逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定
摘要：为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能，构建了C端带有FLAG、HA、6xHis三标签的pOZ-KLF5真核表达逆转录病毒栽体。pOZ-KLF5栽体可通过一次转录得到双顺反子转录单位，即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质：三标签融合蛋白KLF5-3xTag和筛选标记——白细胞介素-2受体a （IL-2Ra）。通过偶联IL-2Ra抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3xTag表达阳性的293T细胞，经Western-blot检测细胞内KLF5-3xTag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响，发现KLF5-3xTag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多，且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解，与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。关键词：KLF5；双顺反子转录；真核表达；三标签融合蛋白中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu，WANG Wei-xi，LU Ze-lan，HUANG Lei，ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）Abstract：To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5，the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5，with the FLAG，HA，6xHis triple tags at C-terminal，was con?structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins：triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody，and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then，the proliferation and cell cycle of 293T were tested，and the results indicated that KLF5-3xTag promotes the proliferation of cell colonies and the Gl/S transition.In addition，co-expression of WWP1，a known E3 ligase of KLF5，can decrease KLF5-3xTag protein level，which is consistent with previous reports. Furthermore，immunoprecipi- tation experiment was applied to prove the immunoreaction of the tags. The successful construction of pOZ- KLF5 provides a powerful tool to study the interacting proteins of KLF5 and to explore the biological func?tions of KLF5.Key words：KLF5；bicistronic transcription；eukaryotic expression；triple-tagged fusion protein（Life Science Research，2015，19（2）：124?130）KLF5蛋白是类KtlippeKKriippel-likefactors，KLF）转录因子家族的一员，属于基础转录因子。到冃前为止该家族巳经有17个成员被鉴定出来。KLF5又名BETB2（basictranscriptionelement-bindingprotein2）和IKLF （intestine-enrichedKriippel-likefactor），在胚胎发育、细胞周期、细胞生长与分化、维持细胞干性等生物过程中发挥作用。研究发现KLF5在人和小鼠的小肠、结肠、胃、胰腺、胎盘、睾丸、骨骼肌、肺、膀胱和子宫等组织中广泛表达[1-3]。KLF5能与多个基因的GCbox区域结合从而调控其转录。KLF5蛋白C端含有KLFs家族特征性的、可以结合基因组DNA的3个串联重复的锌指（zincfinger，ZF）结构域，在ZF结构域前含有富含脯氨酸的转录激活结构域。值得关注的是，KLF5在不同的细胞类型中发挥的作用不同，已有的研究提示这可能与KLF5的
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
