第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定
课堂知能验收
对应学生用书P007
1．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是()
A．Ti质粒上
B．受体细胞染色体的DNA上
C．T-DNA
D．农杆菌的拟核
答案 B
解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。
2．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是() A．显微注射法B．农杆菌转化法
C．基因枪法D．花粉管通道法
答案 A
解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用
最多、最有效的一种方法。
3．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是()
A．目的基因的提取和导入
B．目的基因与载体结合
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的表达
答案 C
解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。
4．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是()
A．结构简单，操作方便
B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少，易操作
D．性状稳定，变异少
答案 B
解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；
②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；
③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。在基因工程中，主要是利用它快速繁殖的特点，可以提供更多的基因工程的产物。
5．(2017·甘肃礼县中学月考)目的基因整合到某作物DNA片段上后()
A．改变了原DNA的碱基排列顺序
B．改变了原DNA上各基因的碱基排列顺序
C．改变了原DNA上各基因的复制过程
D．改变了原DNA上各基因的转录过程
答案 A
解析目的基因整合到某作物的DNA片段上后，不能改变其他基因的碱基序列，也不能改变基因的复制和转录，B、C、D错误；只能改变原DNA的碱基排列顺序，A正确。
6．要检测受体DNA中是否成功插入了目的基因，需要用基因
探针，这里的基因探针是指()
A．用于检测疾病的医疗器械
B．带标记的与目的基因互补的核酸序列
C．带标记的蛋白质分子
D．人工合成的免疫球蛋白
答案 B
解析本题中基因探针是指用放射性同位素或荧光分子标记的与目的基因互补的核苷酸序列，利用碱基互补配对原则，检测目的基因是否导入受体细胞的DNA中。
7．(2017·石家庄一中模拟)科学家设法将人的生长激素基因导入其他生物体(细胞)内，从而获取大量的人的生长激素，应用于侏儒症的早期治疗，如图所示。请据图回答下列问题：
(1)过程①采用的方法是________，过程②之前需用________处理含目的基因的DNA片段和质粒。
(2)过程③需事先对大肠杆菌用________处理，使其处于感受态，
接着________________________________________，从而完成转化过程。
(3)过程⑤重组载体导入动物细胞一般使用____________法。
答案(1)反(逆)转录同种限制酶
(2)Ca2＋将重组表达载体溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子(合理即可)
(3)显微注射
解析(1)过程①是由mRNA到DNA的过程，利用了反转录法，过程②是将质粒和目的基因拼接在一起，在拼接前要用同种限制酶对含目的基因的DNA片段和质粒进行切割，以形成相同的黏性末端。
(2)过程③是将重组质粒导入大肠杆菌细胞，需要事先用Ca2＋处理，使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，接着将重组质粒与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。
(3)将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法。
8．(2018·河南天一联考高三期末)科学家发现胡萝卜中存在冷诱导的抗冻蛋白，克隆其cDNA，通过基因工程可用来改良植物的抗寒性。研究发现植物内源抗冻基因AFP基因更适宜在植物体内表达，
比昆虫、海洋动物等的抗冻基因有更多的优点。下图为利用胡萝卜的AFP基因培育抗寒性强的番茄植株的过程。请据图回答下列问题。
(1)以幼小胡萝卜植株细胞中的mRNA为材料获得抗冻蛋白cDNA，要依据______________原则。利用PCR技术扩增AFP基因时，需要加入两种引物，原因是________酶只能从引物的3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增，该酶只能特异地复制处于________之间的DNA序列，一个DNA分子经三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有________个。
(2)将AFP基因导入植物细胞时，目前常用的目的基因载体是Ti 质粒，AFP基因必须插入该基因载体的________上。将重组AFP基因的表达载体导入农杆菌，再感染番茄细胞，可经过________________技术形成转基因植株。
(3)若要在个体水平上检测抗寒性强的番茄植株是否培育成功，请写出检测思路。_______________________________________。
答案(1)碱基互补配对热稳定DNA聚合(Taq)两个引物6 (2)T-DNA植物组织培养(3)将获得的转基因植株放在低温(寒冷)环境中培养，若该植株能正常生长繁殖，则表明抗寒性强的番茄植株
培育成功
解析据图分析，将胡萝卜的AFP基因(目的基因)与Ti质粒重组，构建基因表达载体，导入农杆菌，利用农杆菌感染番茄细胞，将目的基因插入到番茄细胞中，通过植物组织培养最终获得了抗寒性较强的番茄植株。
