核酸的理化性质
核酸的紫外吸收
Pyrimidine Purine
嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光有较强的吸收
A260的应用
DNA 或RNA 的定量 1 判断核酸样品的纯度
2 50μg/ml 双链DNA
40μg/ml 单链DNA （或RNA ）
20μg/ml 寡核苷酸
DNA 纯品: A 260/A 280 = 1.8
RNA 纯品: A 260/A 280 = 2.0 A 260=1.0相当于
定义
方法
在某些理化因素作用下，DNA 双链解开、氢键断裂，这种现象称为DNA 的变性。
温度、pH 、离子强度等
DNA 变性的本质是双链间氢键的断裂
热变性
DNA的增色效应
增色效应
DNA变性时其溶液260nm处吸光度增加的现象
DNA的解链曲线
热变性解链曲线
如果在连续加热DNA的过
程中，以温度对A260值作
图，所得的曲线称为解链
曲线。
DNA 的Tm 值
50%的DNA 分子发生变性时的温度
Tm 热变性
Tm
通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸
收值达到最大增加值50%时的温度称为
核酸的解链温度或融解温度(melting
temperature, Tm )
DNA 的复性与分子杂交
DNA 复性(renaturation)的定义
减色效应
在适当条件下，变性DNA 的两条互补链重新配对，恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 DNA 复性时，其溶液OD 260降低。
DNA 的变性和复性
加热
缓慢冷却
热变性的DNA 经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing)
将热变性的DNA 骤然冷却至低温时，DNA 不可能复性
核酸分子杂交
◆不同来源的变性核酸，在复性时依照碱基互
补配对的原则，形成互补双链的过程称为核
酸分子杂交(hybridization)
◆杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以
发生于RNA与RNA之间和DNA与RNA之间
DNA 复性和杂交示意图
升温 缓慢降温
DNA1-DNA2 DNA1 DNA2 DNA2 DNA1 图a 图b 图c
核酸分子杂交的应用
常见的几种分子杂交
Southern 杂交（Southern bolting）:DNA杂交Northern 杂交（Northern bolting）:RNA杂交Western 杂交（Western bolting）:蛋白杂交
小结
1
核酸分子在260nm处有强烈的紫外吸收
2
核酸分子在一定条件下，可以变性和复性。3
变性的核酸可以复性或形成杂交双链
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7-3 核酸的物理化学性质上册P502 （一）核酸的水解： 所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。 （1）酸水解： 糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。 （2）碱水解： 磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过 程见P502。 （3）酶水解： 为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。 1.核酸酶的分类： 按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。 按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用 点在末端）。 2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py） -3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。 3.限制性内切酶：为DNase。 剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基 化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可 识别和降解外源DNA。 断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定 位点两条链切断后形成粘末端或平末端。 限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli) 属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4 个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。（二）核酸的酸碱性质： 核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。 由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。 （三）核酸的紫外吸收： 嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。 （1）可用于测样品纯度（测吸光度A）： A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。 对于纯样品，从260nm的A值即可算出含量。A值为1，相当于50μg/mL DNA双螺旋，或40μg/mL单链DNA（或RNA），或20μg/mL寡核苷酸。 （2）核酸的摩尔磷吸光系数ε（P）：为含有1克原子磷（30.98g）的核酸在260nm 处的吸光系数。 ε（P）= A / CL. = 30.98 A / W L A：吸收值，C：每升溶液的磷摩尔数，C=W/30.98，L：比色杯内径。 一般天然DNA ε（P）为6600，RNA为7700~7800 由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，使紫外吸收比单链减少，由此可判断DNA是否变性。
核酸的性质 核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。 一、一般物理性质 1. 溶解度DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。 2. 分子大小DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。 3. 形状及粘度核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。RNA溶液的粘度要小得多。核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。 二、核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从 A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。通常以1OD 值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色而粗略地估计其含量。 三、核酸的沉降特性
第15章、核酸的物理化学性质（上册P502） 本章重点：1、核酸的水解，2、核酸的紫外吸收，3、核酸的变性和复性 本章的主要内容： （一）核酸的水解： 所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。 （1）酸水解： 糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。 （2）碱水解： 磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过 程见P502。 （3）酶水解： 为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。 1.核酸酶的分类： 按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。 按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用 点在末端）。 2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py） -3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。 3.限制性内切酶：为DNase。 剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基 化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可 识别和降解外源DNA。 断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定 位点两条链切断后形成粘末端或平末端。 限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli) 属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4 个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。（二）核酸的酸碱性质： 核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。 由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。 （三）核酸的紫外吸收： 嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。 （1）可用于测样品纯度（测吸光度A）： A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。 对于纯样品，从260nm的A值即可算出含量。A值为1，相当于50μg/mL DNA双螺旋，或40μg/mL单链DNA（或RNA），或20μg/mL寡核苷酸。 （2）核酸的摩尔磷吸光系数ε（P）：为含有1克原子磷（30.98g）的核酸在260nm 处的吸光系数。 ε（P）= A / CL. = 30.98 A / W L
第 15 章、核酸的物理化学性质（上册 P502） 本章重点： 1、核酸的水解， 2、核酸的紫外吸收， 3、核酸的变性和复性本 章的主要内容： （一）核酸的水解： 所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。 （1）酸水解： 糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。 （2）碱水解： 磷酸酯键易水解， RNA 比 DNA 易水解，因为 RNA 核糖上有 2‘ - OH ，水解过程见 P502。 （3）酶水解： 为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。 1.核酸酶的分类： 按底物专一性分为 RNase（核糖核酸酶）和 DNase（脱氧核糖核酸酶）。按对 底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用 点在末端）。 2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（ EC 2.7.7.16 ），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（ Py） ‘ - 3 - 磷酸与其他核苷酸之间的连键。 3.限制性内切酶：为 DNase。 剪裁 DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基 化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可 识别和降解外源 DNA 。 断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点 两条链切断后形成粘末端或平末端。 限制性内切酶命名：如 E. coR Ⅰ，第 1 个字母 E( 大写 ) ，为大肠杆菌 (E.coli) 属名的第一个字母，第2、 3 两个字母co （小写）为种名头两个字母，第 4 个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。 （二）核酸的酸碱性质： 核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。 由于 DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。 （三）核酸的紫外吸收： 嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在 260nm 附近（蛋白质最大吸收值280nm）。 （ 1）可用于测样品纯度（测吸光度 A ）： A260/A280 比值，纯DNA 应大于 1.8，纯RNA 应达到 2.0，若样品混有杂 对于纯样品，从 260nm 的A 值即可算出含量。 A 值为1，相当于50μ g/mL （ 2）DNA 双螺旋，或40μ g/mL 核酸的摩尔磷吸光系数ε（ 单链 DNA （或 RNA ），或 P）：为含有 1 克原子磷（ 20μ g/mL 寡核苷酸。 30.98g）的核酸在260nm 处的吸光系数。 ε（ P） = A / CL. = 30.98 A / W L