中国农业大学
硕士学位论文
大豆分离蛋白的组分分离技术研究
姓名：韩雅君
申请学位级别：硕士
专业：食品科学
指导教师：郭顺堂
20040601
摘要
大豆分离蛋白具有多种功能特性，用于食品生产改善食品的营养和品质。大豆分离蛋白制品中７ｓ和１１Ｓ球蛋白是主要成分，７ｓ球蛋白是糖蛋白，具有良好的乳化性，１１Ｓ球蛋白的凝胶性和起泡性较好，它们之间的相对比例对大豆分离蛋白的功能特性起着十分重要的作用。为适应市场对大豆分离蛋白功能特性多样化的需求，本研究根据７ｓ和ｌｌＳ球蛋白功能性差异，研究了适于工厂化生产的大豆分离蛋白的组分分离技术，并探讨了富含７ｓ组分和富含１ｌｓ组分分离蛋白的功能性质和在冰淇淋及面制品中的应用。
本研究采用超高速离心分离的分析方法研究了在不同提取方式和条件下大豆蛋白质溶液中蛋白质的存在状态。结果表明，中性条件下提取的大豆蛋白质在ｐＨ偏酸性和低离子强度下，粒子部分（直径大于５０ｈｍ）以１ｌＳ为主．可溶性部分（直径小于５０ｈｍ）以７Ｓ为主。根据此研究结果，降低离心分离的条件，采用适合工厂化生产的条件制备所得到富含７Ｓ组分分离蛋白中７ｓ约占６５％，富含１１Ｓ组分分离蛋白中１１Ｓ的纯度达到８６％。
通过对本实验所调制的富含７ｓ组分和富含１１Ｓ组分分离蛋白各种理化性质和功能性质的研究表明，富含７Ｓ组分和富含ｌｌＳ组分分离蛋白的理化特性和产品质量均达到大豆分离蛋白的要求，并且它们的蛋白质溶解性、分散稳定性、持水性、持油性、乳化能力和乳化稳定性均高于一般市售大豆分离蛋白产品。对富含７ｓ组分和富含ｌｌＳ组分分离蛋白的凝胶性和起泡能力的研究发现，在调制中对蛋白质适当的改性可以提高其凝胶能力；也可以通过调整富含７ｓ组分分离蛋白和富含ｌｌＳ组分分离蛋白的比例得到不同凝胶强度和起泡能力的分离蛋白产品。
探讨将两种分离蛋白应用于冰淇淋和面制品中对产品品质的影响，结果表明，富含１１Ｓ组分分离蛋自可以显著提高冰淇淋的膨胀率和面团的粉质评价值，可以作为专用型大豆分离蛋白。
关键词：大豆分离蛋白，工业化组分分离技术，富含７Ｓ组分分离蛋白，富含１１ｓ组分分离蛋白，功能特性
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｅｓｗａｓｍｏｓｔｌｙｕｓｅｄａｓｆｏｏｄｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｔｏｉｍｐｒｏｖｅｆｏｏｄｔｅｘｔｕｒａｌａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．７Ｓａｎｄｌ１ＳｇｌｏｂｌｉｎｅｓａｒｅｔｈｅｍａｊｏｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＳＰＩ，７Ｓｉｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｈａｖｅｇｏｏｄｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙａｎｄｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄａｂｉｌｉｔｙ，１１Ｓｈａｖｅｇｏｏｄｇｅｌａｂｉｌｉｔｙａｎｄｆｏａｍｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆ７Ｓａｎｄ１１Ｓｈａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｆｆｃｃｔｓ０ｎｔｈｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳＰＩ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｏｆＳＰＩｏｆｖａｒｉｏｕｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆ
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本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名．勃拒届时间：砷“年６月，ｇ日
关于论文使用授权的说明
本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）
研究生签名：锄导师签名祈ｉ时间：珈牛年６月侣日
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中陶农业大学颤１．学位论文第一章绪论
第一章绪论
１．１研究目的和意义
大豆不仅是优良的油料作物，而且是理想的食用蛋白资源。联合国粮农组织（ＦＡＯ）将大豆蛋白定为２１世纪重点开发的蛋白资源。除了发展传统的豆制品外，随着现代高新技术在大豆工业中的应用，大豆蛋白加工领域成为大豆精深加工中最具有潜力和前途的发展领域（朱秀清等，２００１ａ，ｂ），出现了大豆蛋白粉、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白等高技术含量、高附加值的新兴大豆蛋白制品。其中大豆分离蛋白是大豆蛋白产品中极为重要的一类产品，它具有多种优良的加工特性，如凝胶性、乳化性、起泡性、持水性、持油性和粘弹性等，因此被广泛地应用于肉制品、乳制品、面制品、儿童食品、方便食品和冷冻食品中，改善食品的品质，提高产品质量。
大豆分离蛋白（ＳｏｙｂｅａｎＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏｌａｔｅ，ＳＰＩ）是以低变性脱脂豆粕为原料。采用现代化的加工技术制取的一种蛋白质含量较高（一般在９０％以上）的功能性食品添加剂或食品原料（沈再春等。１９９８）。目前，工业上制取大豆分离蛋白，通常采用“碱溶酸沉”的生产工艺，即利用大豆蛋白在不同ｐＨ值的条件下有不同溶解度的特点（刘志同等，１９９９），先用ｐＨ为８．５～９．０的ＮａＯＨ溶液浸提豆粕，使蛋白质溶出，然后用ＨＣｌ将提取液的ｐＨ调至大豆蛋白的等电点（大豆蛋白在等电点条件下溶解度最小）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗｏｌｆｅｔａ／．，１９７３），使蛋白沉淀，然后将沉淀物再经过水洗和喷雾干燥后得到大豆分离蛋白产品。在这种加工工艺中常常使用大量的酸碱，因而蛋白质变性程度大，而且强碱性条件下长时间处理大豆蛋白，会生成有毒化台物赖氨酰丙氨酸，有可能降低蛋白质利用率和大豆蛋白中必需氨基酸——赖氨酸含量。
