石蜡包埋组织的DNA提取及其应用 近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或m RNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。 一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法 从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Du beau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DN A之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。 表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 （1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇4℃3～4h 2 80%乙醇4℃3～4h 3 90%乙醇4℃2～3h 4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h 5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
数据包络分析方法介绍和应用综述 【摘要】数据包络分析(Data Envelopment Analysis,DEA)是一种基于线性规划理论的模型,它将多输入指标和多输出指标综合成为单个评价指标，是运筹学、管理科学和数理经济学交叉研究的一个新的领域。数据包络分析使用数学规划评价具有多个输入与输出的决策单元(简记为DMU)间的相对有效性(DEA 有效), 使用DEA对DMU进行效率评价时, 可以得到很多在经济学中具有深刻经济含义和背景的管理信息。本综述的目的是介绍DEA研究的历史、现状, 特别是它的发展过程及某些新的模型扩展，同时综合阐述了DEA在生产、管理、商务中的广泛应用和它的发展趋势。 关键词：数据包络分析模型结构决策单元发展以及应用趋势 一、数据包络分析（DEA）概念及模型简介 1、概念 数据包络分析(Data Envelopment Analysis,DEA)是运筹学、管理科学和数理经济学交叉研究的一个新的领域。1978年由著名的运筹学家A.Charnes,W.W.Cooper和E.Rhodes首先提出了一个被称为数据包络分析（Data Envelopment Analysis，简称DEA）的方法，主要用来评价生产中各个部门间的相对有效性（因此被称为DEA有效）。我国自1988 年由魏权龄①系统地介绍DEA 方法之后, 先后也有不少关于DEA 方法理论研究及应用推广的论文问世。 其中，比较全面的一篇论文是《系统工程理论和方法应用》1994年3卷第4期，东南大学经济管理学院的朱乔的《数据包络分析方法综述与展望》，指出“据国外统计已经有400余篇关于DEA的研究论文、工作报告或者学术论文可查，例如：Annals of Operational Research(1985)、European Journal of Operational Research(1992)、Journal of Productivity Analysis(1992)等等，还有近期为了悼念A.Charnes,W.W.Cooper教授，Annals of Operational Research还专门出版了“从有效性计算到组织和分析数据的新方法---DEA方法15年”的专刊。” 中国人民大学教授魏全龄，在《评价相对有效性的DEA 方法———运筹学的新领域》一文中系统地介绍了DEA的方法，指出数据包络分析(Data Envelopment Analysis,DEA)是一种基于线性规划理论的模型,它将多输入指标和多输出指标综合成为单个评价指标。 在此基础上，李美娟, 陈国宏2003年在《数据包络分析法(DEA) 的研究与应用》中指出DEA 方法以相对效率概念为基础, 用于评价具有相同类型的多投入、多产出的决策单元是否技术有效的一种非参数统计方法，并且对DEA的基本思路进行了详细阐述。 经过各方面的努力，可见数据包络分析(Data Envelopment Analysis,DEA)是一种基于线性规划理论的模型,它将多输入指标和多输出指标综合成为单个评价指标，其基本思路是把每一个被评价单位作为一个决策单元(DMU ,decision making unit s) , 再由众多DMU 构成被评价群体, 通过对投入和产出比率的综合分析, 以DMU 的各个投入和产出指标的权重为变量进行评价运算, 确定有效生产前沿面, 并根据各DMU 与有效生产前沿面的距离状况, 确定各DMU 是否DEA 有效, 同时还可用投影方法指出非DEA 有效或弱DEA 有效DMU 的原因及应改进的方向和程度。 2、模型简介 A.Charnes,W.W.Cooper和E.Rhodes在1978年提出的第一个模型被命名为CCR模型，从生产函数角度看，这一模型是用来研究具有多个输入、特别是具有多个输出的“生产部门” ①魏全龄：中国人民大学信息系教授，先后出版了数十篇关于DEA的发展及应用方面的文章，科研成果显著。
