什么是热原

什么是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，各指哪些主要细菌?


自然界存在多种多样病菌，如何将这些病菌加以鉴别、分类，并选择有效药物进行治疗这是很重要的问题。革兰氏染色法，能够把细菌分为两大类：采用这种染色方法，是先用龙胆紫来染病菌，所有细菌都染成了紫色，然后再涂以碘液，来加强染料与菌体的结合，再用95％的酒精来脱色20～30秒钟，有些细菌不被脱色，仍保留紫色，有些细菌被脱色变成无色，最后再用复红复染1分钟，结果已被脱色的细菌被染成红色，未脱色的细菌仍然保持紫色，不再着色，这样，凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌；染成红色的称为革兰氏阴性菌。革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感；而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感，而对链霉素、氯霉素等敏感。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。


什么是热原

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。 热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5×104～5×105，分子量越大致热作用也越强。

注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。该现象称为“热原反应”。
热原没有多少这一概念， 《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采

用鲎试剂法。
1、热原检查法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
2．细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法。

热原是微生物代谢产生的内毒素，主要由细菌产生，它存在于细菌的细胞膜和固体膜之间，其中革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌和病毒也能产生热源。
特性有：（１）耐热性（２）滤过性（３）吸附性（４）水溶性（５）不挥发性（６）不耐强酸、强碱、强氧化剂和超声波。
除去的方法有（１）高温法（２）酸碱法（３）吸附法（４）蒸馏法（５）反渗透法（６）超滤法（７）其他：某些特殊的离子交换法和凝胶滤过法也可用于除去热源。

热原和细菌内毒素 ?
　
一、热原(progon)
医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。
为提高药品质量和用药安全，人们对热原进行了广泛的研究，直到1923年Seibert提出了用家兔检测热原的方法。在1942年美国药典首先将家兔热原检查项收入药典成为法定方法，中国药典1953年版

开始收载该方法，随后的世界各国药典都以动物热原检查法作为药品质量监测的
方法之一。
家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。
但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。这种热原检查法，只局限于某种药物进入体内（血循环）是否能引起体温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药工业发展的需要。其缺点：
①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。
②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。
③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断。
④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要280元/次，而鲎试剂仅28元/次。
综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质量监控一场大革命。
什么是热原？目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：它是指细菌内毒素的脂多糖。
欧洲药典委员会副主席J.Van Noordwijk提出：“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。
二、细菌内毒素（Endotoxin）
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
<一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、

位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌体热原的特异性。
<二>核心多糖：核心多糖的变异性较
小，位于类脂A和0—特异性链（内层）之间，在结构上分为内核心和外核心。外核心含有数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的酮糖（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖KDO）。这部分结构对不同菌株的LPS基本相似，而且KDO是以不耐酸的酮糖链与类脂A的氨基葡萄糖连接，是构成内毒素脂多糖的核心部分。
<三>类脂A：位于LPS分子结构的外层，是由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸（10—18C）组成，故称之为糖磷脂，也是细菌外膜的一种，形成单体聚合物。具有疏水性（强）和亲水性（弱）的双相性。但是，类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。（附图2）
由于类脂A有4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素LPS是极为不稳定的。这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。 ?
三、内毒素的生物活性与疾病的相关性
据文献报道，在很早期（约19世纪末）的意大利学者Centanne通过菌属自溶的方法，从革兰氏阴性杆菌中提取出一种类似毒素的物质，因为这种物质对动物体产生致热活性的同时，亦产生出一种病理学病性反应，而被命名为致热毒素（Pyrotoxina）。同时由德国的Buchner也从多种细菌中提取到相似的致热毒素，并证实了这种毒素在导致白细胞数目的改变同时，具有增强机体对细菌感染时的免疫能力。因此建立了“发热疗法”。
在美国纽约的临床医师，William B·Coley用加热法杀死录杆菌和化脓性链球菌，将上清滤液用于各种恶性肿瘤（特别是肉瘤）的治疗，取得较好的疗效。他将这种细菌上清液命名为Coley氏毒素。此后murrayJ.Shear 证实Coley氏毒素中具有抗肿瘤作用的物质为内毒素。
直到1933年Boivin等学者在研究鼠伤寒杆菌的致病机理时，从鼠伤寒杆菌中提取出内毒素。在50年代以后，对内毒素的化学成分和化学结构的研究得到迅速发展。经过大量实验表明，内毒素具有极强的生物学活性，特别是革兰氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时，可导致动物体发