大豆蛋白质中的主要成分是７ｓ和１１Ｓ球蛋白。二者约占大豆蛋白质总量的７０％，７Ｓ和１ＩＳ球蛋白的理化特性和功能特性有明显差别，它们对大豆分离蛋白的功能特性起着十分重要的作用。７ｓ球蛋白水溶性优于ｌｌｓ球蛋白，溶解稳定性非常高，并且具有良好的乳化性；而１１Ｓ球蛋白的半胱氨酸含量较高，因两凝胶性、起泡性和泡沫稳定性都优于７ｓ球蛋白（Ｆｕｋｕｓｈｌｍａ，１９９１ａ）。因此。这两种球蛋白在大豆分离蛋白中所占的相对比例与分离蛋白的功能性质密切相关。应用“碱溶酸沉”的工艺生产的大豆分离蛋白是７ｓ和１１Ｓ球蛋白的混合物，产品所体现的功能性质不突出，当应用的原料中７ｓ和１ｌｓ球蛋白的比例发生变化时产品的性能会出现不稳定，制约了大豆分离蛋白在食品加工中的应用。目前，我国的大豆分离蛋白产品基本上为高凝胶值型的。仅限于应用在灌肠类产品中，而分离蛋白具有的其他性质都没有得到发挥。所以就食品工业来说，接着各种食品的性能需要生产出具有某种单一的、独特的功能性大豆分离蛋白，是解决国内大豆分离蛋白缺乏多样化、专用型产品的关键。
有关大豆蛋白质组分的功能和利用问题在育种和加工利用研究方面有许多报道，是目前的研究热点。在实验室利用层析、超高速离心分析等生化研究手段已经成功地分离出高纯度的ｌｌＳ球蛋白（大豆球蛋白）和７ｓ球蛋白（ｐ伴大豆球蛋白）（１１１ａｎｈ，１９７５；Ｎａｇａｎｏ，１９９２），并用于大豆蛋白质化学和生化等方面的研究。但是这种组分分离的条件都比较高。过程复杂，成本昂贵，难以用于食品级的工业化生产。所以，研究工厂化的７ｓ球蛋白和１１球蛋白分离技术是分离蛋白加工技术创新领域的前沿课题。本研究从大豆蛋白质各组分在不同提取条件和方式下溶出形态不
中圉舣业大学顶士学位论文第一犟绪论
同的角度出发，采用物理与化学相结合的方法．在适合工厂化生产的条件下将脱脂豆粕中的主要成分——７ｓ和１１ｓ球蛋白分离，分别制取富含７ｓ球蛋白和富含¨ｓ球蛋白的分离蛋白，目的在于利用７ｓ和１ＩＳ球蛋白本身的功能特性，使分离蛋白的功能特性及专用化程度极大提高，改变传统制取分离蛋白的“碱溶酸沉”的生产工艺，生产出低变性、高质量、多样化的专用型分离蛋白产品。同时，这种生产工艺还避免了分离蛋白在制取时由于大量酸碱使用而导致的蛋白变性和有毒物质的生成。本研究成果将为改进大豆分离蛋白的生产提出新的生产工艺，同时对推动大豆分离蛋白提取技术的发展、优化产品结构、扩大产品应用范围以及获取更大的社会效益和经济效益具有重要的现实意义。
１．２国内外研究现状
我国是大豆的故乡，大豆的生产至今已有５０００多年的历史。周朝‘诗经》中有“中原有菽，庶民采之”的记载，菽即是现在的大豆（张振山、方继功，１９８８）。大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍｃｃｃ）属蝶形花科，大豆属，一年生草本植物。作为一种经济作物，大豆有多种独特的优点：从农业特征上看，大豆对土壤和气候适应范围广，而且还能固氮，是理想的轮作作物；从组成成分上看，大豆约含２０％的油脂、４０％的蛋白质，是含油和蛋白质量较高的作物。全球大豆生产主要集中在美国、巴西、中国和阿根廷，这四个国家的产量约占全球总产量的９０％。
１．２．１大豆蛋白的营养和保健功能
大豆主要成分是蛋白质和脂肪，二者约占整个大豆成分的６０％．大豆脂肪中８５％左右为不饱和脂肪酸，具有阻止胆固酵在血管中沉积的作用。大豆脂肪中除含有的油酸、亚油酸、亚麻酸等都是人体必需脂肪酸外．还含有２－３％的磷脂，其中卵磷脂、脑磷腊和肌酵磷脂等都是人体大脑和肝脏所必需的物质。大豆的蛋白质含量丰富，一般在４０％左右。按蛋白质４０％计算，１蚝大豆的蛋白质含量相当于２．３ｋｇ猪瘦肉或２ｋｇ牛瘦肉中的蛋白含量，所以被人誉为“绿色乳牛”、“植物肉”。大豆蛋白的氨基酸组成与牛奶蛋白相近，而且必需氨基酸含量较丰富，是植物性的完全蛋白。
表Ｉ－Ｉ不同食物蛋白质的消化率校正氨基酸指教（ＰＩ）ＣＡＡＳ）
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根据ＦＡＯ／ＷＨＯ新的更精确的氨基酸消化率评分（Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ．ＣｏｒｒｅｃｔｅｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｃｏｒｅ，ＰＤＣＡＡＳ）标准（ＦＡＯ／ＷＨＯ，１９９９）（表１－１），大豆可得到与动物蛋白相同的１．０的最高分。ＦＡＯ／ＷＨＯ（１９８５）人类试验结果表明，大豆蛋白必需氨基酸组成较适合人体需要（Ｙｏｕｎｇ，Ｖ．Ｒ．，１９９１）。从图１－ｌ大豆分离蛋白氨基酸组成和氨基酸模式比较的结果表明，对于两岁以上的人，大豆蛋白的生理效价为１００，与鸡蛋、牛奶蛋白相同（郑建仙，２００３年）。
氨基教音量加ｇ?（ｇ蛋白质）．Ｉ
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躅１－１大豆分离蛋白的氨基酸组成与氨基酸模式比较
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另一方面，现代营养学研究证实，大豆蛋白具有降低血清胆固酵的作用（Ｓｔｅｍ，２０００）。Ａｎｄｅｒｓｏｎ等人在对３８组７４３人次进行的代谢分析研究中发现，每日食用２５９以上的大豆蛋白可使血清中的总胆固醇含量下降９．２％，ＬＤＬ（１０ｗ－ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）即低密度脂蛋白含量下降１２．９％，甘油三酯的含量下降１０．５％。临床应用已确认，大豆蛋白对血浆胆固醇的影响有３个特点：（１）对血浆胆固醇含量高的人，大豆蛋白有降低胆固醇的作用：（２）当摄取高胆固醇食物时，大豆蛋白可以防止血液中胆固醇的升高：（３）对血液中胆固醇含量正常的人来，大豆蛋白可降低血液中ＬＤＬ／ＨＤＬ胆固醇的比值（郑建仙，２００３年）。