(1)数据包络分析法(DEA)概述 数据包络分析(Data Envelopment Ana lysis，简称D EA）方法是运用数学工具评价经济系统生产前沿面有效性的非参数方法，它适应用于多投入多产出的多目标决策单元的绩效评价。这种方法以相对效率为基础，根据多指标投入与多指标产出对相同类型的决策单元进行相对有效性评价。应用该方法进行绩效评价的另一个特点是，它不需要以参数形式规定生产前沿函数，并且允许生产前沿函数可以因为单位的不同而不同，不需要弄清楚各个评价决策单元的输入与输出之间的关联方式，只需要最终用极值的方法，以相对效益这个变量作为总体上的衡量标准，以决策单元(DM U)各输入输出的权重向量为变量，从最有利于决策的角度进行评价，从而避免了人为因素确定各指标的权重而使得研究结果的客观性收到影响。这种方法采用数学规划模型，对所有决策单元的输出都“一视同仁”。这些输入输出的价值设定与虚拟系数有关，有利于找出那些决策单元相对效益偏低的原因。该方法以经验数据为基础，逻辑上合理，故能够衡量个决策单元由一定量大投入产生预期的输出的能力，并且能够计算在非DEA有效的决策单元中，投入没有发挥作用的程度。最为重要的是应用该方法还有可能进一步估计某个决策单元达到相对有效时，其产出应该增加多少，输入可以减少多少等。 1978年由著名的运筹学家查恩斯（A.Charnes）,库伯（W.W.Cooper）和罗兹（E.Rhodes）首先提出数据包络分析（Data Envelopment Analysis，简称DEA）的方法，DEA有效性的评价是对已
有决策单元绩效的比较评价，属于相对评价，它常常被用来评价部门间的相对有效性（又称之为DEA有效）。他们的第一个数学模型被命名为CCR模型，又称为模型。从生产函数角度看，这一模型是用来研究具有多项输入、特别是具有多项输出的“生产部门”时衡量其“规模有效”和“技术有效”较为方便而且是卓有成效的一种方法和手段。自从该方法提出以来，就广泛应用于各个行业的有效性评价上。此后，得到不断的完善，并且在实践中的应用也越来越广泛。例如1984年R.D.Banker, A.Charnes和W.W.Cooper给出了一个被称为BCC的模型，又称之为BC2模型。另外，于1985年Charnes,Cooper 和 B.Golany, L.Seiford, J.Stutz给出了另一个模型，称为CCGSS模型，又称之为C2GS2模型，这两个模型是用来研究生产部门之间的“技术有效”相对效率。下面将介绍这两个优化模型。 ( 2 ) 数据包络模型（又称为DEA模型）描述 数据包络分析(DEA)由美国著名运筹学家A. Charnes等人在1978年以相对效率概念为基础发展起来的一种新的绩效评价方法。这种方法是以决策单元(Decision Making Unit，简称DMU)的投入、产出指标的权重系数为变量，借助于数学规划模型将决策单元投影到DEA 生产前沿面上，通过比较决策单元偏离DEA生产前沿面的程度来对被评价决策单元的相对有效性进行综合绩效评价。其基本思路是:通过对投入产出数据的综合分析，得出每个DMU综合相对效率的数量指标，确定各DMU是否为DEA有效。下面我们先描述DEA模型。
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
二、 数据包络分析(DEA)方法 数据包络分析(data envelopment analysis, DEA)是由著名运筹学家Charnes, Cooper 和Rhodes 于1978年提出的，它以相对效率概念为基础，以凸分析和线性规划为工具，计算比较具有相同类型的决策单元(Decision making unit ，DMU)之间的相对效率，依此对评价对象做出评价[1]。DEA 方法一出现，就以其独特的优势而受到众多学者的青睐，现已被应用于各个领域的绩效评价中[2],[3]。在介绍DEA 方法的原理之前，先介绍几个基本概念: 1. 决策单元 一个经济系统或一个生产过程都可以看成是一个单位(或一个部门)在一定可能围，通过投入一定数量的生产要素并产出一定数量的“产品”的活动。虽然这种活动的具体容各不相同，但其目的都是尽可能地使这一活动取得最大的“效益”。由于从“投入”到“产出”需要经过一系列决策才能实现，或者说，由于“产出”是决策的结果，所以这样的单位(或部门)被称为决策单元(DMU)。因此，可以认为，每个DMU(第i 个DMU 常记作DMU i )都表现出一定的经济意义，它的基本特点是具有一定的投入和产出，并且将投入转化成产出的过程中，努力实现自身的决策目标。 在许多情况下，我们对多个同类型的DMU 更感兴趣。所谓同类型的DMU ，是指具有以下三个特征的DMU 集合：具有相同的目标和任务；具有相同的外部环境；具有相同的投入和产出指标。 2. 