文章编号:100025404(2004)1821639204 论著 人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定 段小军1,杨 柳1,董世武2,周 跃3,唐康来1,胡 鸢1 (第三军医大学:1西南医院骨科,2基础医学部解剖学教研室,重庆市生物力学实验室,重庆400038,3新桥医院骨科,重庆400037) 提 要:目的 构建人缺氧诱导因子21α(HIF21α)基因重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率。方法 采用基因工程技术,经过2次亚克隆将HIF21α基因片段克隆至含IRES2EG FP逆转录病毒载体上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果 酶切鉴定及PCR结果与HIF21α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达(114×106pfu/ml),并对NIH3T3细胞有强感染能力。结论 应用基因工程技术,成功构建了含人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件。 关键词:逆转录病毒;缺氧诱导因子21;基因克隆 中图法分类号:R782;R394233;R394.3 文献标识码:A Construction and identification of human hypoxia2inducible factor21αgene recombinant retrovirus DUAN X iao2jun1,Y ANGLiu1,DONG Shi2wu2,ZH OU Y ue3,T ANG K ang2lai1,H U Y uan1(1Department of Joint Surgery,S outh2 west H ospital,2Department of Anatomy,C ollege of Medicine,3Department of Orthopedics,X inqiao H ospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o construct the recombinant retrovirus of human hypoxia2inducible factor21α(HIF21α) gene and to observe its ability to in fect NIH3T3fibroblasts.Methods The full2length human HIF21αcDNA was cloned into the retroviral vector containing internal ribos omal entry site(IRES)and enhanced green fluorescent pro2 tein(EG FP)by the method of gene engineering.Then the retroviral vector with HIF21αwas trans fected into PT67 cells using the lipofectine DOT AP and NIH3T3cells was in fected by the recombinant retrovirus.The target gene was detected by polymerase chain reaction(PCR).The titer and its in fection rate were determined using the EG FP ex2 pression with a fluorescent microscope.Re sults Restriction endonuclease and PCR analyses con firmed that the hu2 man HIF21αcDNA was success fully inserted into the retroviral vector.The titer of recombinant retrovirus with HIF21αgene was114×106pfu/ml and the retrovirus had a strong effect on NIH3T3cells.Conclusion The recombinant retrovirus containing HIF21αgene has been success fully constructed by the method of gene engineering,which lays a foundation for the application in therapeutic angiogenesis. K ey w ords:retrovirus;hypoxia2inducible factor21;gene clone 缺氧诱导因子21(hypoxia2inducible factor21,HIF21)是近年来发现的一种核转录因子,对缺氧状态下的血管生成(Angiogenesis)起核心调控作用,同时还具有调节细胞能量代谢,增强机体氧供给等作用1。HIF21是由α亚基和β亚基组成的异二聚体,属于bH LH2PAS 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270375) Supported by the National Natural Science F oundation of China(30270375) 作者简介:段小军(1972-),男,四川省渠县人,博士研究生,主治医师,主要从事组织工程学、血管生成方面的研究,发表论文11篇。电话: (023)68754000273007,E2mail:dxj9@https://www.doczj.com/doc/cf16175602.html, 通信作者:杨 柳,电话:(023)68765280,E2mail:jointsurgery@https://www.doczj.com/doc/cf16175602.html, 收稿日期:2004201215;修回日期:2004206221家族成员,其中β亚基在细胞内稳定表达,α亚基在功能调控方面起主要作用2。