大豆蛋白经有限水解后产生的某些肽段具有抗氧化（ＣｈｅｎｅｔａＬ。１９９５）、抑制血管紧张素转化酶（Ｍａｒｕｙａｍａｓｅｔａ１．。１９８２）以及促进营养吸收和降血脂的作用（Ｓｕｇａｎｏ，１９９０）。大豆中含有的皂甙、异黄酮等生理活性成分具有抗氧化、防衰老、提高免疫力和促进钙吸收等功能。胁
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因此，大豆不仅在人口不断增长的发展中国家作为解决蛋白质供给不足的重要途径，而且在西方发达国家对改善饮食模式和膳食结构中的营养平衡发挥重要的作用。
１．２．２大豆蛋白的组成和结构
根据蛋ｃａ质的溶解特性和奥斯本（Ｏｓｂｏｍ）及丹皮鲍尔（Ｄａｍｐｂａｌｌ）的溶解性分类法，大豆蛋白可以分为两类，即清蛋白（ｗｈｅｙｐｒｏｔｅｉｎ）和球蛋白（ｓｏｙｇｌｏｂｕｌｉｎ），二者的比例因品种及栽培条件不同而略有差异（杜长安等，１９９５）。清蛋白一般占大豆蛋白的５％（以粗蛋白记）左右；球蛋白约占９０＂／０２莹右。根据免疫学的分析，球蛋自又可分为大豆球蛋白（ｇｌｙｅｉｎｉｎ，占４０％），ｇ．－伴大豆球蛋白（ａ－ｃｏｎｇｌｙｅｉｎｉｎ，占１３．８％），Ｂ，伴大豆球蛋ｃａ（１３－ｃｏｎｇｌｙｅｉｎｉｎ，占２７．９０／ｏ）和丫－伴大豆球蛋白０－ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ，占３．Ｏ％）（１ｗａｂｕｃｈｉｅｔ口ｆ．，１９８７；ＹａｍａｕｃｈｉｅｔａＬ，１９９１）。根据生理功能分类法。大豆蛋白可分为贮藏蛋白和生物活性蛋白两大类（林忠平等，１９８３）。贮藏蛋白是主体，约占蛋白质的７０％左右。通过超速离心分析，用沉降系数Ｓ代表这些组分（１Ｓ＝ＩＯ。１３秒＝ｌＳｖｅｄｂｅｒｇ单位）。可分为２ｓ、７ｓ、１１ｓ和１５Ｓ四种成分（ＰｅｎｇｅｔａＬ，１９８４），它们与大豆的加工性质密切相关：生物活性蛋ｃａ包括的较多，如胰蛋白酶抑制剂（ｔｒｙｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、Ｂ－淀粉酶（ａｎｙｌａｓｅ）、血球凝聚素（ｈｅｍａｇｉｎｔｉｎｉａ）和脂肪氧化酶（ｔｉｐｏｘｉｄａｓｅ）等。以上的分类无论是ＩｌＳ球蛋白还是７ｓ球蛋白都是具有相同沉降系数的混合物。从表１＿２中可以看出Ｂ．伴球蛋自和大豆球蛋白相当于７ｓ和１１Ｓ球蛋白，两者占大豆蛋白质总量的７０％，两者的比例根据品种的不同略有差异。不同大豆品种，大豆蛋白中ｌｌＳ球蛋白和７ｓ球蛋白的比例在０．５～１．７之间变化（Ｗｒｉｇｈｔｅｔａ／．，１９８７）。
表ｌ－２大豆球蛋白的构成成分（李新华等，２００２）
Ｔａｂｌｅｌ－２ＭａｉｎＣｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓｉｎＳｏｙ’ＰｒｏｔＯｎ
１１Ｓ球蛋白是一种异质性的蛋（１ｗａｂｕｃｈｉ，１９９１），分子量在３４０，０００～３７５，０００（Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔ以，１９７６：Ｕｔｓｍｉｅｔａ１．，１９８１）。它是由数个多肽作为亚基，形成一定主体结构，相互结合成１个六聚体蛋白分子。即ｌｌＳ球蛋白是由酸性亚基Ａｎ和碱性亚基Ｂｎ通过Ｓ－Ｓ结合而成（ＡＩｒ＿ｓ．ｓ－－Ｂｎ）（Ｂａｄｌｅｙｅｔａｌ．，１９７５）。６个酸性亚基（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６）和６个碱性亚基（ＢｎＢ：、Ｂ３、Ｂｔ、Ｂ５、Ｂ６）构成两个环状六角形结构，酸性和碱性亚基交互对应形成比较稳定的结
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构形式（Ｓａｉｏｅｔａｌ．，１９７８；ＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａＬ，１９８５）。酸性亚基的分子量在３７，０００－－－４２，０００，碱性亚基的分子蹙在１７，０００－～２０，０００。现在己明确有Ａ１。８２、ＡＩ出】ｂ、Ａ２８１ａ、Ａ，Ｂ４和Ａ５Ａ４８３五种亚基的
存在。这些亚基中６个相组合形成一分子的１１Ｓ球蛋白６ＡｎＢｎ。因此，１１Ｓ球蛋白分子并不是同～种，而是由不同亚基组台而成的集合体。１１ｓ球蛋白的等电点为６．４，其中酸性亚基Ａｌ、Ａ２和Ａ３的等电点为ｐＨ５．１５、ｐＨ５．４０和ｐＨ４．７５；碱性亚基Ｂｌ、Ｂ２和Ｂ３的等电点为ｐＨ８．０、ｐＨ８．２５和ｐＨ８．５（Ｗｏｌｆ，１９９７）。Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ（１９９１ｂ）发现每摩尔ｌｌｓ球蛋白分子中有２Ｍ巯基和２０Ｍ双硫键（ｓ－ｓ）。１１ｓ球蛋白中蛋氨酸含量低，而赖氪酸含量高，疏水的丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸与亲水的赖氨酸、组氩酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的比例为２３．ｓ％比４６．７％（Ｃａｔｓｉｍｐｏｏｌａｓｅｔ以，１９７１）。“ｓ球蛋白具有冷沉的特性，脱脂大豆的水浸出蛋白液在０－ＹＣ水
中放置过夜，约有８６％的ｌｌｓ球蛋白沉淀出来．所以ｌｌｓ球蛋白又称为“冷沉蛋白”。