生产可能集 设某个DMU 在一项经济(生产)活动中有m 项投入，写成向量形式为1(,,)T m x x x =L ；产出有s 项，写成向量形式为1(,,)T s y y y =L 。于是我们可以用(,)x y 来表示这个DMU 的整个生产活动。 定义1. 称集合{(,)|T x y y x =产出能用投入生产出来}为所有可能的生产活动构成的生产可能集。 在使用DEA 方法时，一般假设生产可能集T 满足下面四条公理: 公理1(平凡公理): (,),1,2,,j j x y T j n ∈=L 。 公理2(凸性公理): 集合T 为凸集。 如果 (,),1,2,,j j x y T j n ∈=L , 且存在 0j λ≥ 满足 1 1n j j λ==∑ 则 11(,)n n j j j j j j x y T λλ==∈∑∑。 公理3(无效性公理)：若()??,,,x y T x x y y ∈≥≤,则??(,)x y T ∈。 ， 公理4 (锥性公理): 集合T 为锥。如果(),x y T ∈那么 (,)kx ky T ∈对任意的0k >。 若生产可能集Ｔ是所有满足公理1 , 2 , 3和4的最小者，则T 有如下的唯一表示形式 ()11 ,|, ,0,1,2,,n n j j j j j j j T x y x x y y j n λλ λ==? ? =≤≥≥=??? ? ∑∑L 。 3. 技术有效与规模收益
步骤一：取材与固定： 取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。 步骤一：脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 步骤三：浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 步骤四：切片与贴片： 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。 步骤四：脱蜡 常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。 酒精用了2次先有低到高，再有高到低，这是为什么？ 步骤五：染色 HE染色过程是： ①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。 ②酸水及氨水中分色，各数秒钟。 ③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
石蜡切片制作 一、苏木精-伊红对染法 一、器材及试剂： 1.器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 3.材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100mL 磷酸氢二钠 6.5
磷酸二氢钾（钠）4g 双蒸水900mL 2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸1份 70%酒精100份 4．甘油蛋白贴片剂： 蛋白50ml 甘油50ml 水杨酸钠（防腐剂）1g 配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10mm×2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30－50min。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
一一、首先是开场白： 各位老师，上午好！我叫……，是……级……班的学生，我的论文题目是……。论文是在……导师的悉心指点下完成的，在这里我向我的导师表示深深的谢意，向各位老师不辞辛苦参加我的论文答辩表示衷心的感谢，并对四年来我有机会聆听教诲的各位老师表示由衷的敬意。下面我将本论文设计的目的和主要内容向各位老师作一汇报，恳请各位老师批评指导。 二、内容 首先，我想谈谈这个毕业论文设计的目的及意义。…… 其次，我想谈谈这篇论文的结构和主要内容。 本文分成……个部分. 第一部分是……。这部分主要论述…… 第二部分是……。这部分分析…… 第三部分是…… 三、结束语 最后，我想谈谈这篇论文和系统存在的不足。 这篇论文的写作以及修改的过程，也是我越来越认识到自己知识与经验缺乏的过程。虽然，我尽可能地收集材料，竭尽所能运用自己所学的知识进行论文写作，但论文还是存在许多不足之处，有待改进。请各位评委老师多批评指正，让我在今后的学习中学到更多。 谢谢！ 四、老师提问 答辩的准备工作学生可以从下列问题（第4~10题）中，根据自己实际，选取二三个问题，作好汇报准备，（第1~3题必选）。时间一般不超过10分钟。内容最好烂熟于心中，不看稿纸，语言简明流畅。 1．为什么选择这个课题（或题目），研究、写作它有什么学术价值或现实意义。 2．说明这个课题的历史和现状，即前人做过哪些研究，取得哪些成果，有哪些问题没有解决，自己有什么新的看法，提出并解决了哪些问题。 3．文章的基本观点和立论的基本依据。 