为此,本实验采用基因工程技术,体外构建表达人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,旨在为进一步应用HIF21促进血管生成的研究创造条件。 1 材料和方法 111 质粒和菌株 含人HIF21α质粒(215kb)pBSK hHIF1αT7由瑞士苏伊士大学G assmann教授惠赠。逆转录病毒载体pLEG FP2N1、pIRES22 EG FP购自Clontech公司。大肠杆菌DH5α菌株、病毒包装细胞PT67由创伤、烧伤与复合伤全军复合伤研究所国家重点实验室 9361 第26卷第18期2004年9月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE V ol.26,N o.18 Sep.2004
分子生物学试题及答案
分子生物学试题及答案一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。
除了5’ 3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。 5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（ DNA重组技术）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（ hnRNA在转变为mRNA 的过程中经过剪接，）、
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
合同编号：YT-FS-4484-56 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书 (完整版) Clarify Each Clause Under The Cooperation Framework, And Formulate It According To The Agreement Reached By The Parties Through Consensus, Which Is Legally Binding On The Parties. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版) 备注：该合同书文本主要阐明合作框架下每个条款，并根据当事人一致协商达成协议，同时也明确各方的权利和义务，对当事人具有法律约束力而制定。文档可根据实际情况进行修改和使用。 服务方（甲方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______ e-mail：_____ 开户银行：_____ 帐号：______ 委托方（乙方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称 甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_____腺病毒，腺病毒滴度_____pfu/ml。 第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买； 2．合同总价_____元，（大写）_____。 第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、
筮四至医太堂堂亟（！里！竺些丛！！塑鲤旦里ｉ！！兰塑！；堑（！兰２丛Ｐ；』４１坚里生：鱼竺旦：！塑：塑 ?研究简报?文章编号：１０００＿２７９０（２００５）１４一封２旬１ 重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素 杨生玺１，蒋虹２（青海大学：１医学院生物教研室，２附属医院高压氧科，青海西宁８１０００１） 【摘要】目的：探讨产生重组逆转录病毒包装及其病毒滴度（以ｃｆｕ表示）的影响因素．方法：用逆转录病毒载体ｐＭＮｓ—ＴＫ—Ｍ，以脂质体法转染包装细胞ＰＡ３１７细胞，挑选抗性集落（ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ—Ｍ）扩大培养后，进行ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ细胞接种密度、培养温度（３７℃，３２℃）、纯化方法等对其培养上清中重组病毒ｃｆｕ影响的比较性研究．结果：包装细胞的密度是影响ｃｆｕ的关键因素；降低培养温度需延长培养时间方可提高ｃｆｕ滴度．结论：该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的基因治疗实验研究提供重要的参考依据． 【关键词】逆转录病毒载体；包装细胞；病毒滴度 【中图号】Ｒ３９４【文献标识码】ＢＧ４１８的ＤＭＥＭ培养液继续培养３ｄ，然后更换含８００ｍ∥Ｌ的Ｇ４１８的培养液，培养约１４ｄ，细胞克隆基本形成．分别以０．５，０．７，０．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，于相同温度及相同培养时间条件下制备含重组逆转录的包装细胞上清，并于相同的条件下测定它们的ｃｆｕ滴度．取最高ｃｆｕ的包装细胞系集落，以相同的密度接种细胞，分别在３７℃及３２℃的条件下培养细胞，并于２４ｈ及４８ｈ分别收集细胞上清测定病毒ｃｆｕ滴度． ２结果采用脂质体法，将逆转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ导入ＰＡ３１７细胞，命名为ＰＡ３１７／ＴＫ．根据ＨｓＶ．ＴＫ基因设计的引物ＰｃＲ扩增产物大小为４０４ｂｐ．