ｐ伴大豆球蛋白分子（或７Ｓ球蛋白）由ａ、ａ’和Ｂ三种亚基组合而成，是分子量为１８０Ｋｄａ的糖蛋白，含有３．８％的甘露糖和１．２％的氨基葡萄糖。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳分析，三种亚基的相对分子量分别为７１，０００Ｄａ、６７，０００Ｄａ和５０，０００Ｄａ（Ｍａｒｕｙａｍａ“ａＬ，１９９８；Ｔｈａｎｈｅｔａｌ．．１９７８ａ）。从三种亚基的核苷酸序列来推导了它们的氨基酸组成（Ｄｏｙｌｅｅｔａｌ．，１９８６；Ｈａｒａｄａｅｔａｌ．，１９８９；
Ｓｅｂａｓｔｉａｎｉｅｔａｌ．，１９９０；ＭａｒｕｙａｍａｅｔａＬ，１９９８）：Ｃｔ和ａ’皿基均由具有高度同源性的核心区域（４１８的氮基酸残基）和Ｎ珠端富含酸性氨基酸的扩展区域组成（Ⅱ，１２５个氨基酸残基；ｔｔ’。１４１个氨基酸残基）（ＭａｒｕｙａｍａｅｔａＬ，１卵８），而８亚基只有一个保守性很高的核心序列（４１６个氨基酸残基）。Ｎ．末端主要是疏水性氨基酸。Ｆ和ａ核心区域之间的同源性高达９０＊４．二者与Ｂ亚基之间约为７５％，ｎ’和ａ的扩展区域之间约为６０％。从ｑ和Ⅱ’亚基的氨基酸序列计算得到的它们的等电点和疏水性低于Ｂ亚基的（Ｍａｒｕｙａｍａｅｔａ／．，１９９８）。三种距基通过疏水键和氢键连接，形成７种不同的聚合体；Ｂｏ（ａ’ｐ胁、Ｂ１（邮ｐ）、Ｂ２（ｎ’邮）、Ｂ３（ｎ’Ⅱ’∞、Ｂ４（ｎｅｘｔ’）、现（∞旺）和Ｂ６（ｐ阳ＸＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａＬ，１９８５）。各亚基的热稳定性是不同的（ＭａｒＢｙａｍａｅｔａＬ，１９９８）。Ｂ．伴大豆球蛋白的等电点是ｐＨ４．８￣４．９（Ｋｏｓｈｉｙａｍａ，１９６８）。在不同ｐＨ值和离子强度下争伴大豆球蛋白各亚基的表面琉水性、热稳定性、溶解性、热凝聚性和乳化能力有很大差异（Ｍａｒｕｙａｍａｅｔａ／．，１９９９）。
１．２．３大豆蛋白的功能特性
大豆蛋白质是由多种氨基酸缩合而成的，在其分子中含有多种和多数量的化学功能基团，如氨基、羧基、酰基、酰胺基、羟基、硫氢基和二硫基等，因此能发生多种化学反应，这些性质在进行蛋白质分析检测和蛋白质改性研究中具有重要作用。蛋白质的这些性质在食品加工过程中所起到的特殊作用就是通常所指的功能特性。大豆蛋白质的功能特性是多种多样的，它和其他植物蛋白相比，其功能性多、齐全而且突出。这些功能性包括溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性、凝胶性、粘弹性和增稠性等。
大豆蛋白质应用于食品加工中时，在各种条件下的溶解程度和溶解稳定性是加工中首要考虑的问题，而且大豆蛋白质发挥所具有的各种功能特性，首先也要以蛋白质的溶解操作为前提，所以溶解性是大豆蛋白质发挥其功能特性的共同前提。大豆蛋白质的溶解性或溶解度是指处于特定环境下的大豆蛋白质中可溶性蛋白质所占的百分比，常采用氮溶解指数（ＮｓＩ）和蛋白质分散指数（ＰＤＩ）来表示。影响大豆分离蛋白溶解性的主要因素有温度、介质ｐＨ和离子强度等。在ｐｎ７．６的
中国农业夫学坝士学位论文第一章绪论磷酸缓冲液中，ＮａＣｌ浓度低于ｏ．１Ｍ时，１１Ｓ球蛋白的溶解度降低，而ＮａＣｌ浓度高于１．０Ｍ时，
溶解度升高（ＰｅｎｇｅｔａＬ，１９８４）。在较低的ｐＨ下，１１Ｓ球蛋自的溶解度比较敏感，而且当ｐＨ低于６．５时，１ＩＳ球蛋白的溶解度低于７ｓ球蛋白。蛋白质的溶解性对其它功能特性有着密切的关系，如乳化活性等（ＫｉｎｓｅｌｌａｅｔａＬ，１９８５）。利用化学和酶解的方法可以提高蛋白质的溶解性。
大豆蛋白质具有两亲结构，在蛋白质分子中同时含有亲水基团和亲油基团，当它聚集于油
水界面时，使其表面张力降低，促进形成油．水乳化液。形成乳化液后，乳化的油滴被聚集在其
表面的蛋白质所稳定，形成一种保护层，这个保护层可以防止油滴聚集和乳化状态破坏，这就
是大豆蛋白质的乳化稳定性。大豆蛋白的乳化性受蛋白质变性程度和蛋白质组分的影响。大豆
分离蛋白作为表面活性剂来稳定乳化结构，可以防止脂肪的析出，延长某些产品的货架期，如
汤料、香肠等。进一步的研究表明，在ｐＨ２～１０的范围内７ｓ球蛋白的乳化性和乳化稳定性要高
于ｌｌＳ球蛋白（Ａｏｋｉｅｔ以，１９８０）。由于１ｌＳ球蛋白中Ｓ．Ｓ键的存在，使其结构坚固丽乳化性
降低。许多研究表明大豆蛋白的乳化性与溶解性有着相似的特点，即在等电点附近的乳化性晟低。７ｓ球蛋白和１１ｓ球蛋白的乳化性和溶解性具有一定的相关性，这和其分子的电荷性、亲水
性和分子构型有关。而且７ｓ球蛋白含量高的大豆分离蛋白较高乳化能力与较高疏水性相一致（Ｙａｏｅｌａ１．，１９９０；Ｐｅｌｘｕｃｃｅｌｌｉｅｔａ１．，１９９４）。表面疏水性、亲水性及分子稳定性和蛋白质的乳
化能力相关（Ｍａｒｕｙａｍａｅｔａ１．，１９９９）。利用酸和酶加水分解大豆蛋白质。随着分解的进行乳化性
达到最高，接着逐渐下降。这是由于与未变性状态相比，分解使疏水基暴露，进而形成了柔软
结构的缘故。大豆分离蛋白部分水解可以提高其溶解性和乳化能力（Ｋｉｍｅｔ醴，１９９０）＋如胰
蛋白酶水解可增加表面疏水性，提高大豆分离蛋白的乳化能力（Ｏｉｅｔａ１．，１９９７）。通过添加多
糖改变液相介质的流变性质和被蛋白质包裹的油滴的相互作用从而能提高蛋白质的乳化稳定性。蛋白质．多糖分散相可以用做乳化剂，来开发含油量低、营养价值高的食品（Ｘｉｅｅｔａｌ．，１９９７）。
另外，在乳化性增大的同时，稳定性显得尤为重要，其稳定性直接影响着流通期间商品品质的
保持。
