 （4）标本在上机处理之前，必须由初级和中级实验技术人员共同检查标本总数与申请单和工作单是否一致，确定无疑后方可上机处理。 2.标本的处理 利用全自动脱水机处理。（根据组织的大小、分类分别设置程序） 所有试剂由专人负责定时检测定期更换，并做好详细记录。 3.标本的包埋 首先清点检查标本，确认完好无缺后方可开始包埋操作，操作时应注意核对标本与工作单记录是否吻合。包埋的石蜡温度应尽量与标本浸蜡温度一致，大约控制在65℃～70℃之间，温度太低会造成包埋平面凹凸不平，尤其是内镜活检等小块标本，易出现切片不完整而发生漏诊现象。
组织病理切片的制作过程 1．取材组织取材的法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 (2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。
(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 2．固定 (1)小块组织固定法：这是最常用的法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 (3)蒸汽固定法：比较小而厚的标本，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。 最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。 3．脱水透明标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块的水分置换出来，这一过程叫做脱水。无论是用蜡切片，还是用火棉胶切片，都必须除去组织中所含水分，因含水组织与蜡、火棉胶等包埋材料不相容，常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。 脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。 丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。因乙醇、丙酮等不溶于蜡，还要经过一个能溶于蜡的溶剂替代过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、水酸甲酯等。 4．浸蜡、包埋
实验四病理组织切片制作 一、实验目的 组织切片技术是病理学中不可缺少的一个组成部分。通过实验，能够使学生了解和掌握病理组织切片的基本方法之一，即石蜡包埋的组织切片法。 二、实验原理 根据病变及检查的要求，合理采集病料，经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后进行切片，在进行染色得到结果。固定是用化学药品把组织原来的结构保存下来，以便观察。脱水是除去组织中的水分，以利于透明和浸蜡。组织的透明是便于透蜡包埋。包埋的是使石蜡透入组织内部，把软组织变为适当硬度的包埋块，以便切成薄片。最后使用切片机，将包埋块中组织切成薄片。 三、主要仪器及试材 已固定好病料，石蜡，手术刀，手术剪，镊子，脱水框，染色缸，梯度脱水酒精和透明剂一套，烘箱，切片机，毛笔，玻片，蛋白甘油，染色架，酒精灯，三角架，大烧杯，温度计，火柴，切片刀，记号笔或铅笔。 四、实验方法与步骤。 （一）固定 采取的病理材料必须立即放入10％福尔马林固定液中。 （二）脱水 组织经固定后，尚含有多量水分，而水与透明剂苯、石蜡根本不相融合。必须先把组织中的水分除去。但脱水剂必须是与水在任何比率下均能混合的液体，脱水剂常兼有硬化组织的作用。最常用的脱水剂为酒精、丙酮等。 1．酒精沸点78．4℃，为最常用的脱水剂。脱水能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相混合。最终结果表明，只要脱水环节处理好，都会得到好的切片。脱水的程序为70％一80％一95％一100％。各级酒精2—4小时，视材料的大小、厚薄而定。100％酒精有硬化组织的作用，时间不宜太长，一般不超过3小时。脑组织、脂肪组织或疏松结缔组织，脱水时间要适当延长。 2．丙酮沸点为56℃。脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大，主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间l一3小时左右。 （三）透明 透明对组织有脱酒精及透明两种作用。当组织中全部为透明剂占有时， 光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明，具有这种作用的试剂称为透明剂。常用的透明剂有： 1．二甲苯是最常用的良好透明剂，不影响各种染色。二甲苯易溶于酒精，能溶解石蜡，也是封固剂，不吸收水，透明能力强，易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，特别对小动物组织材料必须严格控制好(各种器官的透明差异很大)，通常为半小时到1小时左右。 当二甲苯透明时必须持组织放在专用二甲苯皿器中，这样可减少透明时间，有利于组织透明彻底，在换组织块透明时候，所用的镊子等器具必须干燥，不得将水滴混入二甲苯中，因水滴易被组织吸收而影响透明程度，潮湿天气更应引起注意。2．冬青油（水杨酸甲酯）为无色油样液体，易溶于醇、醚及冰醋酸，难溶于水。透明速度较慢，数小时或数天。一般经无水乙醇脱水后再入冬青油。 （四）浸蜡（透蜡） 组织经脱水透明后要用石蜡等支持剂透入内部，并除去组织中的透明剂，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成切片。