(1)以mRNA为模板获得cDNA的过程为逆转录过程，该过程遵循碱基互补配对原则，需要逆转录酶的催化；利用PCR技术扩增AFP 基因时，需要加入两种引物，原因是热稳定DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增，该酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，一个DNA 分子经三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有23－2＝6个。
(2)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞染色体DNA 上，根据农杆菌的这一特点，利用农杆菌的Ti质粒作为载体时，必须将目的基因插入其T-DNA上；导入目的基因的番茄细胞可以通过植物组织培养技术形成转基因植株。
(3)在个体水平上检测抗寒性强的番茄植株，可以将获得的转基因植株放在低温(寒冷)环境中培养，若该植株能正常生长繁殖，则表明抗寒性强的番茄植株培育成功。课后提能训练对应学生用书P009
1．关于目的基因获取过程的叙述中，不正确的是()
A．人工合成法可合成未知序列的任意大小的DNA片段
B．真核生物与原核生物的目的基因均可从基因文库中提取
C．原核生物的目的基因一般不从cDNA文库中提取
D．若可设计出特定引物，利用PCR方法也可获取目的基因
答案 A
解析人工合成双链DNA分子，所能合成的长度范围为50 bp～12 kb，且需已知序列，A错误；原核生物的基因不含内含子，因此不需从cDNA基因文库中提取，C正确。
2．不属于目的基因与载体结合过程的是()
A．用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端
B．用同种限制酶切割目的基因，露出黏性末端
C．将切下的目的基因插入到质粒的切口处
D．将重组DNA引入到受体细胞中进行扩增
答案 D
解析目的基因与载体结合过程中，首先用相同的限制酶切割目的基因两端和载体(通常是质粒)，使它们具有相同的黏性末端，再把目的基因连接到质粒的切口处，通过DNA连接酶将其连接，故只有D项不属于，D项属于将目的基因导入受体细胞的过程。
3．基因工程的基本原理是让目的基因在受体细胞中稳定存在并高效地表达。下列关于基因工程的基本操作中，错误的是() A．用化学方法合成目的基因的条件是知道目的基因的核苷酸序列
B．目的基因与载体DNA连接必须利用的工具酶是DNA聚合酶C．若用大肠杆菌作为受体细胞，通常用氯化钙处理大肠杆菌，目的是使重组质粒顺利进入
D．筛选含目的基因的受体细胞，必须根据载体DNA上的特定基因来确定培养基
答案 B
解析利用化学合成法合成目的基因主要适用于已知核苷酸序
列的、分子量较小的目的基因的制备，A正确；目的基因与载体连接必须利用的工具酶是DNA连接酶，B错误；用氯化钙处理大肠杆菌，增大了细胞膜的通透性，使细胞处于感受态，以促进重组质粒顺利进入细胞，C正确；根据质粒上的标记基因来检测目的基因是否进入受体细胞，D正确。
4．下列关于目的基因导入受体细胞的描述不正确的是()
A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济有效
B．显微注射法是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
答案 A
解析目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济有效，此外还有基因枪法和花粉管通道法，基因枪法是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但成本较高，A错误，D正确；目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法，B正确；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理
状态发生改变(使细胞处于感受态)，完成转化过程，C正确。
5．下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是()
A．目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B．检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录的方法都是分子杂交法
C．目的基因的鉴定有时需要在个体水平上进行
D．如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因首端含有启动子
答案 A
解析真核细胞的主要遗传物质都保存在细胞核中，因此目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键在于目的基因是否插入染色体中随之进行复制，而非质粒DNA，A错误；检测受体细胞是否含有目的基因需要用DNA分子与基因组DNA杂交，检测其是否转录则需要用DNA分子与mRNA杂交，两者均属于分子杂交法，B正确；鉴定目的基因产物时，有时需要进行个体生物学水平的鉴定，比如需要进行活性比较、接种实验等鉴定，C正确；目的基因成功表达意味
着转录过程成功进行，而启动子是目的基因转录过程开始的关键因素，D正确。
6．草甘膦是一种可以杀灭多种植物(包括农作物)的除草剂。草甘膦杀死植物的原理在于能够破坏植物叶绿体或质体中的EPSPS合成酶。通过转基因的方法，让农作物产生更多的EPSPS酶，就能抵抗草甘膦，从而让农作物不被草甘膦杀死。下列有关抗草甘膦转基因大豆的培育分析正确的是()
A．可通过喷洒草甘膦来检验转基因大豆是否培育成功
B．只能以大豆受精卵细胞作为基因工程的受体细胞
C．在转基因操作过程中一定要用同一种限制性核酸内切酶
D．只要EPSPS合成酶基因进入大豆细胞，大豆就会表现出抗草甘膦性状
答案 A
解析可通过喷洒草甘膦来检验转基因大豆是否培育成功，A正确；转基因植物可用植物体细胞作为受体细胞，B错误；转基因操作时不一定要用同一种限制酶，C错误；基因成功转入后，不一定能够成功表达，还需要进一步检测，D错误。