大豆蛋白质分子在分散液中表现出较强的界面活性。在一定程度上具有降低界面张力的作用，所以当大豆分离蛋白溶液受到急速机械搅拌时大量混入的气体和水形成界面，大豆蛋白质分子吸附在界面上，降低界面张力，促进界面的形成，就形成了泡沫（Ｇａｒｅｔａ。１９９７）。１１Ｓ球蛋白的起泡性和稳定性优于７ｓ球蛋白，这与ＩＩＳ球蛋白在气相界面上分子排列的紧密度及所带电荷量相关联。大豆分离蛋白进行适度改性可以提高起泡能力，如对大豆分离蛋白进行酸改性（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．．１９９６）、酶解（Ｋｉｍｅｔ０１．。１９９０；Ｑｉｅｔａｌ．，１９９７）和乙酰化（李书国等，２０００）可以提高其起泡能力。，凝胶形成能力是大豆蛋白质重要的功能特性之一，蛋白质凝胶能力作为水、油、糖、风味和其他添加剂的载体在食品应用和新产品的开发中具有重要的作用（Ｋｉｎｓｅｌｌａ．ｔ９７９）。７Ｓ和１１ｓ球蛋白具有不同的结构和凝胶特性（ＳａｉｏｅｔａＬ，１９７８；Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９８５；Ｍｏｒｔ，１９９０）。蛋白质凝胶结构中的作用力包括氢键、疏水键、二硫键及离子作用等。大豆蛋白质中，７ｓ球蛋白和ＩＩＳ球蛋白的凝胶化性质也有差异。经过测定，１１Ｓ球蛋白凝胶的硬度和凝聚性大。凝胶除了具有较高的粘性外，还具有可塑性、弹性等性质。蛋白质的种类和浓度、加热温度和时间、ｐＨ、离子强度和变性剂的作用等各种各样的原因都是影响其粘性以及凝胶形成的因子。为促进凝胶形成，必须使大豆蛋白质的浓度达到７～８％以上，温度达到８０℃以上。另外，离子强度的增加，一般会降
６
中国农业大学颂士学位论文弗一章绪论
低凝胶硬度。凝胶的硬度在等电点附近最低，在酸性（ｐＨ２—３）和碱性（ｐＨｌｌ～１２）的条件下加热形成的凝胶较硬。其保水性和溶解性差不多，也是在等电点处最低。大豆蛋自形成热凝胶韵性质对其他的功能特性也有影响，如弹性、持水性等（Ｈｕｅｔａ１．，１９９２），并且可以改善食品的质地和可接受性（ＰａｒａｓｋｅｖｏｐｏｕｌｏｕｅｔａＬ。１９９７）。Ｓｈｉｍａｄａ（１９８０）等人的研究认为，在８０＂Ｃｍｎ热３０分钟，７ｓ球蛋白形成的凝胶的强度大于分离蛋白，大于ｌｌｓ球蛋白。大豆分离蛋白通常作为食品添加剂应用在肉制品的加工中，如火腿、香肠等，在这些食品中，分离蛋白可以在８０＂（２以下形成凝胶是非常重要的性质，因为高温会影响肉制品的组织状态（ＮａｇａｎｏｅｔａＬ，１９９６）。
１．２．４大豆分离蛋白的加工利用现状
虽然大豆的营养价值很高，但推动半个世纪以来世界大豆增长的动力不是因为对大豆食品的需求而是因为对豆油和用作饲料的脱脂豆粕的需求，从全球范围看，目前每年仅有１０％的大豆生产直接用作食物，其余绝大多数用来加工成豆油和豆粕。可以说在过去的１００年中，大豆食品从未进入西方入的主餐，这一方面是由饮食习惯和文化背景造成的；另一方面是食品工业对大豆食品的研究和开发一直不予重视，投资经费少，市场上的大豆食品风味差。但是自９０年代以来，大豆食品一直未形成产业化、大豆食品工业处于停滞不前的状况有了根本性的转变，大豆食品的发展呈现出猛增的势头。近１０年来，大豆制品一直是全美食品工业发展最快的行业之一，每年以１５－２５％的速度增长，年销售额从９０年代初的８亿美元增加到２０００年的２４亿美元（不包括豆油）。１９９９年１０月２０日，美国食品药物管理局（ＦＤＡ）正式批准了有关每人每天食用含２５克大豆蛋白的低脂膳食，可有效地减少心血管疾病发生的认证申请。这是美国杜邦集团宝利来公司根据其８年的研究工作和１８年临床实验报告以及流行病学调查得出的结果。这一认证的通过对世界大豆的生产和消费带来重大的影响，同时也影响了世界其他国家的大豆市场。目前，在美国市场上的大豆食品，除了传统的豆制品、豆油外，还有大豆蛋白制品，新型大豆食品，大豆强化食品等。其中，大豆蛋白制品发展迅速而且极具潜在消费市场。
国外对大豆分离蛋白的研究始于２０世纪３０年代。目前，主要的分离蛋白厂商在美国和日本。国际上生产大豆分离蛋白最具实力的是ＰＴＩ和ＡＤＭ两公司。ＰＴＩ公司的产品按食品加工需要细分为高乳化型、高分散型、凝胶型等８０多个品种，广泛应用于肉制品、乳制品、面制品、儿童食品、方便食品和冷冻食品等ｌｏ类产品中。ＡＤＭ公司的１８种大豆分离蛋白产品中有高分散性注射肉用，高溶解性调味品用，低糖度乳品饮料用，高乳化性肉汁用及婴儿专用粉等。可见国外大豆分离蛋白产品已经形成～个比较丰富、合理的体系。我国的大豆蛋白工业起步较晚，经过２０多年的发展，虽然已经形成一定的生产规模，但是由于产品质量与国外同类产品相比尚有差距，而且产品品种单一，基本没有功能区别，除用于一般肉制品添加用的高凝胶值大豆分离蛋白外，其他功能性专用大豆分离蛋白，如用于乳制品的高溶解性、高分散性分离蛋白：用于面制品的低凝胶值分离蛋白：用于婴儿配方奶粉及冰淇淋的高速溶、高乳化、低抗原专用分离蛋白等一直未形成生产能力，仍然不能完全满足国内市场的需要。因此，国内大豆分离蛋白的生产急需大力发展、完善。
大豆分离蛋白的提取方法有碱提酸沉法，膜分离方法，双极膜电解法（ＢｉｐｏｌａｒＭｅｍｂｒａｎｅＥｌｅｃｔｒｏａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等（董怀海，２００１）。碱提酸沉法是大豆分离蛋白的传统提取方法，得到的产
７
品蛋白含量可达９０％以上，得率２４～３８％。目前，国内外制取大豆分离蛋白仍多采用这种生产工艺。此工艺，蛋白质变性程度太．而且强碱性条件下长时间处理大豆蛋白，会生成有毒化台物赖氨酰丙氨酸，并降低纯蛋白利用率和大豆蛋白中赖氨酸含量，酸沉中蛋白损失较大，而且产品的功能性质不稳定。用膜分离技术制取大豆分离蛋白，得到大豆分离蛋白产品的蛋自含量可选９５％以上。与传统的碱提酸沉法比较，产物得率高、质量好、能耗少，废水排放污染也一定程度上得到解决，但是膜污染的问题尚未得到很好的解决。
虽然大豆分离蛋白具有自身的功能特性，但由于加工工艺和加工条件的限制，在实际生产中为了得到功能性质稳定、专一的分离蛋白产品。通常要进行蛋白质改性，提高其功能特性，以适应多种食品生产的需要。国外对７ｓ和１ｌｓ球蛋白的分子结构、功能特性、蛋白质修饰技术以及高品质多功能系列大豆分离蛋白产品的生产进行了大量深入细致的研究，并取得了重大成果，属于绝密高科技。我国仅有哈高科大豆食品公司已经研制开发出了处于国拇领先地位的肉制品专用型大豆分离蛋白。