1.肝细胞水肿（肝细胞浆混浊肿胀，有小空泡） 2.肝细胞脂肪变（胞核被挤向一侧） 3.肾梗死（形状在，核不在） (与正常的对比观察)
4.肉芽组织（毛细血管，成纤维细胞，炎症细胞） 5.脾动脉玻璃样变（蛋白质蓄积，正常动脉壁结构消失） 6.肺淤血水肿（肺泡腔内有水肿液，红细胞及心衰细胞） （急性和慢性比较）
7.慢性肝淤血（肝窦扩大，淤血，出血。小叶中央静脉淤血，出血。肝细胞有脂肪变性。汇管区肝细胞较正常） 8.混合血栓（血小板小梁，大量的红细胞，纤维蛋白网） 9.绒毛心（纤维素性心外膜炎。心包膜外大量红染的纤维蛋白及炎细胞浸润） 10.肝脓肿（肝细胞变性坏死，液化可见脓细胞即变性坏死的中性粒细胞）
11.蜂窝织炎性阑尾炎（大量中性粒细胞浸润在阑尾肌层） 12.肉芽肿（虫卵及异物巨细胞） 13.纤维瘤（良性，外观呈结节状，与周围组织分界清楚，有包膜，切面灰白色，质地硬。瘤组织内的胶原纤维成编织状） 14.纤维肉瘤（肿瘤细胞异型性明显，梭形或不规则型，细胞大小不一，核大，色深，可见瘤巨细胞及异常核分裂像。细胞排列紊乱，胶原纤维少，血管丰富）
15.皮肤乳头状瘤（瘤组织表面为分化成熟的高度增生的鳞状细胞构成，呈乳头状突起乳头中心是中心索（纤维组织，血管，少数炎症细胞） 16.乳房纤维腺瘤：圆形或椭圆形，边界清楚，表面光滑，有包膜。由增生的腺导管及纤维组织构成 17.鳞癌：癌细胞巢状排列，有粉红色的角蛋白，角化珠 （高分化与低分化鳞癌比较）
18.腺癌（腺体的正常结构消失，癌细胞大小不等、形状不一、排列不规则，排列成多层。背靠背、共壁现象。） 19.风湿性心肌炎（风湿细胞又称为阿少夫细胞,横切面似枭眼状，纵切呈毛虫状，风湿小体） 20.原发性颗粒性固缩肾（纤维化肾小球，并有代偿性肥大的肾小球） 21.动脉粥样硬化（纤维帽（玻璃样变）胆固醇结晶（针状空隙）、细胞外脂质和坏死物质，肉芽组织、泡沫细胞）
病理科常规切片(H E 切片)质量P D C A管理循环案例示范
病理科常规切片（HE切片）质量PDCA管理循环案例示 范 病理切片质量的好坏关系到病理诊断质量和水平的高低，正确的病理诊断往往取决于准确的显微镜下观察，因此病理切片质量的好坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。一张好的病理切片与标本的固定、取材、脱水、包埋、切片、染色等环节有密切的关系。过去，我科一直严抓病理切片质量，每月都随机抽查30例常规切片进行质量评价，总体来说切片质量较高，基本达到诊断的要求。但是每月的切片质量检查或多或少总发现存在一些缺陷，如切片刀痕、裂隙、气泡、胶液外溢等。 目的：通过检查常规切片质量，发现存在影响切片质量的问题，查找原因，提高切片质量。 数据收集：参照《临床技术操作规范病理学分册》中的常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准（见表1），对今年1-7月常规病理切片进行质量分级评定（每月随机抽查30例常规切片，见表2），总的优级率87.1%，优良率97.6%，总体达标。 表1 常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准 优质标准满分 （分） 质量缺陷减分 组织切面完整，内镜咬检、穿刺标本切面数10 组织稍不完整：减1～3分；不完 整：减4～10分；未达到规定面数： 减5分 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
切片薄(3～5μm)，厚薄均匀10 切片厚(细胞重叠)，影响诊断：减 6～10分；厚薄不均匀：减3～5分 切片无刀痕、裂隙、颤痕10 有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊 断：减2分；有刀痕、裂隙、颤痕， 影响诊断：减5分 切片平坦，无皱褶、折叠10 有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减 2分；有皱褶折或折叠，影响诊断： 各减5分 切片无污染10 有污染：减10分 无气泡（切片与载玻片 间/盖片与切片、载玻片 间），盖片周围无胶液 外溢 10 有气泡：减3分；胶液外溢：减3分 透明度好10 透明度差：减1～3分；组织结构模 糊：减5～7分 细胞核与细胞浆染色对比清晰10 细胞核着色灰淡或过蓝：减5分红(细 胞浆)与蓝(细胞核)对比不清晰：减5 分 切片无松散，裱贴位置适当10 切片松散：减5分；切片裱贴位置不 当：减5分 切片整洁，标签端正粘牢，编号清晰10 切片不整洁：减3分；标签粘贴不 牢：减3分；编号不清晰：减4分 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢3