经ＰｃＲ扩增，载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞均出现阳性条带，而ＰＡ３１７细胞未出现相应条带（图１）．分别以０．５，Ｏ．７，Ｏ．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，２４ｈ收集上清测定ｃｆｕ，结果随细胞密度上升而上升．在ＰＡ３１７／ＴＫ包装细胞密度相同条件下降低温度需延长培养时间，我们在３２ｃｃ条件下培养４８ｈ获得了４．０×１０７ｃｆ∥Ｌ的病毒滴度． ０引言在目前众多的基因治疗临床试验方案中，逆转录病 毒载体仍是被广泛应用的载体之一．作为目的基因转运过程 中的逆转录病毒载体和包装细胞，其本身的分子生物学特性４０４ｂｐ已被广泛研究，但对于包装后这些含目的基因的重组逆转录 病毒的生物、物理学特性的研究却较少．为此，我们对产生重 组逆转录病毒的包装细胞系的建立过程及其上清中重组逆转 录病毒集落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｍｉｎｇｕｎｉｔ，ｃｆｕ）影响因素进行 了比较性研究． １材料和方法 １．１材料含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的小鼠白血病源性逆转录病毒表达载体ｐＭＮＳ—ＴＫ，ＰＡ３１７包装细胞及小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３ｒ１３培养于含胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中．ＤＭＥＭ，ＲＰＭｌｌ６４０培养基等均为Ｇｉｂｃｏ公司产品，胎牛血清为四季青公司产品．逆转录病毒载体、细胞株ＰＡ３１７，ＮＩＨ３１ｒ３由东南大学医学院遗传中心惠赠． １．２方法按常规方法扩增、抽提、纯化质粒ＤＮＡ片段、回收ＨｓＶ—ＴＫ片段．在Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ的作用下，定向克隆入逆转录病毒载体ｐＭＮｓＭ中ｓｖ４０启动子下游的多克隆位点．重组质粒转化ＪＭｌ０９菌后经克隆筛选、鉴定获重组质粒ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ．以脂质体法将上述重组质粒ＤＮＡ转染至逆病毒包装细胞ＰＡ３１７．以含４００ｍ∥ＬＧ４１８的ＤＭＥＭ选择培养基选择培养１４ｄ，获Ｇ４１８抗性克隆ＰＡ３１７／ＴＫ细胞ＮＩＨ３ｒ１３细胞为靶细胞在Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下测定、计算病毒滴度．病毒滴度（ｃｆｈ／Ｌ）＝细胞克隆平均数×病毒液稀释倍数×１０３．将收集到的病毒上清液分别作１０～，１０～，１０，１０。倍稀释．分别吸取１．５ｍＬ稀释的病毒液（８ｍｇ／Ｌ聚凝胺）加入ＮＩＨ３耶细胞培养瓶内，使病毒吸附２．５ｈ后，补加等量含３００ｍｇ／Ｌ 收稿日期：２００５旬２旬７；修回日期：２００５＿０３一ｌｌ 基金项目：国家自然科学基金（３００７０２２９） 通讯作者：杨生玺（１９６３一），男（汉族），青海省西宁市人．学士，副教授，青海大学医学院生物教研室副主任．Ｔｅｌ．（０９７１）６１４３６３１Ｅｍａｉｌ．ｙａｎ百ｉａｎ９６３＠１２６．ｃｏｍ ｌ：ＧＩＮ仅ＴＫ；２：ＰＡ３１７／ＴＫ；３：Ｍａｒｋｅｒ． 图１载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞出现的阳性条带 ３讨论将外源基因转入靶细胞是基因治疗的基础和关键步骤，其效率的高低将直接影响整个基因治疗的效果甚至成败，而包装后逆转录病毒滴度的高低是重要参数之一．结果提示在建立稳定产生重组腻转录病毒的包装细胞时，抗性集落数量的挑选应尽可能多一些并需传代培养观察病毒滴度的变化．制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清时，细胞密度及培养温度是影响病毒滴度的重要因素，细胞密度与细胞生长状态有关，过低或过高的细胞密度对细胞生长均不利，均不能使病毒滴度达到最佳化．用聚凝胺处理细胞，可提高对逆转录病毒的敏感性’１Ｊ．张惠中等心。报道在细胞培养皿中接种１．２×１０６个包装细胞可获最佳的效果．采用降低培养温度的方法，在工业化培养罐中可以提高细胞病毒滴度．把病毒上清液进行超速离心，透析纯化，浓缩处理，有可能将病毒滴度提高到较高水平，从而满足今后以逆转录病毒载体进行的临床基因治疗的需要． 【参考文献】 ［１］陈道桢，张丽珊，鲁晓萱，等．胸苷激酶基因对乳腺癌细胞的杀伤性研究［Ｊ］．实用癌症杂志，２００３；１８（２）：１２２—１２５． ［２］张惠中，范清宇，杨安钢．产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素［Ｊ］．第四军医大学学报，２００ｌ皿（４）：３１３—３１５． 编辑潘伯荣 万方数据
2011病毒学复习题库 一、选择（33小题） 1.目前已知病毒5种核酸类型是（）。 、+DNA、、+RNA、－RNA； 、+DNA、－DNA、、＋RNA； 、+DNA、－DNA、、－RNA； 、－DNA、、+RNA、－RNA。 2.人类免疫缺陷病毒的病毒粒子中含有（）。 分子及反转录酶； B.+RNA分子及反转录酶； C.－RNA分子及反转录酶； D.+RNA分子。 3.下列哪一类病毒属于反转录病毒？（） A.腺病毒； B.脊髓灰质炎病毒； C.流感病毒； D.人类免疫缺陷病毒。 4.多数病毒粒子的直径在（）。 A.1nm上下； B.10nm上下； C.100nm上下；上下。 5.病毒粒子中的一种结构是来自寄主细胞膜的，它是（）。 A.包膜； B.刺突； C.衣壳； D.核心。 6.一些丝状噬菌体如M13等，感染寄主细胞后（）。 A.不裂解寄主细胞； B.裂解寄主细胞； C.一般不裂解寄主细胞，偶尔裂解； D.一般裂解寄主细胞，偶尔不裂解。 7.