7．(2018·东北三校联考)抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋白质，能降低水溶液的冰点，从而导致水溶液的熔点和冰点出现差值，这个温度差称为热滞值。昆虫抗冻蛋白的热滞值最高，为3～6 ℃，鱼的热滞值为0.7～1.5 ℃，因此，昆虫抗冻蛋白在实际应用上具有更大的潜力。为了扩展一些植物的生存范围，科学家利用昆虫抗冻蛋白(AFPS)的异源表达，现已成功地提高了烟草的抗冻能力。请分析回答相关问题：
(1)基因工程的核心步骤是______________，这一过程需要的酶是__________________。将AFPS基因导入烟草细胞中，常用____________法，这是因为烟草属于________(填“单”或“双”)子叶植物，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的____________，此操作过程中使用的载体是__________。
(2)若检测AFPS基因是否整合到烟草的染色体上，一般采用______________技术，若检测是否产生抗冻蛋白，一般采用__________________方法检测杂交带；还可以从____________生物学水平进行抗冻鉴定。
答案(1)基因表达载体的构建限制酶和DNA连接酶农杆菌转化双酚类化合物Ti质粒
(2)DNA分子杂交抗原—抗体杂交个体
解析(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，在此过程中应用同种限制酶切割载体和含有目的基因的DNA分子，再用DNA连接酶连接成重组DNA分子，因为受体烟草细胞是双子叶植物细胞，所以将AFPS基因导入植物细胞的最常用的方法是农杆菌转化法，当植物体受到损伤时，伤口处会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，此过程常用的载体是Ti质粒。
(2)若检测AFPS基因是否整合到烟草的染色体上，一般用DNA 分子杂交技术；若检测是否产生抗冻蛋白，一般采用抗原—抗体方法检测杂交带，还可以从个体生物学水平进行抗冻鉴定。
8．请回答下列有关基因工程的问题：
(1)如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种________片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体就叫做这种生物的________。
(2)一个基因表达载体的组成成分，除了有目的基因，还必须有________、________以及________等。
(3)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表
达的过程，称为________。将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是____________法。将目的基因导入动物细胞采用最多、也最有效的方法是____________。大肠杆菌最常用的转化方法是首先用______处理细胞，使细胞处于一种__________________________________的生理状态，这种状态的细胞被称作感受态细胞。
答案(1)互补DNA(cDNA)cDNA文库(部分基因文库)(2)启动子终止子标记基因(3)转化农杆菌转化显微注射法Ca2＋能吸收周围环境中DNA分子
解析(1)基因工程用mRNA反转录形成互补DNA(cDNA)片段，题中受体菌内含有某种生物的一部分基因，叫做这种生物的cDNA文库(部分基因文库)。
(2)基因表达载体包括启动子、目的基因、标记基因、终止子等。
(3)目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。将目的基因导入植物细胞通常用农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用Ca2＋处理法。
分子生物学实验报告 题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定 姓名：学号：班级：时间： 一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化： 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可
第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定 一、选择题 题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( ) 答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D 正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是( ) A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核 答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA 上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是( ) A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法 答案 A 解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是( ) A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达 答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，