改性中常用的方法有物理改性、化学改性、酶改性和生物工程改性。对于蛋白质的改性技术已经有很多研究报告和成果，Ｆｒａｎｚｅｎ等人（１９７６）对大豆蛋白进行了琥珀酰化和乙酰化改性：Ｈｉｒｏｔｓｕｋａ等人（１９８５）用ＰＯＣｌ，修饰大豆蛋白以改善其功能特性，经过磷酸化改性的大豆分离蛋白乳化性、持永性和溶解往有显著提高ｉＰｕｓｋｉ（１９７５）研究了用蛋白酶改性大豆蛋白的功能特性等等。实际上，７ｓ和１１ｓ球蛋白本身具有不同的功能特性，如７Ｓ球蛋白有较好的乳化性，１１Ｓ球蛋白的凝胶性强，同时生产中需要的是专用型分离蛋白，熟用于灌肠类产品对需要高凝胶值专用分离蛋白，用于乳制品时需要高乳化性专用分离蛋白。所以，如果在分离蛋白生产中能充分发挥７Ｓ或１１Ｓ球蛋白的功能特性，进一步对富含７ｓ组分或富含ｌｌＳ组分的分离蛋白分别进行改性，就可以有针对地、专一地强化７ｓ或ｌｌＳ球蛋白本身的功能特性，提高产品的专用化程度，解决产品性能不稳定的问题。
本课题从大豆蛋白各组份在不同ｐＨ值和离子强度下溶解度不同的特点出发，应用物理沉降的方法，即在加工时按各组分的特性将７Ｓ和ｌｌＳ球蛋白分离，得到的富含７ｓ组分和富含ｌｌＳ组分的分离蛋白产品。再用物理、化学或酶改性的方法对富含７Ｓ组分或宦含ｌｌＳ组分的分离蛋自分别进行改性，生产出低变性、功能性质稳定的高品质的专用型大豆分离蛋白。这样，大豆分离蛋白企业将会增加产品品种、扩大产品的应用范围以获取更大的经济效益。因此，该研究成果对推动我国大豆分离蛋白提取技术进步的发展具有重要的现实意义。
中幽农业大学硕士学位论文第二章富含７ｓ组分和富含１１Ｓ组分分离蛋自的调制第二章富含７Ｓ组分和富含１１Ｓ组分分离蛋白的调制２．１前言
７ｓ和ｌｌＳ球蛋白是两种主要的大豆贮藏蛋白，由于它们具有不同的结构和功能特性，如溶解性、疏水性、凝胶性、起泡性和乳化性等，所以在食品和非食品加工中大豆蛋白产品发挥各自不同的作用。Ｗｏｌｆ（１９６２）等人首先利用冷沉和硫酸铵分级的手段得到纯度９１＊／ｏ．－，９３％的１ｌＳ球蛋白，同时还研究了影响１ＩＳ球蛋白的得率和纯度的因素，如抽提率、温度、ｐＨ、盐和糖的含量以及还原剂（Ｂ．巯基乙醇，２－ＭＥ）等ＣＯ／ｏｌｆｅｔａ／．，１９６７）。Ｋｏｓｈｉｙａｍａ（１９６５）报道了１１Ｓ球蛋白和７ｓ球蛋自的分离方法：ｎｓ球蛋白首先被冷沉，然后加入０．０２５ＭＣａＣｈ除去剩余的冷沉蛋白，将ｐＨ调节到４．５将７ｓ球蛋白沉淀后通过凝胶过滤得到均一的７ｓ球蛋白。Ｔｈａｔｄａ（１９７５、１９７６）等人根据在ｐＨ６．１“．６之间７ｓ和１１Ｓ球蛋白溶解度不同的特点，提出了直接分离两球蛋白的方法。用含有１０ｒａｍｌ３－巯基乙醇的＂Ｉｒｉｓ缓冲液（ｐＨ８．Ｏ）萃取蛋白，将ｐＨ调到６．４，在２—５℃下离心，得到的沉淀即为１１Ｓ球蛋白；在ｐＨ４．８下，７Ｓ球蛋白被沉淀，将得到的沉淀溶于ｏ．０３ＭＴｄｓ缓冲液中，调ＤＨ到６．２后在３－５＂Ｃ下冷藏过夜。除去不溶性组分，得§ｄ纯度较高的７ｓ球蛋白。这种７ｓ和１１Ｓ组分分离的方法沿用了很多年，但两种组分中都有交叉成分，１１Ｓ组分中含７９％大豆球蛋白，７ｓ组分中含５２％Ｂ．伴大豆球蛋Ｉ刍（１ｗａｂｕｅｈｉｅｔａｌ．，１９８７）。所以Ｔｈａｎｈ的方法要求其他的手段，如凝胶过滤、亲和层析等来进一步纯化。Ｎａｇａｎｏ（１９９２）等人改进了Ｔｈａｎｈ的方法．通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对得到的７ｓ和ｌｌＳ组分分析结果表明纯度大于９０％。但这些分离方法仅限于实验室分离和用于研究，难以应用于大规模生产。因此，需要研究可以用于实际生产中的组分分离技术，应用于食品或非食品的加工利用中。本实验研究了不同ｐＨ值和离子强度下蛋白质抽提过程中蛋白质的溶出形态，探讨了按７ｓ和ｌｌＳ组分分离来调制大豆分离蛋白的工厂化方法。
２．２实验材料
２．２．１实验材料及主要试剂
实验材料：低温脱脂豆粕，由哈尔滨高科技有限公司提供。
主要化学试｛ｆＩＩ：氢氧化钠、盐酸、亚硫酸氢钠、氯化钠、甘油、脲、甲醇、三氯乙酸、浓硫酸、乙醇、溴酚蓝、丙烯酰胺、过硫酸铵、硫酸钾、硫酸铜、甲烯蓝、乙醇、甲基红、硼酸、硫酸铵等均为北京化学试剂公司分析纯产品：十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、争巯基乙醇（２－ＭＥ）、甘氨酸为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｎ，Ｎ’．甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）为Ｆｌｕｋａ公司产品；＇ＩｒｉｓＢａｓｅ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）；考马斯亮蓝（ＣＢＢ）Ｇ－２５０为香港ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
中国农业大学颤士学位论文第二章富含７ｓ组分和富含ＩＩＳ组分分离蛋白的调制产品。
２．２．２主要仪器设备
名称
咖啡研磨机
高速台式离心机
台式离心机
高速冷冻离心机
酸度计
恒流泵
稳压稳流定时电泳仪
电泳槽
紫外可见分光光度计
脱色摇床
干胶仪
冷冻干燥机
恒温磁力搅拌器
水浴恒温磁力搅拌器
电热鼓风干燥箱
万分之一电子天平
千分之一电子天平
循环水真空泵
商速分散器
喷雾干燥机
电子调温电热套２．３实验方法２．３．１，蛋白质提取
型号
ＵｒｂａｎｅＴＳＫ—Ｕ９２８５
ＴＧ０１６Ｃ
ＴＤＬ－４０Ｂ
ＯｐｔｉｍａＬｅ－８０Ｋ
ＰＨＳ－３Ｃ
ＨＬ．２
ＤＹＹ＿１１１８Ｂ
ＭＯＤＥＬＢＥ－２１０Ｎ
ＳｐｅｃｍｎｎＳＰ－２１００ＵＶ
ＴＳ一１
ＨＲ．Ｇｌ
Ｈ）．１
９０—１型
ＳＨＪ—Ａ
ＤＨＧ－９１４０Ａ
ＡＹ２２０
ＧＦ－３００
ＳＨＢ．Ⅲ
Ｔ１８ｂａｓｉｅ
ＥⅦＩ．ＡＳＤ－ｌｏｏＯ
９８－１－Ｂ
产地
上海灿坤实业有限公司
上海安亭科学仪器厂
上海安亭科学仪器厂
Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳＡ
上海虹益仪器厂
上海沪西分析仪器厂
北京六一仪器厂
ＢＩＯ－ＣＲＡＦＴ，ＪＡＰＡＮ
上海光谱仪器有限公司
江苏海门市麒麟医用仪器厂
北京华瑞
北京博医康技术公司
上海沪西分析仪器厂
金坛市华峰仪器公司
上海一恒科技有限公司
ＳＨＩＭＡＤＺＵ，ＪＡＰＡＮ
ＡＮＤ，ＪＡＰＡＮ
郑州市上街华科仪器厂
ＩＫＡ，广州
ＥＹＥＬＡ，ＪＡＢＵＮ