生内毒素休克和死亡。
内毒素的致病机理，主要是由于革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌、沙门氏杆菌、伤寒杆菌，布氏杆菌、变形杆菌金黄色葡萄球菌等）和其它微生物
（病毒、立克次氏体、衣原体螺旋体等）感染时，这类菌属随病灶渗液进入血液循环，并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖，这类菌属在体内死亡和解体后，才稀放出大量的细菌内毒素脂多糖（LPS），据初步实验表明，当机体内毒素浓度國值 > 0.005ng/ml时,可诱生内源性热原质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和β2—干扰素等。这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热，细菌内毒素直接或间接作用于肝脏和胰腺时，可使肝细胞损伤，使糖原异生酶（如葡萄糖—6—6磷酸酶、糖原合成酶）的活性降低，抑制糖原的异生和分解。同时内毒素作用于胰腺导致胰腺功能障碍，并形成胰岛素抵抗，造成血糖升高致使并发心肌炎和心肌肿大的系列高血糖症状。所以，革兰氏阴性菌属感染或在病灶中的细菌进入体液细胞繁殖，当其死亡或解体后产生的内毒素，可多次进入血液，引起反复发作，其病理变化极为广泛，几乎所有的器官和组织都可被侵犯，而引起各器官的功能障碍。其中以网状内皮系统最常见，淋巴、脾、肝、肾、骨髓中均有上皮细胞增生，形成肉芽肿，以肝脏有肉芽肿外，还可发生冲血、水肿和肝细胞坏死，最终导致肝硬化的发生。其它器官亦有相似的毒性反应。
所以，加强对药品和人体液中的细菌内毒素监测，对确保人体健康具有十分重要的意义。湛江博康海洋生物有限公司研制的定量鲎试剂和天津大学无线电厂研制的细菌内毒素检测定系统，为广大医药学科学工作者提供了方便。
细菌内毒素的概念
细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A
? 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。
? 细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二

分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：
细胞壁结构 革蓝氏阳
性菌 革蓝氏阴性菌 厚度 厚，15—50 薄，10—15 肽聚糖含量 多，占胞壁干重50—80% 少，占胞壁干重10%左右 脂类含量 少，约1—4% 多，约11—22% 磷壁酸 有 无 外膜 无 有 脂蛋白 无 有 脂多糖 无 有 ? 细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。
（1）脂蛋白（lipoprotein） 由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。
（2）外膜（outer membrane） 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。
　一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
　

细菌内毒素工作标准品振荡15

分钟的理论依据

细菌内毒素（Endotoxin），是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构，它在细菌生长、繁殖过程中，并不分泌到介质中，也不能从外壁层上自然脱落，它不是细菌的代谢产物，当细菌死亡解体后，才显示出一系列的内毒素生
物活性。
细菌内毒素的化学结构是脂多糖和微量蛋白的复合物，脂多糖由三部分组成：O-特异性链、核心多糖和类脂A三部分组成。
O-特异性链：向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性。
核心多糖：分为内核心及外核心，外核心由数种单糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的KDO（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖）。KDO以耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。
类脂A：位于最外层，是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位，通过焦磷酸键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。游离的类脂A可自身凝集成高分子的复合物，其分子量大小不等。游离的类脂A含有疏水性的中心及亲水性的边缘，是一种双相分子。
内毒素标准品是从大肠杆菌E.ColiO111B4菌株的细胞壁提取精制而成。细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，内毒素的疏水性中心相互结合形成大分子复合体，而难溶于水。《细菌内毒素检查法》要求“将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解后在旋涡混合器上混匀15分钟，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。” 在旋涡混合器上混匀15分钟的目的是借助外力破坏这种分子复合体，使内毒素均匀的分布在水溶液中，保证试验结果的真实准确。如果没有旋涡混合器或混匀时间不够，均会导致细菌内毒素分子复合体，这种溶质不能分散在溶媒中，而影响试验结果的准确性。
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血液细菌内毒素定量分析指南

湛江博康海洋生物有限公司——莫水晶
　
??? 近10多年来，科学家们对细菌内毒素（Endotoxin,ET）的研究已步至一个高峰期。尤其在近年的许多研究报告表明，这种ET物质对人体健康的危害性很大，可导致内脏（肝、胰腺、肾、肺、心脏等）重要器官发生功能障碍或功能衰竭。而这种临床症状的发生、发展或轻重与血浆中的ET水平高低相符合。并且有文献报道，腹腔注射脂多糖(LPS)小鼠血浆TNFa 明显升高，同时肝脏肿瘤坏死因子(TNFa Mrna)表达升高明显。在不同区域生活的人群都有可能因机体组织创伤、烧伤感染和消化系（肠道）炎症，使E

T随渗液进入血液循环。当肌组织病灶继发感染时，因细菌的代谢（或用药）死亡又裂解稀放出大量LPS而导致内毒素血症（ETM）的形成。所以，对ETM不及时发现或被延误治疗，便危及身体的健康… …
为了尽早地发现和监测人体液中ET水平的动态变化，对辅助疾病的诊断和
指导临床合理使用药物，提高治疗治愈率具有重要意义。我们研制的"细菌内毒素定量分析--鲎试剂盒"已成为医生的好帮手，也是制药企业和药品检验机构用于药品质量监控，避免ET进入体液循环，确保人民的身体健康具有重要的科学研究价值。