专题1 基因工程 1.3 基因工程的基本操作程序——将目的基因导 入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 一、选择题 1．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是( ) A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少D．性状稳定，变异少 解析：本题考查基因工程的受体细胞。目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因，所以基因工程常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞。解答这类题目应结合受体细胞的特点回答。 答案：B 2．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。下列属于目的基因的检测的是( ) ①检测受体细胞是否含有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录出信使RNA ④检测目的基因是否翻译出蛋白质 A．①②③B．②③④ C．①③④D．①②④ 解析：本题考查目的基因检测的相关知识。目的基因的检测包括：检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针与基因组DNA杂交；检测目的基因是否转录出了信使RNA，方法是用基因探针与信使RNA杂交；最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。 答案：C 3．如图为某科研小组采用“基因靶向”技术先将小鼠的棕褐毛色基因导入黑色纯种小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中，再将改造后的胚胎干细胞移植回囊胚继续发育成小鼠的过程。据图分析不正确的是( ) A．该过程使用的工具酶是DNA连接酶以及限制性核酸内切酶 B．完成第Ⅱ步操作得到的由两个DNA切段连接成的产物，必定是载体与棕褐毛色基
第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测 与鉴定 一、选择题 题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是() 选项受体细胞导入方法 A 棉花细胞花粉管通道法 B 大肠杆菌农杆菌转化法 C 羊受精卵显微注射技术 D 小麦细胞基因枪法 答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核 答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是() A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法 答案 A
解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是() A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达 答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。 5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是() A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少，易操作 D．性状稳定，变异少 答案 B 解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。在基因工程中，主要是利用它快速繁殖的特点，可以提供更多的基因工程的产物。 6．目的基因整合到某作物DNA片段上后() A．改变了原DNA的碱基排列顺序 B．改变了原DNA上各基因的碱基排列顺序 C．改变了原DNA上各基因的复制过程 D．改变了原DNA上各基因的转录过程 答案 A 解析目的基因整合到某作物的DNA片段上后，不能改变其他基因的碱基序列，也不能改变基因的复制和转录过程，B、C、D错误；只能改变原DNA的碱基排列顺序，A正确。 7．人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体加工合成。通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是() A．大肠杆菌B．酵母菌
第2课时目的基因的导入和检 测 [目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。 [重难点击] 1.目的基因的导入方法。2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。 方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 一、目的基因的导入 1．花粉管通道法(如图)
(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。 (2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序 ①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。 ②操作过程 a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。 b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。 c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。 d．0.5～1 h后用一定浓度的DNA溶液涂抹柱头。 e．收获种子，种植，进行抗虫性检测。 (3)特点 ①优点：简单经济、快捷实用，且不受植物基因型的限制，理论上适用于任何开花植物。 ②缺点：工作效率较低，且后代的遗传情况较复杂。 2．氯化钙法 (1)适用条件：运载体是质粒，受体细胞是大肠杆菌。 (2)作用原理：氯化钙使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，细胞膜的通透性发生变化，允许含有目的基因的运载体分子进入。 (3)过程