天津泰斯特仪器有限公司
分别称取两份相同质量的脱脂豆粕，一份与蒸馏水以１：１５（ｗ／ｖ）的比例混合，调整ｐＨ值至８．０，并在恒温磁力搅拌器上以低速搅拌，抽提１小时后，脱脂棉过滤除去豆渣，得到的提取液再以２，０００ｒｐｍ的转速离心ｌＯｍｉｎ去除底部的不溶性部分，得到提取液Ａ。另一份与蒸馏水以１：１５（ｗ／ｖ）的比例在中性条件下抽提１小时，用少许消泡剂消除泡沫，脱脂棉过滤除去豆渣，进一步再以２，０００ｒｐｍ的转速离心ｌＯｍｉｎ去除底部的不溶性部分，得到提取液Ｂ。
１０
２．３．２蛋白质粒子分布分析
Ａ．蛋白质溶液的制各
脱脂豆粕与蒸馏水以１：１５（ｗ／ｖ）的比例在中性条件下抽提ｌ小时，用少许消泡剂消除泡沫，脱脂棉过滤除去豆渣，得到的提取液再以２，０００ｒｐｍ的转速离心１０ｍｉｎ去除底部的不溶性部分。将提取液分为两组（Ｉ＆ＩＩ），分别调整ｐＨ和离子强度。Ｉ组：分别取９份１０ｍｌ提取液在Ｏ．０５的离子强度下用０．ＩＮＮａＯＨ或ｏ．１ＮＨＣＩ准确调整ＤＨ至４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５和８．ｏ；ＩＩ组：分别取１７份１０ｍｌ提取液在ｐＨ５．５的条件下调整离子强度为０、Ｏ．０ｌ、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５和２．０。
Ｂ．超高速离心分析
参考分析豆乳中蛋白质粒子分布的超高速离心分析的方法（Ｏｎｏｅｔａｌ．，１９９１；Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９９９）采用１５６，０００９，３０ｍｉｎ，４℃的条件对上述各提取液进行离心分析。沉淀部分为大于５０ｎｍ的大粒子；上清液部分为小于５０ｎｍ的小粒子（溶液）。
２．３３可溶性蛋白质含量测定
以牛血清蛋白（ＢＳＡ）为标样，采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ（考马斯亮蓝Ｇ－２５０蛋白质染色）的方法０３ｒａｄｆｏｒｄ，１９７８）测定经过超高速离心分析后上清液中的蛋白质浓度。以离心后的上清液在５９５ｎｍ处的吸光度与未经离心的蛋白质溶液的吸光度的比值来计算可溶性蛋白质（小粒子）所占的比例。
２．３．４十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｃｃ可ｌｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）（郭尧君，１９９９）
Ａ．样品处理
称取０．０１９待分析的样品于１．５ｍｌ刻度离心管中，加入Ｏ．５ｍｌ含有２０％甘油、Ｏ．２％ＳＤＳ、ｏ．０６３ＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、６Ｍ脲的样品处理液，并添加蒸馏水使总体积为１．０ｍｌ，使样品中蛋白浓度为Ｏ．２％（ｗ／ｖ）。然后添加２０Ｉ＿ｔｌ｝巯基乙醇（２－ＭＥ）和２０ｍ饱和溴酚蓝０３ＰＢ）溶液，充分混合均匀，在室温下放置一夜后进行电泳。
Ｂ．电泳
’
凝胶贮液浓度为３０％，交联度为２．７％。分离胶含０．４％ＳＤＳ，０．３７５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８），胶浓度１２．５％，交联度２．７％。浓缩胶含０．４％ＳＤＳ，Ｏ．１２５ＭＴｄｓ－ＨＣＩ（ｐＨ６．８），胶浓度４％，交联度２．７％。电泳缓冲液体系为含０．１％ＳＤＳ，５ｍＭＴｆｉｓ－ＨＣｌ，３８，４ｍＭ甘氨酸缓冲液体系。在厚度为ｌｍｍ的垂直电泳板上进行不连续电泳，样品的加样量为５１ａｌ。电泳过程中，浓缩胶部分保持电流１５ｍＡ，进入分离胶后，电流为２５ｍＡ。电泳结束后，将胶片用含有３３％甲醇和１２％三氯乙酸（ＴＣＡ）的固定液固定４小时，然后用考马斯亮蓝（ＣＢＢ）Ｇ－２５０染色液（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙｅｔａｌ．，１９７７）（含有１．０５ｍＭＣＢＢＧ－２５０，１．０Ｍ硫酸，１０ＭＮａＯＨ，１２％ＴＣＡ）染色３小时。染色结束后，用蒸馏水对胶片进行洗脱，直至底色基本脱去为止。
中国农业大学颐士学位论文第二章富含７ｓ组分和宫舍ｔＩＳ组分分离蛋白的调制Ｃ．胶片保存和分析
将脱色后的胶片用真空千胶仪在５０＂（２干燥２小时左右，保存干燥后的胶片，并采用ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ软件对胶片上染色的蛋白谱带进行光密度扫描分析。染色强度和蛋白质浓度成线性关系，可以根据扫描图中染色浓度值计算各种蛋白质的相对含量。
２．３．５总蛋白质含量的测定
采用微量凯氏定氮法（ＡＡＣＣ，１９８５）对低温脱脂豆粕和调制的大豆分离蛋白进行蛋白质
含量测定。
Ａ．样品前处理：将样品（豆片研磨成粉末状）置１０５＂Ｃ烘至恒重。
Ｂ．硼酸一指示剂混合液的配制：Ｓ０ｍｔＯ．１％甲烯蓝乙醇溶液与２００ｍｌＯ．１％甲基红乙醇溶液混
合后配成指示剂，贮于棕色瓶中备用。取１００ｍｌ２％硼酸溶液，滴加ｌｍｌ混合指示剂。
Ｃ．样品消化：准备４个ｆｉｏｍｌ凯氏烧瓶（每个样品傲两个平行），将样品准确称入凯氏瓶中，
加入约３００ｍｇ硫酸钾一硫酸铜混合物，３ｍｌ浓硫酸。将烧瓶置于调温电炉上进行消化，直到烧
瓶中的消化液变为澄清透明的淡蓝色，继续消化２小时左右（加热时。溶液微沸．通风厨抽气）。
消化结束后，将烧瓶放于通风处冷却。
Ｄ．蒸馏：将凯氏烧瓶中的消化液定量转移到反应宣中，为了避免消化液沾在烧瓶口，可在烧瓶下口涂一层薄凡士林，转移后用少量蒸馏水冲洗烧瓶，将冲洗液也转移到反应室中。加入约
１０ｍｌ４５％氢氧化纳，反应室中的溶液变为黑色即可。关闭缓冲室的夹子，加火开始蒸馏。取５ｍｌ硼酸一指示剂混合液于一锥型瓶中来接收蒸馏液，特锥型瓶中的溶液变为绿色后蒸馏５ｍｉｎ，移开锥型瓶，继续蒸馏ｌｍｉｎ，此溶液用于滴定。洗涤反应室。
Ｅ．滴定：用标定好的０．０１００ｍｏｌ／Ｌ的盐酸滴定蒸馏液至绿色变为粉红色。