一、细菌内毒素定量分析鲎试剂盒
1、组成：定量法鲎试剂；细菌内毒素工作标准品；细菌内毒素检查用水；血液内毒素提取剂Ⅰ号；血液内毒素提取剂Ⅱ号。
2、用途：用于临床病人血液内毒素的提取、定量分析。
二、使用指南
1、试验材料及用具
1）细菌内毒素定量测定仪? 天津市天大天发科技有限公司BET-24A。
2）电热干烤箱 除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
3）旋涡混合器
4）鲎试剂，湛江博康海洋生物有限公司生产 （88）卫药准字SJ-04号。
5）血液内毒素提取剂? 湛江博康海洋生物有限公司生产。 ）
6）细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
7）细菌内毒素检查用水（BET水）水。
8）实验用具 移液管（或刻度吸管、定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。
9）试剂 75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
注：细菌内毒素定量分析鲎试剂盒包括以上材料中的4、5、6和7。
2、?实验操作


　血液内毒素检测操作流程图

1）Ⅰ号管供试品制做：
在样品采集管外壁注明病人姓名或编号，然后分别向管内加入Ⅰ号体液处理液和待检全血混匀，并密封管口移置离心机离心，制成二倍稀释液备用。
　2）Ⅱ号管供试品制做：
分别吸取Ⅰ号管供试品上清液和吸取Ⅱ号体液处理液注入Ⅱ号管相混匀，并移置恒温水浴中加热，加热完毕用封口膜密封管口离心，制成四倍稀释液备用。
　3）Ⅲ号管供试品制做：
根据Ⅰ号管样品例数，取稀释管若干支，并在试管外壁注明样品供给者姓名与Ⅱ号管相对应。然后分别吸取细菌内毒素检查用水，吸取Ⅱ号管的上清液注入Ⅲ号管内，并移置旋涡混合器上振荡30秒，制成八倍稀

释液备用。
　4）鲎试剂溶液的制备：
??? 从鲎试剂盒中取出鲎试剂、BET检查用水，分别消毒安瓶曲颈部后启开，并按鲎试剂标示量吸取BET检查用水注入鲎试剂瓶内溶解，待浸润溶解后混匀备用。
? 5）实验加样：
上述准备工作完毕，取定量分析仪专用试管（注明编号与样品供给者相对应），然后分别将鲎试剂溶液和
Ⅲ号管中的供试品分装到专用试管中，密封试管口并移置BET检测系统自动分析即可。
三、注意事项：
1、 本实验的全过程要求无菌操作。
2、 使用器具要求除菌除热原。厂家提供的专用器具，必要时放在干热恒温箱干烤（250℃）60分钟，待冷却后使用。
3、 加入Ⅰ号管的供试品或血液，在60分钟内不能及时处理时，应放在低温冰箱中（0℃以下）保存，但时间不宜超出18小时。
4、 Ⅱ号管供试品在加热时，不完全密封试管口，应在洁净室内操作避免污染。离心后得到的上清液在低温（0℃以下）条件下，在三天内可做复检之用。
5、 本实验尽可能宿短操作时间，尤其鲎试剂溶解后应在10分钟内加样完毕，避免误差。
6、 本实验需要做标准曲线时，应选用中国药品生物制品检定所提供的细菌内毒素标准品。
　
关于细菌内毒素检查法中几个问题的探索
（莫水晶? 董光宴? 湛江博康海洋生物有限公司）

本文是通过与客户的交流以及客户咨询的相关问题，进行一次归纳总结。通过工作中出现的问题有必要对以下三种情况进行交流，以加强对细菌内毒素检查法的正确理解，同时纠正一些错误的观念。
·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？
·如何正确认识器皿洗涤的重要性？
·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？
许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
图1?? 鲎试剂与内毒素的反应机理

1、PH值：鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.8-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。
2、器

皿： 内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。
3、金属阳离子： 离子对细菌内毒素测定结果影响
较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。
4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应，同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。
一、器皿洗涤的重要性
《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定：“? 将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥（禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗）后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
二、抗干扰能力和鲎试剂的特异性
有客户在做白蛋白的干扰试验时使用两个厂家的鲎试剂，干扰试验结果其中一个厂家的鲎试剂需要稀释4倍而另一个厂家的鲎试剂需要稀释8倍才能排除干扰。据此向我们咨询是否稀释倍数小的鲎试剂抗干扰能力强？而稀释倍数大的鲎试剂抗干扰能力就差？我们认为对一些粘度较大的产品白蛋白、医用透明质酸钠，建议使用8倍或16倍稀释来建立内毒素常规检查规程（SOP），因为鲎试验是一种复杂的