第八章细胞信号转导 选择题 1..受体介导的胞吞作用不具有的特点是 A.在细胞膜的特定区域进行 B.形成有被小窝和有被小泡 C.吸入大量的细胞外液 D.胞吞速率比液相胞吞快 2.细胞摄入微生物或细胞碎片进行消化的过程称为 A.吞噬作用 B.异噬作用 C.入胞作用 D.吞饮作用 3.下列哪种物质不属于第二信使 A. cAMP B. IP3 C. DG D. AC 4.能使细胞内cAMP升高的G蛋白是 A. Gi B. Gs C. Gp D. Gt 5.能结合并活化磷脂酶C，导致PIP2分解，生成IP3和DG的G蛋白是 A. G S B .G i C. G P D .G T 6.动物细胞中cAMP信使的主要生物学功能是活化 A.蛋白激酶C B.蛋白激酶A C.蛋白激酶K D. Ga2+激酶 7.下列哪种物质不属于胞内信使 A. cAMP B. cGMP C. DG D. EGFR 8.包围在细胞质外层的一个复合结构体系和多功能体系称为 A.细胞膜 B.细胞表面 C.细胞外被 D.细胞外基质 9. 微管和微丝大量存在于 A.细胞核 B.细胞外被 C.细胞膜 D.胞质溶胶 10. 细胞表面中具有识别功能的部位是 A.细胞膜 B.细胞外被 C.膜脂双层 D.胞质溶胶 11.衰老红细胞能被巨噬细胞吞噬，是因为其表面失去了 A. 半乳糖 B.唾液酸 C.甘露糖 D.葡萄糖 12.衰老红细胞的糖链常暴露出 A.半乳糖 B.唾液酸 C.甘露糖 D.葡萄糖 13.细胞膜含量最多的化学成分是 A.磷脂 B.胆固醇 C.糖类 D.蛋白质 14.细胞膜结构的基本骨架主要是由哪种分子形成的 A.磷脂 B.胆固醇 C.糖类 D.蛋白质 15.在细胞膜中对脂质的物理状态具有维持和调节作用的分子是 A.磷脂 B.胆固醇 C.水 D.蛋白质 16.构成膜受体的主要化学成分是 A.磷脂 B.胆固醇 C.糖类 D.蛋白质
2019-2020学年人教版选修3 目的基因的导入、检测与 鉴定学案 [学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。 方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 一、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法 (1)导入植物细胞 ①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。 a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞
的染色体的DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。 ②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。 ③花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 (2)导入动物细胞 ①方法：显微注射技术。 ②常用受体细胞：受精卵。 ③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物 (3)导入微生物细胞 ①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 ②常用的方法： a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。 b．感受态细胞和重组表达DNA分子在缓冲液中混合，细胞吸收重组表达载体DNA分子。归纳总结 1．上述方法中，在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。 2．对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 例1农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：
动物遗传学读书报告 之 新基因的分离克隆及功能鉴定 学院班级：动物科技学院动物科学10级2班 新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展 前言 随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。 1. 基因的分离克隆 基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。 1.1基因的分离克隆主要方法 基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将
这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。 1.1.1功能性克隆 通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly —A 序列指导合成poly —T 的3’端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。 1.1.2同源性序列克隆技术 随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库
1．2.2 目的基因的导入、检测与鉴定 [学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。 方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 一、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法 (1)导入植物细胞 ①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。 a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插
第3课时导入、检测和鉴定目的基因 [学习导航] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。[重难点击] 1.目的基因导入受体细胞的方法。2.检测和鉴定目的基因的方法。 方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。 方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 一、导入目的基因 将目的基因导入受体细胞的方法和过程 1．农杆菌转化法的分析