1.7.1 修整组织 将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透和组织脱水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块，以备后用。 1.7.2 组织洗涤 组织经修整后，组织中的福尔马林等必须冲洗干净，尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。 1.7.3 组织脱水 组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。 80%乙醇溶液：2h 95%乙醇溶液:1h 95%乙醇溶液:1h 100%乙醇溶液:30min 100%乙醇溶液:30min 1.7.4 组织透明 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 二甲苯Ⅰ：30min 二甲苯Ⅱ：10min 1.7.5 组织浸蜡 浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。 石蜡Ⅰ：1h
石蜡Ⅱ：1h。 石蜡Ⅲ：1h 1.7.6 组织包埋 将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，沿壁倒入包埋用的纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，新的石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。 1.7.7 组织切片 （1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快 （2）将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。 （3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 （4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 （5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 （6）调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。 （7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-60r/min。 （8）切成的蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。 （9）感觉效果较好的蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43℃的水浴锅中展片，观察切片是否良好。 （10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 1.7.8 贴片
组织病理切片的制作流程 1．取材 组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 (2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。 (7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 2．固定 (1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色 步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1. 75%乙醇50分钟 2. 85%乙醇50分钟 3. 95%乙醇(I) 30分钟 4. 95%乙醇(II) 30分钟 5. 100%乙醇(I) 30分钟 6. 100%乙醇(II) 30分钟 7 1/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 &二甲苯（I）20分钟 9 .二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。（三）浸蜡、包埋与修蜡块 1.浸蜡：将60C恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将组织块转入石蜡里，放置于60 C恒温箱120分钟。 2 .包埋：将60 C的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板 上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90 C左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3 .修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8卩m，将切片在55C左右水浴中展开，展开程度 以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37C烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上， 进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1.脱蜡 （1）二甲苯（I）15分钟 （2）二甲苯（II）15分钟 （3）100%乙醇2分钟 （4）95%乙醇（I）1分钟 （5）95%乙醇（II）1分钟 （6）蒸馏水浸洗1分钟 2 .染色