4．学术界和社会上对某些问题的具体争论，自己的倾向性观点。 5．重要引文的具体出处。 6．本应涉及或解决但因力不从心而未接触的问题；因认为与本文中心关系不大而未写入的新见解。 7．本文提出的见解的可行性。 8．定稿交出后，自己重读审查新发现的缺陷。 9．写作毕业论文（作业）的体会。 10．本文的优缺点。总之，要作好口头表述的准备。不是宣读论文，也不是宣读写作提纲和朗读内容提要。学生答辩注意事项 1．带上自己的论文、资料和笔记本。 2．注意开场白、结束语的礼仪。 3．坦然镇定，声音要大而准确，使在场的所有人都能听到。 4．听取答辩小组成员的提问，精神要高度集中，同时，将提问的问题——记在本上。 5．对提出的问题，要在短时间内迅速做出反应，以自信而流畅的语言，肯定的语气，不慌不忙地—一回答每个问题。 6．对提出的疑问，要审慎地回答，对有把握的疑问要回答或辩解、申明理由；对拿不准的问题，可不进行辩解，而实事求是地回答，态度要谦虚。 7．回答问题要注意的几点： （1）正确、准确。正面回答问题，不转换论题，更不要答非所问。
DEA 一、同类可比 同类可比在很多情况下是社科研究的基础和前提，比如研究地区效率，西藏、新疆、青海等地与上海、北京、广东、江苏等经济发达地区情况完全不一样，在很多情况下是不可比的，如果将这些地区放在一个模型中分析，是值得商榷的。 二、DEA对异常值相当敏感 DEA对异常值相当敏感，在实际生活中，由于统计数据质量、测量误差等问题，构成数据包络曲线的那些点是非常敏感的，或者说，其它效率不是最优的点都是和数据包络曲线上最好的点相比，而这些点其实是不稳定的，在此基础上得出的处理结果也是不稳定的。 三、DEA也许只有宏观意义 即使是同一套数据，如果同时满足固定前沿和随机前沿的适用条件。采用固定前沿和随机前言，其分析结果往往是不一致的，也就是说，对于决策单元A，采用固定前沿它可能是有效的，但采用随机前 沿它可能就是无效的。那么能否说明DEA在做文字游戏也不能这么说，通常情况下，对于同一套数据采用两种不同方法处理的结果，其相关性往往很高，因此适合做宏观分析，但微观上说A有效B无效之类的要慎重。 四、DEA往往难以给出具体的政策建议 即使得出了研究结果，对于一些效率相对低下的决策单元，如何进行改进通过技术进步还是通过改善管理再进一步的建议往往难以给出。 五、效率低下的决策单元也许问题不严重 任何DEA分析，都是建立在投入产出的基础之上的，但是投入产出数据有很多是无法定量计量的。实际上，DEA分析有个隐含的假设：我们做效率分析，只能基于定量数据，那些不能定量计量的投入产出，干脆假设所有的决策单位没有差异，但这种假设一定存在吗 纯技术效率反映的是DMU 在一定( 最优规模时) 投入要素的生产效率。 规模效率反映的是实际规模与最优生产规模的差距。 一般认为：综合技术效率=纯技术效率×规模效率。
2. 取材 取材时，最好用徒手切片等方法，检查一下材料的内部结构是否适合需要，不理想时，再重新取材。 要点： （1）在符合观察要求的情况下，材料越小越好，体积尺寸一般不超过0.5cm。 （2）进行科研用的，材料样本数量要符合统计学的需要，并留有充分的余地。 （3）有特殊需要的材料，如茎尖纵切要看腋芽等结构的，要将材料作好标记——两侧削扁，切片时才有方向性。 （4）材料取下后要设法保持材料的新鲜。材料取好后要立即固定。 3. 固定（FAA者可免） FAA固定液的配置：（50-70%乙醇90ml+冰醋酸5ml+37-40%甲醛（即福尔马林）5ml），常温下至少24hr或更长（视材料厚薄、大小而定）。固定后一般的材料都可以在此液中于冰箱长期保存。 要点：①固定液的体积为材料体积的20-50倍；②固定液开始浸泡时，要对材料抽气， 5. 脱水 材料完成“冲洗”后，将材料上多余的水尽量除去，然后进入第一级脱水剂中。脱水剂的浓度分为6-7级，从低到高逐级进行，每级脱水约2小时。材料小和嫩的脱水时间可以缩短，材料大和硬（木质化程度高的）脱水的时间可以长一些，需要多总结经验。脱水过程长，尤其是在高浓度脱水剂中的时间长，材料会变脆，不利于切片，见下表。 注意：用FAA固定的材料，因不经“冲洗”，可以直接从2级脱水剂开始脱水。 注意：脱水剂用量不少于材料体积的5倍。叔丁醇脱水所要求的温度，以叔丁醇不凝固 材料进入无水的脱水剂中后，若脱水剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到 7. 浸蜡（透蜡） 材料从叔丁醇脱水后进入装有适量融化的叔丁醇（恒温箱最好从36-40度缓慢升到56-60℃，透蜡的效果才好）的蜡管中，在蜡管中逐渐多次加入碎蜡（熔点48-50℃），直至