(1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 答案基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。 (2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？ 答案农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 2．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？答案植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 3．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？ 答案微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。 1．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T－DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_______(部位)即可。
二、受体理论 要点： （1）受体的概念、特性、类型和调节方式 （2）受体学说 （一）受体的概念 1.受体：是存在于细胞膜、细胞浆或细胞核上的大分子化合物（如蛋白质、核酸、脂质等）能与特异性配体（药物、递质、激素、内源性活性物质）结合并产生效应。 2.配体或配基：与受体结合的特异性物质称。 3.受点或位点：受体上能与配体相结合的活性基团。 （二）受体的特性 1.有饱和性、竞争性 2.特异性 3.可逆性 4.高亲和性 5.结构专一性 6.立体选择性 7.区域分布性 8.生物体存在内源性配体 9.亚细胞或分子特征 10.配体结合试验资料与药理活性的相关性 （三）受体的类型 根据受体在靶细胞上存在的位置或分布分类：3类 1.细胞膜受体 （1）如胆碱受体、肾上腺素受体、多巴胺受体、阿片（内阿片肽）受体、组胺受体及胰岛素受体等； （2）受体除分布于突触后膜外，有些也分布于突触前膜。突触前膜与突触后膜受体对药物的亲和力、敏感性和生理功能不同。 2.胞浆受体：位于靶细胞的胞浆内，如肾上腺皮质激素受体、性激素受体等。
3.胞核受体：位于靶细胞的细胞核内，如甲状腺素受体存在于细胞浆或细胞核内。 根据受体蛋白的结构和信号转导的机制分类 1.含离子通道的受体：受体直接与离子通道相偶联，配体与其结合后迅速引起细胞膜的电位变化而产生效应。如GABA受体。 2.G蛋白偶联受体：受体与配体结合后，通过G蛋白改变细胞内第二信使的浓度，将信号传递至效应器而产生生物效应。如M-ACh受体、NA受体、5-HT受体和DA受体等。 3.酪氨酸激酶受体：为跨膜蛋白，胞外部分与配体结合，胞内部分含有酪氨酸激酶活性或与酪氨酸激酶偶联。如胰岛素、生长因子、神经营养因子受体等。 4.调节基因表达的受体：细胞浆或细胞核内，也称核受体。其配体多为亲脂性小分子化合物，如甾体激素（肾上腺皮质激素、性激素）、甲状腺素。 （四）受体调节 概念：受体与配体作用，其有关的受体数目和亲和力的变化称受体调节。 1.向下调节（衰减性调节）和向上调节（上增性调节） （1）向下调节：长期使用激动剂，如用异丙肾上腺素治疗哮喘，可使受体数目减少，疗效逐渐下降。 （2）向上调节：长期使用拮抗剂，如用普萘洛尔可出现受体数目增加，突然停药，可引起反跳现象，表现为敏感性增高。 2.同种调节和异种调节 （1）同种调节：配体作用于其特异性受体，使自身的受体发生变化。 （2）异种调节：配体作用于其特异性受体，对另一种配体的受体产生调节作用。如β-肾上腺素受体可被甲状腺素、糖皮质激素和性激素所调节；γ-氨基丁酸（GABA）受体可受苯二氮调节。 （五）受体学说 Drug：D Receptor：R Effect：E 1.药物与受体的作用——占领学说 2.基本观点： （1）R必须与D结合后才被活化，药效与被占领的受体数目成正比。 （2）D与R之间具有结合的能力，称：亲和力，用1/K D表示。 （3）D与R结合后引起E的能力称为：内在活性。
人类疾病基因的鉴定与分离 医学遗传学研究的一项重要任务就是建立基因型与表现型之间的关系，也就是寻找疾病的致病基因。通过本课程的学习，将让学生明确分离单基因病致病基因及复杂疾病易感基因的基本思路与常用方法，本课程主要内容包括：基因的基本结构，突变与多态，常用的突变检测方法，不同多态的分型技术，连锁分析的原理，Lod score的计算，Hardy-Weinberg 平衡定律，关联分析的原理及应用，样本量估计，以及复杂疾病分析中的常用统计方法，分子病理。 This course is designed to give students a practical knowledge of the principles and practice of Medical Genetics which will allow them to evaluate, choose and interpret appropriate genetic investigations for individuals, families and populations with genetic disease. Also，we aim to ensure students develop the skills to know how to make the connection between genotypes and phenotypes by using of linkage analysis, mutation analysis, association studies. The major fields of this course involve: gene structure, mutation and polymorphism (RFLP, STR, SNP), linkage analysis, Lod score, Hardy-Weinberg equilibrium, association study, genotyping techniques, sample size calculation, common used statistical analysis，molecular pathology.