酶反应，任何一种药品、生物制品的浓度或粘度对试验结果皆有影响，是抑制还是增强反应仍需做具体的分析。单纯以干扰试验的稀释倍数来判断鲎试剂的质量是片面的。
如何判断鲎试剂抗干扰能力，必须从几个方面进行分析：
1、? 鲎试剂灵敏度的差异? 不同厂家的鲎试剂虽然标示值（λ）相同，但仍然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，若有的产品真实灵敏度可能是0.75EU/ml或1
.0EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂可能是0.35EU/ml或0.25EU/ml时，按0.5-2λ误差标准都是合格产品，但对同一检品虽然在相同的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。
2、? 鲎试剂与内毒素脂多糖反应的差异? 在正常的药品、生物制品生产时，因不同时期的原料来源和水源的因素，都可能导致半成品或成品污染的菌株不同，而导致内毒素脂多糖物质与鲎试剂反应的活性不同。有的鲎试剂对革兰氏阴性菌或各种微生物产生的内毒素脂多糖均有敏感性，有的鲎试剂可能只对革兰氏阴性菌产生的内毒素敏感而对其它微生物产生的内毒素脂多糖不敏感，故同一检品虽然在相同稀释倍数下，两个厂家的鲎试剂对内毒素的检出能力亦不同。
3、? PH值的影响? 鲎试剂生产用水质量和BET水PH值的差异，可影响鲎试剂对内毒素脂多糖反应敏感性。有的鲎试剂生产公司（或厂）的原料用水不是多效蒸馏水，而是利用一般纯化水，而且PH值都在6.0以下。而鲎试剂的酶反应最佳PH值为6.8-8.0，所以一直以来美国、英国药典和日本药局方规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
近几年来，鲎试剂特异性差所造成的后果比较隐蔽，不易被使用者所发现，但是这种危害性往往以人的生命为代价所表现出来。《法律在线》报道：２０００年５月４日晚１０时，８岁女童何某某因扁桃体发炎，被父亲带到河南省某中心医院就诊。医院为她所用的药物为青霉素，所用液体是该医院自己生产的２５０ｍｌ袋装生理盐水（批号20000427）。输液约２０分钟后，何某某开始出现胸闷、全身颤抖等症状。６小时后，经抢救无效死亡。２０００年５月８日，该医院将何一一使用的该院自制氯化钠注射液样品送往省质量检验部门检验，检验结果是：细菌内毒素不符合规定。经医疗事故技术鉴定委员会鉴定，“患儿何某某因输入细菌内毒素超标的液体引起输液反应，输液反应导致主要脏器缺血缺氧，功能衰竭死亡”（豫医鉴〖2001〗10号），这是一起严重的由于内毒素漏检所造成的悲剧。用我厂生产的海浪牌鲎试剂来检验该批生理盐水，同

样检测出该药品注射液内毒素不合格。同样的事故还发生在吉林省公主岭地区某制药厂和河北邯郸某制药厂，他们分别使用某企业的鲎试剂都没有检验出。产品中的内毒素而造成产品漏检，造成临床大面积严重的输液反应，这种情况都是鲎试剂特异性差的一种表现。对内毒素不合格的药品，便威胁到人民群众的生命安全。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品
内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。目前我厂研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。如下图：
图2? 内毒素和β-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线

鲎试剂的特异性（专属性）差的另一种表现，是将其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
例如在山东省青州某制药厂，该药厂生产5%葡萄糖注射液（规格：100ml? 产品批号：0307040101）内毒素限量是合格的，但是用某公司的鲎试剂检验却是阳性。该产品经我厂（湛江海洋生物制品厂）通过凝胶法检验是合格的。我们对这种现象进行研究分析，认为应从鲎试剂的特异性方面考察。我们通过定量检测，对这一批药品的反应数据、反应曲线和反应速率曲线进行研究分析，认为该批药品内毒素检测合格，验证了凝胶法结论的正确性，为该制药厂挽回经济损失。
通过以上几个方面的分析，干扰试验结果时稀释几倍能排除干扰并不重要，而对内毒素的检出能力（鲎试剂的特异性）才是最关键的，也是判定鲎试剂质量的唯一标准。
三、污染的全面理解
通过以上几个方面的分析，我们应认识到内毒素的污染只是其中之一，污染物的种类很多，影响情况也很复杂，比如样品中的药品及其它成分影响了样品的PH值、鲎试剂的特异性、内毒素的活性等。这些污染物可能对鲎试剂与内毒素反应产生增强和抑制作用，其中以抑制作用为主。试验环境（检验室空气洁净度、温度和湿度等）和操作程序都可能引起试验结果的差异，应引起大家的注意。
鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进展