组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程 一取材和固定 取材后经固定24小时（4%PA灌注取材的后固定6~8小时）以后，流水冲洗24小时，置于70%~80%乙醇中，可长期保存。 二脱水和包埋 1、95%ALC（二道）Ⅰ2~4h Ⅱ2h 2、无水ALC（二道）Ⅰ1.5h Ⅱ1h 3、二甲苯+无水乙醇（1：1）20min 4、二甲苯（二道）Ⅰ10min （注：脱水透明esp.透明时间可适当延长）Ⅱ10min 5、浸软蜡（50~52℃）（二道）Ⅰ30min Ⅱ1h 6、浸硬蜡（58~60℃）（二道）Ⅰ30min Ⅱ30min 7、包埋：注意温度、切面。 三切片 修、切、展、贴、烤（烤片55~60℃）3~10h 四HE染色 1、二甲苯脱蜡五道，每道5~10分钟 2、无水乙醇Ⅰ5min Ⅱ5min 3、95%乙醇Ⅰ5min Ⅱ5mn 4、80%乙醇5min 5、70%乙醇5min 6、D．W．3~5min 7、Harris苏木素液5min（冬天可适当延长，eg.20min） 8、水洗 9、0.5%盐酸酒精分色3~10seconds，镜下观察 10、水洗蓝化15~30min（注意换水） 11、70%乙醇5min 12、80%乙醇5min 13、伊红液（95%乙醇溶液）3~30seconds 14、95%乙醇Ⅰ1min Ⅱ5min 15、无水乙醇Ⅰ5min Ⅱ5min 16、二甲苯+乙醇（1：1）5min 17、二甲苯Ⅰ5min Ⅱ5min Ⅲ5min 18、中性树胶封片。
HE染色注意事项： 1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化 而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 2.切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞 核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。 3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底， 应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。 5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。 6.最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积， 如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。
HE染色封固时出现的问题及解决方法 支喜兰1 谭德银2 (1西安解放军323医院病理科 710054 2陕西省高级人民法院司法技术室病理组)【中图分类号】 R361.2 【文献标识码】 B 【文章编号】1007-8096(2000)04-0303-01 要获得一张满意的HE切片,除与取材、切片、染色关系密切外,封固也是很重要的一个步骤。我们在观察切片中,发现有许多与封固有直接关系的质量问题,影响病理诊断。作者根据多年的制片经验,就封固中出现的问题进行总结: 1 类似色素样颗粒(俗称空气色素) 即在封固干燥后,切片中出现类似色素样颗粒,散在或呈片状,圆形或不规则形,易被误认为黑色素或甲醛色素沉着。但这种类似色素样的物质分布无规律,可在任何组织切片中出现。其产生的原因是切片染色后,封固时切片中的二甲苯已完全挥发,中性树胶封固剂不能完全封固而形成的组织片干燥的空气气泡或腔隙。 1.1 导致气泡或腔隙产生的诱因 1.1.1 操作者为了减少二甲苯的吸收,习惯于将切片从二甲苯中取出,待二甲苯挥发后再封固。或切片很多,封固开始并未出现此情况,待二甲苯基本挥发或完全挥发,组织干燥后封固可出现。 1.1.2 树胶封固剂过稀,封固当时并不出现,当封固干燥或待二甲苯挥发后可出现上述情况。 1.1.3 树胶封固剂粘稠时,滴加的封固剂不能完全覆盖切片所致。 1.2 解决方法 1.2.1 封固时,当切片中二甲苯挥发后,应重新放入到二甲苯中透明。 1.2.2 调整树胶封固剂的浓度,不能过于粘稠或过稀。以细玻璃棒蘸树胶,拿起成滴状,滴速2～3滴/sec适中。 2 形成气泡 气泡是封固切片中最常见的问题,直接影响病理观察。 2.1 形成气泡的原因2.1.1 切片厚薄不均,主要是组织纤维成分多,切片困难,或切片刀不锋利,切片形成搓板样结构,切片不平整所致。 2.1.2 捞片水温低,切片未完全展开,或在捞片过程中,水底产生气泡漂浮于组织片上而形成。 2.1.3 树胶封固剂过稀或过于粘稠均可引起。 2.1.4 封固方法不当,在封固时,有些操作者习惯于用手拿着盖玻片,平放于滴了树胶的组织切片上所致。 2.2 解决方法 2.2.1 封固时用镊子夹起盖玻片,先一侧放置于滴有树胶的组织切片上,然后缓慢放下将空气完全排除。 2.2.2 调整树胶封固剂的浓度及水的温度。 2.2.3 根据组织的取材适当缩短或延长组织脱水时间。 3 切片中出现云雾现象 有时在切片中出现模糊一片的云雾,组织结构不清,严重影响观察。其产生原因是染色封固时,切片内有水分所致。 3.1 形成的原因 3.1.1 组织取材太厚,脱水不净,导致切片厚薄不均,影响封固质量。 3.1.2 组织固定液及脱水剂时间过长,未及时更换,影响组织脱水。 