病理组织切片制作过程详解 -森贝伽生物实验代做中心 公司中心实验室建设有病理学，分子生物学，细胞生物学，免疫学，蛋白质组学，实验动物模型构建，生物芯片，生物信息学等实验技术服务平台。此外，还提供技术咨询培训，课题合作设计与申报，论文翻译润色等实验技术服务。 1．取材 取材的好坏，直接影响切片的质量。取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm 为适，较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，一定要非常小心。在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。 (1）材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 (2）组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm ×2.0cm ×0.2cm ，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm 即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm ，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 （3）勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 （4）规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 （5）选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 南京森贝伽生物科技有限公司 实验技术服务，代做实验
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 病理实验文字详解(切片) 第一章细胞、组织的适应、损伤和修复 14 号心肌褐色萎缩①注意观察心肌纵切面。 心肌纤维的粗细较正常有什么不同？②高倍镜下该处细胞核两端有折光性较强的黄褐色颗粒为褐色。 52 号慢性宫颈炎伴柱状上皮鳞状化生。 宫颈被覆上皮及腺上皮被鳞上皮所取代，部分区域上皮表面还可见柱状上皮，但下面为大片不完全成熟鳞状上皮（贮备细胞增生鳞化），上皮组织之间有较多的慢性炎细胞浸润。 15 号肾细胞水肿（肾浊肿）低倍镜下，首先找到肾皮质区的近曲小管。 观察其小管的上皮细胞肿大，突向管腔致使管腔狭窄。 高倍镜下可见这些上皮细胞的胞浆内布满大小一致的红染细小颗粒。 部分管腔内形成均匀红染物 21 号肝脂肪变性肝细胞浆内出现大小不等，边界清晰的圆形空泡，部分空泡融合变大，将肝细胞核挤向一侧，使肝细胞类似脂肪细胞。 肝细胞体积增大，肝窦明显受压，小叶轮廓不易辨认。 19 号结缔组织玻璃样变切片来源： 取自皮肤疤痕组织。 病变要点： 1 / 26
真皮内纤维组织增生，胶原纤维肿胀互相融合，形成一致半透明红染的玻璃样物质，其间仍可见若干纤维细胞。 5 号脾贫血性梗死肉眼观： 切片中央有一伊红淡染区，即贫血性梗死区，外围红色反应带，四周蓝染区为脾组织。 低倍镜下： 梗死区伊红淡染无结构一片荒凉、血窦轮廓尚可见。 在出血带与坏死区交界处可见坏死细胞核的残迹。 高倍镜下： 观察核固缩、核碎裂、核溶解等形态变化。 （1）肉眼： 淡染部分为梗死区，兰染部分为正常组织，二者之间有红染的充血出血带。 （2）低倍： ①正常区域可见红髓、白髓和小梁。 ②坏死区脾组织轮廓隐约可见，但大部分细胞核消失，胞浆呈红染颗粒状。 ③坏死组织与正常组织交界处，充满大量红细胞，即充血出血带。 （3）高倍： 重点观察坏死区的细胞变化。 ①核浓缩：
1.肝细胞水肿p5 低倍镜：肝小叶结构不清楚，肝细胞明显肿胀，胞质淡染。部分肝细胞肿胀如气球样。 高倍镜：体积明显增大，呈圆形。核淡染，胞浆机乎完全透明。 2.肝细胞脂肪变性p5 低倍镜：肝小叶周边部的肝细胞浆内出现大小不等的圆形空泡。 高倍镜：病变轻：胞浆内较小脂肪空泡。病变重：脂肪滴融合成大的空泡，细胞核被推挤在细胞的一侧，形似脂肪细胞。 11.慢性肺淤血p8 低倍镜：肺泡壁毛细血管及肺间质小血管高度扩张充血。部分肺泡腔内可见均匀粉红色的水肿液。 高倍镜：毛细血管腔内充满红细胞。肺泡腔红细胞和心衰细胞。12.慢性肝淤血p8 低倍镜：小叶中央静脉及附近肝窦高度扩张淤血。肝小叶周围肝细胞发生脂肪变性。 高倍镜：小叶中央静脉以及附近肝窦内充满红细胞。肝小叶中央淤血区肝细胞体积小、萎缩甚至消失。小叶周围肝细胞体积变大，胞质中出现脂肪空泡，（部分肝细胞表现为细胞水肿）。 15.肾贫血性梗死p8 低倍镜：（正常肾组织与梗死肾组织交错分布），梗死灶呈一片粉染区，其内可见轮廓模糊的肾小球和肾小管结构，梗死灶周边区域呈条带状红染。 高倍镜：肾小管上皮细胞数目明显减少或消失，残留的细胞核固缩，碎裂。 21.急性蜂窝织性阑尾炎p11 低倍镜：粘膜层不完整；渗出的炎细胞弥漫散在阑尾各层。 高倍镜：各层弥漫浸润的炎性细胞为嗜中性粒细胞。 31.直肠腺癌p25 低倍镜：肿瘤细胞形成腺管状结构，大小形态不一，分布极不规则，可见腺体共壁及背靠背现象，腺腔内可见分泌物及坏死物质。 高倍镜：细胞层次增多，肿瘤细胞异型性显著，极性紊乱，核大深染，