??? 鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物与微量（pg/ml级）细菌(主要是革兰氏阴性细菌,G-)的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术。因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点，自从一九六四年美国学者L

evin 和 Bang发现此法以来[1]，鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中。
鲎法大致可分为凝胶法、比浊法色原基质法、以及免疫法等。本文依据文献报道，总结了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展，以供试验者参考。 ?
1 试验条件与操作
培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]。
1.? 1 时间
鲎试剂在液态时极不稳
定, 室温放置太久会影响反应灵敏度，故加样结束后,应立即放入恒温水浴中。 [3]延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。[4]
有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律，即５分钟时混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内。
在显色法中灵敏度与时间有关，故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间[2][6][7]。
1．2 温度
凝胶试验规定的孵化温度为37℃。但在夏季高温季节，如果同时作几个样，阳性对照不成立的现象时有发生，故应改为冰浴。[3]
郭录平[4]通过实验证明，保温在25-41℃内，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。
另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]。
1.3 pH值
高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响，结果发现：样品 pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时，实验受到抑制，平均回收率≤56.8%。最后得出结论：使用TAL 时，供试品 pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用 LAL 时，pH 应预调在6.2±0.1或 6.7-7.8为好。
也有人认为[4][7][9] 鲎试验的 pH 应为6.5-8.5，以7.0-7.5为佳。必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 调节 pH 值[2]。
1．4 试验器具
内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度吸管。因为注射器刻度不准，而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]。
普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9]，用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适。一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低，管对测定的结果影
响愈大。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果。
1．5 操作程序
有实验者发现[3][11]：操作次序也影响试验结果。应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液，最后按供试品管、阳性对照管、

阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂。未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象。
1.6 处理作用
Pedersen MR和Hansen EW[12] 将内毒素溶液用玻璃试管干燥，在氧丙环（Ethylene Oxide，EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后，内毒素的LAL活性减少至百分之三十。将多粘菌素B（Polymyxin B，PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五。内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十，进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九。EO对内毒素的反应会减少其LAL活性，也会减少其热源反应，增加与PB的亲和性
。
Bamba T[13] 等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（Smooth gram-negative bacteria ，S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果，观察到不同种细菌的抗热性显著地不同，减弱率与浓度有关。低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下。粗糙型（Rough strains，R-form) 细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似。平滑型，尤其是Rc突变体（Rc mutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+，Ca2+等二价阳离子显著影响。
FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差。Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题。然而，因为溶液在瓶中没有充分震荡，溶剂与橡胶塞接触，约有百分之二十到四十的内毒素丢失。解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中，并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤。
姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现，溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4 ℃ 放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱，可冷冻保藏20天，但反复冻融活性会逐渐降低。
2 供试品
2.1 多糖[2]
我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性，而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-β-D-葡聚糖）（curdlan，1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性，因为LAL中含G因子[16]。
据报道[17][18]，能激活鲎试剂旁路（G 途径）的物质主要是（1-3）-β-D-葡聚糖（包括（1-4）-β-D-葡聚糖和（1-6）-β-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-Reaction Material）两类，如真菌多糖（Fugal polysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾，血液透析仪）洗涤液等。实验室常用的酒精，棉球等也含有较多的（1-3）-β-D-葡聚糖。低于一定浓度的（1-3）-β-D-葡聚糖或LAL-RM不
足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。我国已生产

出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液（Antienhancement Solution）。
Cooper JF 和 Weary ME[19] 等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异，所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾。动态LAL方法（Kinetic LAL methods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用。葡聚糖在非口服制剂中不常见，只限于被微生物或纤维素物质污染的产品。并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法。
另外，丹麦科学家[20]发现，细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B （dimethyl sulfoxide and p
olymyxin B）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonal antibody against Limulus factor C）所抑制。他们还发现β-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍，而不影响内毒素的激活途径。人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的，而非内毒素途径。
八十年代后，日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂，如：Endospecy，以及只与（1-3）-β-葡聚糖反应的鲎试剂：SLP试剂及Gluspecy。[21]
2.2蛋白
2.2.1阳离子蛋白
几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白（Cationic proteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G （lysozyme, ribonuclease A, and human IgG）能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定细菌内毒素。试验证明，苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理（phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment）等方法都不能够解除此作用。胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, or pronase）等只能回收10%-20%的内毒素，然而如在测定之前，用蛋白酶 K （proteinase K）来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。进一步研究还发现，多聚-L-赖氨酸及多聚二甲亚胺（poly-L-lysine and poly ethyleneimine）作为细菌内毒素选择性配位基能够将细菌内毒素从所研究的蛋白上脱去，从而有利于进一步的测定。
2.2.2 血蛋白
Roth R与IKaca W 证明[23][24]，血红蛋白能与LPS结合，这种结合会改变LPS的一些物理特性，从而增强了LPS的生物学活性及LPS与LAL的作用。
据报道[2][17][18]：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子。有学者的研究表明用一般鲎试剂测定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率,而后者与兔热源检查结果基本一致。
2.2.3 免疫蛋白
Baek L[25] 等人通过免疫电泳方法表明，假单孢绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黄色葡萄球菌（Staphylococc