双链RNA病毒的复制方式（）。 A.都是全保留复制； B.都是半保留复制； C.都是以滚环复制； D.有一些以全保留复制，另一些则以半保留复制。 8.有3类病毒的病毒粒子中携带着核酸复制所需要的酶，它们是（）。 病毒、－RNA病毒、逆转录病毒； 病毒、－RNA病毒、+DNA病毒； 病毒、－RNA病毒、+RNA病毒； 病毒、－RNA病毒、病毒。 9.T4噬菌体侵入寄主细胞后，其早期转译所产生的蛋白质中，最重要的一种是（）。 A.T4的RNA聚合酶； B.修饰寄主的RNA聚合酶的更改蛋白； C.分解寄主细胞的DNA酶； D.T4的DNA聚合酶。 10.溶源性细菌在其染色体组上整合有（）。 A.温和噬菌体DNA； B.烈性噬菌体DNA； C.烈性噬菌体粒子； D.温和噬菌体粒子。 11.白喉棒杆菌当其染色体DNA整合了噬菌体的核酸以后，就能合成白喉毒素，成为有毒菌株，此种现象称为（）。 A.转化； B.转导； C.转染； D.溶源转变。
现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。 瞬时转染制备慢病毒： 细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编 码基因，转染效率极高。但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。 DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。质粒的纯度对慢病 毒载体的包装效率非常关键。不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。 转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。其它方法有脂质体法和PEI法。转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病 毒载体。之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。储存溶液添加血清会帮助提高 病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。 病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储 存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。甚至是不同的实验室测出来的都会有差异。亦可使用PCR 法测定滴度，其引物设计针对病毒颗粒的通用cDNA区域，因此不受外源插入片段的影响，也不需要反转录步骤，而且可以用于所有慢病毒载体。 注意事项 1.避免使用小量抽提质粒，其纯度相比中抽和大抽而来的质粒纯度较低，可能会降低包装效率。 2.对于基于HIV-1的慢病毒载体而言，依实验目的，可能需要Vpr或者Rev辅助蛋白因子。有些细胞类型需要这些辅助蛋白的参与才能达到高侵染效率。 3.包装细胞系的质量对高效包装病毒非常关键。转染时，细胞密度在70-90%之间比较合适，过低或者过高密度 都可能会降低病毒包装效率。细胞开始出现汇合时，需要及时更换或者添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。 4.氯喹对细胞有毒性，一般将标准使用浓度之下的氯喹与细胞共孵育的时间控制在8小时之内。或者降低氯喹的使用浓度，延长孵育时间。 5.病毒包装时的细胞培养温度需要综合两方面因素考虑：a)，370C最有利于保持细胞健康状态;b)，320C最有利于维持重组病毒的稳定性。 6，收集病毒上清时的离心步骤可以去除细胞碎片以及少数悬浮的293T细胞。必要时，需要过滤以彻底去除一些细胞成分的污染。 7.冻融会降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反复冻融。病毒放置于4℃时每36-48小时侵染效率下降50%。 8.视实验目的而定，为降低血清成分污染，建议使用低浓度血清培养基。 9.通过使用0.45mm的滤膜不仅可以去除细胞碎片残留，还可以去除VSV-G残留片段对细胞的毒性影响，但同 时也会部分影响病毒滴度，所以过滤步骤需要依据具体实验目的而定。 10.使用TNE重悬病毒沉淀时，虽然低体积会增加病毒浓度，然而由于VSV-G介导病毒与细胞的融合，所以高 浓度VSV-G对细胞会造成一定毒性，而有些细胞对VSV-G引起的毒性比较敏感，因此最终体积需要依据具体实验而定。
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；
临床医学综合笔试必做试题及答案 53.逆转录病毒包括 A. 人类嗜T细胞病毒 B. 人类免疫缺陷病毒 C. 狂犬病病毒 D. 水痘-带状疱疹病毒 E. 人疱疹病毒 54.HIV的主要传播方式是 A. 性接触传播 B. 血液或血制品传播 C. 母婴传播 D. 消化道传播 E. 呼吸道传播 55.HIV侵犯的淋巴细胞有 A. TH B. Ts C. NK D. Tc E. TD 56.下列哪些细胞可能受HIV侵犯 A. 单核-巨噬细胞
B. 郎格罕氏细胞 C. 神经胶质细胞 D. 树突状细胞 E. 神经元 57.逆转录病毒的特性有 A. 有逆转录酶 B. 具有包膜 C. 基因组为单负链RNA二聚体 D. 复制时通过RNA∶DNA中间体 E. 能整合于宿主细胞染色体 58.HIV感染的特点是 A. 临床潜伏期可有数年 B. 引起机体免疫功能下降 C. 易并发机会感染 D. 可通过垂直传播导致胎儿感染 E. 易发生肿瘤 59.HIV损伤CD4细胞的机制 A. 可能是病毒侵犯细胞，导致细胞膜通透性增加而损伤细胞 B. 病毒增殖时产生大量未整合的病毒DNA，干扰正常细胞生物合成 C. 感染病毒的CD4+细胞与未感染病毒的CD4+细胞融合，形成多核巨细胞 D. 通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用而破坏细胞