3.1.3 切片染色时,封固前脱水不净,致使切片不能透明,封固后出现云雾现象。 3.2 解决方法 组织取材厚度适中,及时更换脱水机的各种试剂和各种染色试剂。尤其是染色过程中,切片进入二甲苯透明前一定要脱水彻底,即可避免产生切片的质量问题。 以上方法适用于所有需要封固的组织。 (收稿1999-10-28 修回1999-12-13) 常规石蜡切片中浸蜡包埋方法的改进 弯雪燕 景春果 张晓辉 (山西省闻喜县东镇541医院 043801) 【中图分类号】 R361.2 【文献标识码】 B 【文章编号】1007-8096(2000)04-0303-02 病理技术的常规工作是制片。其程序一般是对取材组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封固。每一操作环节的好坏,都会影响制片质量。其中,浸蜡、包埋则是制片过程中手工操作较复杂而又重要的一个环节。目前大部分医院在病理制片过程中,尚未能完全取代手工操作。为确保制片质量,提高效率,避免差错,我们对多年沿用的浸蜡、包埋方法和步骤进行了改进,取得了满意的效果,现介绍如下。 1 材料与方法 1.1 材料 单孔或多孔恒温水浴箱1台,自制浸蜡包埋框、小镊子和其他常用包埋用具。 ? 3 3 ? 诊断病理学杂志2000年12月第7卷第4期
DEA（Data Envelopment Analysis）数据包络分析 目录 一、DEA的起源与发展（参考网络等相关文献） 二、基本概念 1.决策单元（Decision Making Unit，DMU）.......................................................... 2.生产可能集（Production Possibility Set，PPS） ................................................ 3.生产前沿面（Production Frontier）........................................................................ 4.效率（Efficiency） ........................................................................................................ 三、模型 模型....................................................................................................................................... 模型....................................................................................................................................... 模型....................................................................................................................................... 模型....................................................................................................................................... 5.加性模型(additive model，简称ADD).................................................................... 6.基于松弛变量的模型(Slacks-based.................................. M easure，简称SBM) 7.其他模型........................................................................................................................... 四、指标选取 五、DEA的步骤（参考于网络） 六、优缺点（参考一篇博客） 七、非期望产出 1.非期望产出的处理方法：.............................................................................................. 2.非期望产出的性质： ......................................................................................................