us aureus）细胞膜的一些可溶性抗原（Soluble antigens）与LAL能够反应。
有的学者[26]用鼠单克隆免疫球蛋白M抗体E5（ mouse monoclonal IgM antibody E5）来测定其抗不同菌种LPS的活性。结果证明，由于细菌种类不同，经E5处理后，LPS活性减弱的程度也不同，一般地0.2mg/ml以上的E5能减少几乎所有被研究菌种的LPS对鲎试剂的活性。
另据报道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途径。
2.3 离子
离子对细菌内毒素测定结果影响较大[9]，因为一方面离子强度较大会引起内毒素的聚集，加重低浓度内毒素不易散的问题；另一方面LAL中的C因子必须在二
价阳离子的参与下才能被激活形成活化C因子。
Guyomard S; Darbord JC [13][27]介绍了用五种内毒素，即2株大肠杆菌、1株沙门氏杆菌、1株灵杆菌、1株霍乱弧菌（Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)与FDA推荐的内毒素EC5作LAL实验的重现性。发现添加Mg2+增强了LAL显色反应（160mmol/l最佳），而Ca2+浓度大于5mmol/l时抑制了此反应，0.3mmol/l的Zn2+会强烈地抑制反应。由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而减弱（160mmol/l）。当在反应的第一步（细菌内毒素与LAL孵育）时添加这些二价阳离子会改变LAL显色反应，而在反应的第二步，即加入生色底物（chromogenic substrate）时这些阳离子则不会改变LAL生色反应。
据报道[7]当鲎血被抽出后，用3% NaCl 充分稀释(1:500)能阻止变形细胞凝集，即使有内毒素存在也不凝聚，但当有钙或镁离子存在时则很快凝固，由此可知钙、镁离子对于鲎试验的作用，但是过量的钙离子又会影响凝聚作用的完成。因此,当溶液中有EDTA等络合剂或肝素钠、柠檬酸钠等抗凝剂存在时，Ca2+，Mg2+离子将失去作用[2][9]，从而影响本法的测定。
有人在研究内毒素的电催化特性对于鲎试验的影响时，证明钍与铁对内毒素的活性有强烈的影响，但由于其在鲎血中的含量甚微，故并不干扰实际测定。[7]
生理盐水中的 NaCl 对显色反应有干扰[28]，但关键在于稀释样品和标准品须用相同的无热源水或无热源生理盐水。
相反,许多药物中含有的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性，可通过加入0.5mg/ml的氯化钙溶液，或22mg/ml的氯化镁溶液来排除干扰。[29]
2.4 有机盐
核酸钠（Sodium Nucleinate，NN）像细菌内毒素的LPS一样能够被LAL试验所检测，有学者[30]还比较了含有NN热原标准品的兔法与LAL法的测定结果。
2.5 透析液
Berland Y[31]总结了在文献报导中有关透析液细菌性污染的资料。透析液中的G-小分子热源物质能够透过正

常的透析膜。纤维性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通过内毒素。聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能够吸收内毒素。所以，鲎试验不能够检出污染透析液的所有细菌性物质。
Laude-Sharp M[32]等人的实验证明:在体内具有生物活性的多种LPS能够通过透析膜，尽管在血液中没有测到LAL反应物质，所以LAL法作为测定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的标准不够充分。
日本学者 Yoshioka T [33]等人通过使用无G因子的凝集系统证明了从铜氨人造纤维膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反应物质不是内毒素，而是通过另一种
途径使LAL凝集，此物质在循环中滞留相当长的时间。并发现在急性及慢性血液透析中，此反应物质平均水平为100-400pg/ml。
仲卫华[34]等的实验证明，血液透析液有一定的干扰作用，但可通过稀释法消除。
以上研究结果说明用鲎试剂来测定透析液中的内毒素的方法还有待于进一步的考察。
2.6 中药成分[21]
许多种中草药成分能够干扰LAL试验[35]，特别是清热解毒类药物[29]。
2.7 生化药品[21]
姜素云[2][36]等证明，氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用。
孔祥文[28]通过实验证明，基因工程蛋白类药物生产中常用的 2-巯基乙醇、2-巯疏糖醇和还原性谷胱甘肽对鲎试验呈色反应有干扰作用，当稀释到5.0μmol/l时,抑制作用近乎消除。
2.8 其它物质
另据报道[2][9][21][29]：人血中的多种凝血因子、可使蛋白质变性物质（乙醇、苯酚）或灭活的物质（如氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂、专一失活剂等）、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂、右旋糖酐-40、抗凝血剂如柠檬酸及肝磷脂等等，都可干扰鲎试剂形成凝胶。
3鲎试剂与标准品
?3．1 鲎试剂内源性因子
?Roth RI与Tobias PS[37]在 研究含有能被细菌内毒素激发引起凝集反应的内毒素敏感因子的鲎试剂色析组份（chromatographic fraction of Limulus lysate）时,用了一种光复活性的、易解离的、放射性同位素标记（photoreactive, cleavable, radiolabeled）的沙门氏菌LPS衍生物（derivative of Salmonella minnesota LPS），LPS-（P-叠氮水杨酰胺）-1，3-二硫丙胺（LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ，LPS-ASD），来确定LPS-结合蛋白。结果证明LAL组分中较大的82-kDa蛋白是LPS结合蛋白，充当凝集反应的负调节因子，LAL组分中较小的50-kDa蛋白是对LPS敏感的凝集蛋白的选择物。
日本科学家[38][39][40]发现在日本马蹄蟹（horseshoe crab (Tachypleus tridentatus)）血细胞中存在鲎胞间凝集抑制物（Limulus