E. 通过抗gp120的抗体与T细胞膜上的MHC-Ⅱ分子结合起交叉反应，导致免疫病理损伤 60.预防AIDS的主要措施有 A. 教育人们杜绝性滥交和吸毒，切断传播途径 B. 建立HIV感染和AIDS检测系统，调查、了解、控制HIV感染及发病 C. 严格检疫制度，阻止艾滋病人入境 D. 对供血者严行HIV检测，确保输血安全性 E. 加强血制品生产和管理。确保血制品的安全性 61.HIV感染后，机体 A. 可产生中和抗体，清除病毒 B. 可产生中和抗体，急性期可降低血清中病毒抗原量，但不能清除体内病毒 C. 可产生细胞免疫，清除病毒 D. 最后细胞免疫功能降低，并发各种感染 E. 无免疫应答 62.研制HIV疫苗最好的成分是 A. 衣壳蛋白(p24) B. 内膜蛋白(p17) C. 逆转录酶 D. gp120 E. 包膜糖蛋白
什么是腺病毒载体疫苗 腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。 腺病毒载体疫苗特点 研究发现，携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫。此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。 腺病毒载体疫苗的临床研究 1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应 腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒，6h即可检测到IL-6、IL-1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集，在恒河猴中也观察到类似现象。 2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫 很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。 3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫 特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。大量的临床前和临床研究发现，腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T 细胞反应。有研究报道，携带恶性疟原虫抗原的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T 细胞免疫反应，最高能达到92％的保护率。 4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫 能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点。黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。研究发现，在多种动物模型中，口服或滴鼻接种肺炎球菌、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、乙肝病毒的重组腺病毒载体疫苗，都能刺激机体产生很强的体液免疫和局部的黏膜反应，并保护机体免受相应病原的侵害。
基因工程测练题 1、将人的抗病毒干扰基因“嫁接”到烟草的DNA分子中，可使烟草获得抗病毒的能力，形成转基 因产品。试分析回答： (1) 人的基因工程之所以能接到植物体中去，原因是：。(4)不同生物间基因移植成功，说明生物共有一套，从进化的角度看，这些生物具 有。 (3) 烟草具有抗病毒能力，说明烟草体内产生：。 (4) 烟草DNA分子被“嫁接”上或“切割”掉某个基因，实际并不影响遗传信息的表达功能。这说 明。 (5) 有人认为，转基因新产品也是一把双刃剑，有如船能载舟也能覆舟，甚至可能带来灾难性的 后果，你是否支持这一观点？如果支持，请你举出一个可能出现的灾难性后果的实例： 。 2、1990年对一位缺乏腺苷脱氨酶基因，而患先天性体液兔疫缺陷病的美国女孩进行基因治疗， 其方法是首先将患者的白细胞取出作体外培养，然后用逆转录病毒将正常腺苷脱氨酶基因转入人工培养的白细胞中，再将这些转基因白细胞回输到患者的体内，经过多次治疗，患者的免疫功能趋于正常。 （1）在基因治疗过程中，逆转录病毒的作用相当于基因工程中基因操作工具中的，此基因工程中的目的基因是，目的基因的受体细胞是。 （2）将转基因白细胞多次回输到患者体内后，兔疫能力趋于正常是由于产生了，产生这种物质的两个基本步骤是、。 3、在植物基因工程中，用土壤农杆菌中的Ti质粒作为运载体，把目的基因重组入Ti质粒上的 T-DNA片段中，再将重组的T-DNA插入植物细胞的染色体DNA中。 （1）科学家在进行上述基因操作时，要用同一种分别切割质粒和目的基因，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过而黏合。 （2）将携带抗除草剂基因的重组Ti质粒导入二倍体油菜细胞，经培养、筛选获得一株有抗除草剂特性的转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的T-DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，在该转基因植株自交F1代中，仍具有抗除草剂特性的植株占总数的，原因。（3）种植上述转基因油菜，它所携带的目的基因可以通过花粉传递给近缘物种，造成“基因污染”。如果把目的基因导入叶绿体DNA中，就可以避免“基因污染”，原因是: 。