核分裂象多见。 32乳腺纤维腺瘤p14 低倍镜：肿瘤实质由增生的纤维组织和腺管构成。 高倍镜：肿瘤的纤维成分染色较浅，细胞suo形，大小一致；腺上皮细胞矮立方形，为单层或多层，核深染，大小一致。 35支气管鳞状细胞癌p14 低倍镜：可见残留支气管组织和软骨，癌巢片状或带状大小不等 高倍镜：高分化癌巢中有角化珠，细胞间桥，细胞核分裂象多见，低分化的则不见角化珠和细胞间桥。 52风湿性心肌炎p18 低倍镜：可见风湿小体 高倍镜：可见风湿小体中央有少许红色絮状物，为纤维素样坏死；周围可见风湿细胞，体积较大胞浆丰富，核膜增厚深染，染色质向中央集结，并有细丝放射至核膜，在横切面上呈枭眼状。 51冠状动脉粥样硬化p18 镜下：冠状动脉内膜部分增厚，呈半月形向管腔突出。表层纤维结缔组织增生，部分呈玻璃样变，其下见淡红色无结构的粥样坏死物质，内含针形裂隙（胆固醇结晶）。同时可见钙化灶和颗粒状蓝色钙化物质，底部可见残留的泡沫细胞。 62.大叶性肺炎（灰色肝样变期）p21 低倍镜：全部肺泡扩张，肺泡内充满炎症渗出物，病变分布一致，肺泡壁完整。 高倍镜：肺泡内的渗出物主要为大量呈网状、细丝状的纤维素、嗜中性粒细胞。 61小叶性肺炎p21 低倍镜：支气管壁充血，部分粘膜上皮坏死脱落，管腔内大量炎细胞浸润。 高倍镜：炎症细胞以嗜中性粒细胞和巨噬细胞为主，支气管周围的肺泡管腔变圆，轻度扩张，内充满炎症细胞。 63肺结核p33 低倍镜：可见多个散在、大小不一的结节状病灶，病灶中央大片粉红
1.大叶性肺炎（灰色肝样变期，肺泡腔内充满大量纤维蛋白，及炎细胞）(充血水肿期和红色肝样变期) （灰色肝样变期和溶解消散期） 2.小叶性肺炎（细支气管内见大量脓细胞） 3.矽肺（肺广泛纤维化，矽结节形成） 4.肺癌（可见癌巢） （中央型和周围型比较）
5.慢性萎缩性胃炎（黏膜上皮萎缩，腺体小，少，层次减少，肠化（杯状细胞）间质增生，淋巴细胞浸润） 6.慢性胃溃疡：1渗出层，即白细胞，纤维素，及坏死物构成。2坏死层，由坏死组织构成。3肉芽组织层。4疤痕组织，致密纤维结缔组织构成 （渗出坏死层和肉芽组织层）
（陈旧瘢痕组织层和整体观） 7.门脉性肝硬化（假小叶中央静脉无或偏位，肝细胞轻度脂变。汇管区有小胆管，纤维组织增生，淋巴细胞浸润） 8.胃癌（G：） 1）早期胃癌：隆起型、表浅型、凹陷型； 2）中晚期胃癌：息肉型、溃疡型、浸润型 9.胃粘液腺癌（印戒细胞癌和粘液湖）
10.原发性肝癌（M：肝癌的组织学类型） 1）肝细胞型：发生于肝细胞，最多见 2）胆管细胞癌：发生于肝内胆管上皮； 3）混合细胞型肝癌：癌组织中具有上述两种成分，最少见） 11.肝细胞肝癌--癌巢
12.病毒性肝炎-点状坏死（坏死处肝细胞核脓缩，碎裂，溶解，肝细胞索消失，间质充血） 13.急性弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎：大红肾，肾小球内细胞增多，主要毛细血管内皮细胞，系膜细胞，中心细胞 （正常与非正常比较） 14.慢性肾炎（大体固缩，肾小球纤维化，肥大共存） 15.葡萄胎（绒毛肿大，间质血管消失，细胞滋养层细胞在内，合体滋养层细胞在外，都增生排列）
16.绒毛膜上皮癌 1）细胞滋养层细胞 2）合体滋养层细胞 17.乳腺癌（肿瘤细胞大小不一，呈多角形核呈空泡状，核仁明显，核分裂象多见）(导管内癌和浸润性导管癌) （小叶原位癌和浸润性小叶癌）
组织病理切片制备流程 组织病理切片按照制备方法的不同分为石蜡切片、冰冻切片和振动切片。 石蜡切片制备过程包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般从取材固定到封片制成玻片标本需要数日。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。制作过程不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续，避免组织细胞中可溶性物质的分解，并能保存细胞形态的原。与石蜡切片相比，在抗原完整性的保存上有其不可取代的优势，尤其在免疫组化方面。因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。 振动切片在文献中讨论较少。制备方法是采用的专用振动切片机，利用刀片振动原理，将新鲜的活体组织，直接固定在切片槽中切片。该方法能保持样品活性和细胞良好形态，给免疫细胞化学研究及脊髓和脑薄片神经生物学研究提供了良好条件，适合做组织电生理学等研究。 不同切片方法由于制作的工艺流程不同，所需的仪器设备和工具有差别。 一、石蜡切片的制作 根据文献报道石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1.固定 用适当的固定液浸渍新鲜材料，凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，使组织硬化，尽可能保持活体时的结构。固定时间从1小时至数天，通常为数小时至24小时。 2.洗涤与脱水 组织在固定后要把渗入里面的固定液洗去，否则留在组织中的固定液有的会妨碍染色，有的会产生沉淀或结晶。
组织病理切片的制作过 程 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
组织病理切片的制作过程 1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 (2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。