Intracellular Coagulation Inhibitor，LICI）1型、2型、及3型。LICI-1专一性抑制对鲎LPS-敏感的丝氨酸蛋白酶（limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease），C因子（K1=2.5×106 M-1，S-1）；而LICI-2显著抑制鲎凝集酶（limulus clotting enzyme）（K1=4.3×105 M-1，S-1）；LICI-3强烈抑制对（1，3）-β-D葡聚糖敏感的丝氨酸蛋白酶（(1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease），G因子（K1=3.9×105 M-1，S-1）。因此，鲎血淋巴凝结过程至少由三个内源性因子所调节：LICI-1 是Mr=48，000，有394个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42，000，有386个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53，000，有392个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反
应位点与LICI-1相同。
?3．2 试剂质量
不同批号的鲎试剂标示值相同，但试验结果不尽相同，尤其是近效者的灵敏度有明显下降的趋势。所以在更换批号或者用近效期鲎试剂的时候，应对灵敏度进行复核。以确定本批鲎试剂的实际灵敏度。[3]
有的同志发现[11]：使用不同厂家生产的溶解水来溶解鲎试剂，结果会导致假阳性的出现，而使用同厂生产的鲎试剂及溶解水均符合规定。
另外，还有试验者发现[41][42][43]：不同厂家与批号的细菌内毒素工作标准品的灵敏度有很大的差别,有的竟低于50% 以下。支与支之间差异竟达50%。[10]
高丽云[44]在实验中发现如放置半年后重新标定, LAL灵敏度会下降,细菌内毒素工作标准品的效价低于标示量。这可能与细菌内毒素的处方、pH值、冷冻干燥过程以及冻干标准品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加剂影响细菌内毒素的稳定性有关[2]。

注射用盐酸头孢吡肟的细菌内毒素检查法研究
　
(董光宴 韦冬苗 湛江博康海洋生物有限公司质量管理部)?
　
编者注：2005版新的中国药典《细菌内毒素检查法》修订稿规定“某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0—8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲剂必须经过验证不含内毒素和干扰因子。”本文所选样品注射用盐酸头孢吡肟是一酸性原料药，通过对该样品调节PH值后，可建立该样品的细菌内毒素检查方法。通过学习本文可加深对2005版中国药典《细菌内毒素检查法》——供试品溶液的制备项的理解，同时也可以掌握本公司产品—

—酸碱调节剂的使用方法。?