将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 [基础对点] 知识点一将目的基因导入受体细胞 1.下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是( ) A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少 B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态 C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度 D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液 答案 D 解析将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH等)下，将基因表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响pH的变化，因此要加入缓冲液，以保持适宜的pH，D错误。 2．将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是( ) A．显微注射技术农杆菌转化法 B．基因枪法花粉管通道法 C．农杆菌转化法显微注射技术 D．基因枪法显微注射技术 答案 D 解析玉米是单子叶植物，目的基因导入单子叶植物常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射技术，D正确。 3.农杆菌中含有一个大型的Ti质粒(如右图所示)，在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段可以转入植物的基因组。若想用基因工程并通过农杆菌向某种植物中导入抗旱基因，以下分析不合理的是( ) A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏 B．将重组Ti质粒导入农杆菌中时，可以用Ca2＋处理细菌 C．转基因抗旱植物培育是否成功的最简单检测方法是看该植物是否具有抗旱性状 D．若能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，则说明该基因工程项目获得成功 答案 D 解析若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏，否则不会成功，A正确；将重组
收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定 宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定 检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因 报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交 证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #
第2课时将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测 与鉴定 [学习目标] 1.熟悉目的基因导入受体细胞的方法。2.了解农杆菌转化法。3.画出DNA分子杂交示意图。4.目的基因的检测方法的比较。 知识点一将目的基因导入受体细胞 知识梳理 1.转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内□01维持稳定和表达的过程。 2．将目的基因导入植物细胞 (1)□01农杆菌转化法：将目的基因导入□02双子叶植物和裸子植物最常用的方法 ①农杆菌特点：当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的□03酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的□04Ti质料上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的□05DNA上。 ②受体细胞：植物□06体细胞或受精卵。 ③操作过程：将目的基因插入到□07Ti质粒的T-DNA上―→转入□08农杆菌―→导入□09植物细胞―→目的基因整合到□10受体细胞染色体的DNA上―→目的基因表达。 (2)基因枪法：适用于□11单子叶植物，成本较高。是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的□12表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并□13表达的方法。 (3)花粉管通道法：我国科学家独创的方法花粉管通道法，就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去□14柱头；然后，滴加□15DNA(含目的基因)，
使目的基因借助□16花粉管通道进入受体细胞。该方法十分简单经济。我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。 3．将目的基因导入动物细胞 (1)方法：□01显微注射技术，采用最多、最有效的方法。 (2)受体细胞：动物的□02受精卵。 (3)操作过程：将含有□03目的基因的表达载体提纯―→取卵(□04受精卵)―→□05显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，□06移植到雌性动物的□07输卵管或子宫内―→获得□08新性状的动物。 4．将目的基因导入微生物细胞 (1)方法 ①用□01Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为□02感受态细胞)。 ②将重组表达载体DNA分子溶于□03缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 (2)受体细胞：原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。 (3)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、□04遗传物质相对较少等。 [问题探究]植物基因工程常用的受体细胞为什么是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 典题分析 题型一农杆菌转化法的辨析 [例1]农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因
姓名宿智新学院生命科学学院班级 11级生工2班科目分子生物学实验学号 201100140155 第 8 组 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5α（E.coli DH5α）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法质粒电泳 实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。