一、试剂和样品：
鲎试剂（批号：040203 灵敏度：0.125EU/ml；批号：040210 灵敏度：0.06EU/ml 湛江博康海洋生物有限公司生产）
细菌内毒素工作标准品（内毒素工作标准品2003-10，200EU/支，中国药品生物制品检定所提供）
碱性调节剂 (规格：2ml/支，批号：030704? 无菌无内毒素试剂，湛江博康海洋生物有限公司配制)
注射用盐酸头孢吡肟（规格：原料药? 批号：20040317 生产厂家：深圳信立泰药业有限公司 PH值为1.6-1.8）
二、干扰实验：
（一）、限值的确定：
L=0.04EU/mg（深圳信立泰药业有限公司提供）。
（二）、干扰试验浓度的计算：
对于固体粉末类药品，我们直接通过对内毒素限值表达方式的变换
，就可以得到干扰试验用的药品浓度，而不必用MVD公式计算。本试验样品为注射用无菌原料药，MVD取1计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L，试验选用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。
C=λ/L
?=0.06/0.04
?=1.5mg/ml
（三）、预试验及其结果
称取一定量的样品，直接用检查用水溶解样品后做预试验，结果如下表。
表? 未调PH值的预试验结果
样品浓度
结果 12.5?mg/ml 6.25 mg/ml 3.13 mg/ml 1.56 mg/ml PPC - - - - - - - - 样品管 - - - - - - - - 样品溶液酸性较强，试验结果表现出很强的抑制作用，不能做细菌内毒素检查。必须对过酸的样品溶液调节样品PH值，可使用本公司生产的酸碱调节剂调节PH值在6.0-8.0的范围内。
2、供试品溶液的制备
首先称两份样品注射用盐酸头孢吡肟，称量过程必须严格无菌操作避免样品被污染。
取其中一份样品用来调节PH值，调节方法参考酸碱滴定法，滴定到达终点时记录下所用碱性调节剂的用量。然后计算样品注射用盐酸头孢吡肟和碱性调节剂的用量比例R。
取另一份注射用盐酸头孢吡肟按照以上计算的比例R加入一定量的碱性调节剂即可。配制时须用已除内毒素的容器，用碱性调节剂直接将其溶解到5.66mg/ml-6.25mg/ml可用于细菌内毒素检查。建议配制浓度为6.25mg/ml的溶液做细菌内毒素检查，然后用细菌内毒素检查用水，将以上样品溶液稀释到3.12mg/ml和1.56mg/ml备用。操作过程必须严格无菌操作，避免外源内毒素的污染。
（四）干扰试验
1、预试验：
用碱性调节剂溶解样品后做预试验，结果如下表。
表? 调PH值后的预试验结果
样品浓度
结果 6.25 mg/ml 3.13 mg/ml 1.56 mg/ml PPC + + + + + + 样品管 - - - - - - 结果符合要求，该样品只能先经过调酸后才能用于细菌内毒素检查。
2、鲎试剂灵敏度的对照系列：
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作

标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml等5个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
3、样品干扰试验溶液的制备方法：
（1）、样品浓度为6.25mg/ml的干扰试验溶液制备方法：用已经配制好的6.25mg/ml注射用盐酸头孢吡肟溶液稀释内毒素标准品，制成为0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml的含样品注射用盐酸头孢吡肟浓度为6.25mg/ml的标准内毒素对照溶液。
（2）、样品浓度为3.13mg/ml的干扰试验溶液制备方法：取注射用盐酸头孢吡肟的6.25mg/ml稀释液1.0ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为0.25EU/ml）加入同一试管中，
混合均匀即得到含内毒素为0.125EU/ml同时含样品注射用盐酸头孢吡肟为3.13mg/ml的混合液。然后用样品注射用盐酸头孢吡肟的3.13mg/ml稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀即可得到含内毒素分别为0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml和含样品溶液浓度为3.13mg/ml的标准内毒素对照溶液。
（3）、样品浓度为1.56mg/ml的干扰试验溶液制备方法：取注射用盐酸头孢吡肟的3.13mg/ml稀释液1.0ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为0.25EU/ml）加入同一试管中，混合均匀即可得到含内毒素为0.125EU/ml并同时含样品注射用盐酸头孢吡肟为1.56mg/ml的混合液。然后用样品注射用盐酸头孢吡肟的1.56mg/ml稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀即可得到含内毒素分别为0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml和0.015EU/ml和含样品溶液浓度为1.56mg/ml的标准内毒素对照溶液。
（四）、干扰试验加样方法参考中国药典2005版细菌内毒素检查法。
（五）、试验结果：
1、结果记录(TAL: 040210，0.06EU/ml，样品浓度C为6.25mg/ml)
???? 内毒素
名称 0.125????? ?0.06????? ? 0.03???????? 0.015????????? NC?????? ? 结果 结论 ES ++? ??? ?++ ??????? --?????? ?--?????????? --????? ?0.06
++? ??? ?++ ??????? --?????? ?--?????????? --? 符合 Et ++? ???? ?--???????? --?????? ?--?????????? --????? ?0.125
++? ???? ?--???????? --?????? ?--?????????? --? 符合 2、结果记录(TAL: 040210，0.06EU/ml，样品浓度C为3.13mg/ml)
???? 内毒素
名称 0.125????? ?0.06????? ? 0.03???????? 0.015????????? NC?????? ? 结果 结论 ES ++? ??? ?++ ??????? --?????? ?--?????????? --????? ?0.06
++? ??? ?++ ??????? --?????? ?--?????????? --? 符合 Et ++? ??? ?++ ??????? --?????? ?--?????????? --????? ?0.06
++? ??? ?++ ??????? --?????? ?--?????????? --? 符合 3、结果记录(TAL: 040210，0.06EU/ml，样品浓度C为1.56mg/ml)
???? 内毒素
名称