Ｆ．重复以上实验过程２次，取平均值。
Ｇ．蛋白质含量的计算：
蛋白质含量（％）＝皇些竺‰望矗掣×１００％
（式２－Ｉ）
』一滴定样品用去的盐酸平均ｍｌ数。
口滴定空白用去的盐酸平均ｍ１数：
ｃ－称量样品的ｇ数
１４瘤ｌ的原子量
６．２５一系数
１２
２．４结果与分析
２．４．１提取液中蛋白质粒予的存在状态
Ｏｎｏ（１９９６）等人在研究豆奶时将溶出的蛋白质按粒子直径大小进行了分级：直径大于４０ｒｉｍ的为粒子；直径小于４０ｒｉｍ的为小粒子（或称为可溶性部分）。本实验研究了中性和碱性两种提取条件下溶出蛋白质的存在状态，并按粒子直径５０ｒｉｍ进行分级，结果见表２－Ｉ。
寰２－１中性攫取条件和蕞液摄取的方式下叠白质粒子分布的比较
Ｔａｂｌｅ２－ＩＳｉｚｅＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＳｏｙＰｒｏｔｅｉｎＰａｒｔｉｃｌｅｓＥｘｌＴａｅｔｅｄＩｎＮｅｕｔｒａｌｐＨａｎｄＢａｓｉｃｐＨ
中性提取碱液抽提５ｌ
９０
４９
１０
从表２?１可以看出，在ｐＨ值８．０的碱性条件下，大豆蛋白质９０％以可溶性（直径小于５０ｈｍ）
的形态被抽提出来，而以中性条件抽提蛋白质时，只有５０％左右的蛋白质以可溶性的形态被抽提出来，其余的蛋白质则以粒子（直径大于５０ｈｍ）的形态存在于提取液中。进一步用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析了两种提取方式得到的蛋白质粒子的组成，结果见图２－１。
田２－１中性条件提取和碱液抽提的方式下蛋白质粒子的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圈请Ｆｉｇｕｒｅ２－１ＳＤＳ－ＰＡＧＥＰａＲｅｒｎｏｆＳｏｙＰｒｏｔｅｉｎＰａｒｔｉｄＨＥｌ订－ｃｔｅｄＩｎＮｅｕｔｒａｌａｎｄＢａｓｉｃＣｏｎｄｉｔｉｅｎ
Ｌａｕｅｌ标准大豆蛋白，Ｌｕｅ２ｔ藏抽叠大豆蛋白粒子．Ｌａｎｅ３中性条件挺取大豆蛋白可涪性胡舟。
Ｌａｎｅ４中性斛提取丈豆蛋白粒子部分
中置农业大学硬士学位论文第二章富含７ｓ组分和富含１ＩＳ组分分离蛋白的调翻——■—■■——■■■—■■—■■●一Ｉ■—●■——■—●■■—■—■—■■■——■■—■——●●■■■■■■—■—■●■■■■——●———●■■●一
田２．３ｐＥ［４．０崮７．５时经超膏蕾鼻心后提取液中可溶性部分ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圈谌
Ｆｉｇｕｒｅ２－３ＳＤＳ－ＰＡＧＥＰａｔｔｅｒｎｏｆＳｏｌｕｂ］ｅｎ－出∞ｉｎＳｏｙｍｉｌｋ
ＢｙＵｉｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｐｆｌｏａａｔｐＨ４．０—７．￥］Ｒａｎｇｅ
Ｉ．时１标麓夫置■自．Ｌｉｍｅ２ｐＨ４－０?Ｌａｅ３ｐＨ４５?Ｌａｍｅ４ｐＨｓ．ｏ．Ｉ．－ｎｅ５ｐＨ＆Ｓ．
］ｌａｎｅ‘ｐｈｉ０，ｌ?Ｍ７ｐｌｌ‘＾Ｌ．ｎＩｔｍＴ．ｏ，Ｌ－Ｈ９ｐＨＭＣ■于重直Ｏ．ＯＳＭ）
图２＿４是对应于各ｐＨ下粒子部分组成的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱。从图中可以看出，随着ｐＨ的增大，粒子部分的组成发生了变化。进一步利用光密度扫描分析对构成组分分析结果表明，在ｐＨ４．０－－４．５时，粒子部分的组成和大豆蛋白的标样相同；在ｐＵＳ．Ｏ－６．０时，粒子部分中ＩＩＳ的比
例增大，约占９０％．以上结果表明，进一步地调整提取液的ｐＨ，可以促进ＩＩＳ和７ｓ的解离和聚合，形成不同形态的蛋白质粒子，有利于组分分离。
圈２－．ｐＨ４．Ｏ囊７．５耐经起膏逮膏心看扭取液中较－Ｔ－ａｓ＇翁＂ＳＤＳ－ＰＡＧＥ瞄谱
Ｉ艳＿ｎ２－４ＳＤＳ－ＰＡＧＥＰａｔｔｅｒｎｏｆＰａｒｔｉｃｌｅｓＦｒａｃｔｔｅｎｉｎＳｏｙｍｉｌｋ
ｅｙＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｔｆｕｇａｔｔｏｎａｔｐＨ４．０～７．５Ｒａｎｌｌｅ
Ｌａｎｅｌ掌准大互■白?Ｌａｎｅ２ｐｍ．Ｏ，Ｉ蛐３ｐＩ］１４ｊ，Ｉ＾Ｋ４ｐ目Ｅ５ｍｈＮ５ｐｌ眠５?］Ｌａｎｅ６ｐＨ６．０，
１５
２．４Ｊ蛋白质抽提过程中蛋白质粒子在不同离子强度下的分布情况
有研究表明，在０，－２＂Ｃ的条件下，ｐＨ值为４．６时，各蛋白质成分的溶解度随离子强度的变化有相当大的差距：１１Ｓ随离子强度的增加而成可溶性；而７Ｓ当离子强度达到０．８前几乎不可溶。而且，钙离子有专门沉淀ＩｌＳ组分的趋向，利用高浓度ＣａＣｌ２溶液可将７ｓ组分有选择地萃取出来（ｓａｉｏｅｔａｌ，，１９７３）。本实验进一步分析了提取液在ｐＨ５．５时，不同离子强度条件下的蛋白质粒子的分布，结果见图２－５。
誊
晕基
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离子强度（ＩⅢ）
叠２＿５不同■予薯虞下攫取箍率■自度粒子的分布情况
Ｆｉｇｕｒｅ２－５ＳｉｚｅＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＳｏｙＰｒｅｔｏｉｍＰａｔｔｉｃｌｅ目ｔｉｎＳｏｙｍｉｌｋａｔＶａｒｉｅｍＩｏｎｉｃＳｔｒｅｎｇｔｈ
从图中可以看出，离子强度从０到０．３Ｍ，蛋白质可洛性部分的比例里显著增加的趋势，从３％到１１％。当离子强度高于０．３Ｍ时，蛋白质中的可溶性部分增加的程度不明显。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析了离子强度在ｏ－ｏ．３Ｍ的提取液中可溶性部分和粒子部分的蛋白质组成，其结果见图２－６、图２．７和图２－８。
田２－６膏子量度从０翻０．２０Ｍ提取藏中可蘑性蕾分ＳＤｓ＿ＰＡＧＥ圈谱
Ｆｊ誓－托２－６ＳＤＳ－ＰＡＧＥＰａｔｔｅｒｎｏｆＳｏｌｕｂｌｅＦｒａｃｔｉｏｎＢｙＵｌｔｒａｃｅａｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎＳｏｙｍｉｌｋ
ｔｏ吣０Ｍ
ａｔＩｏｎｉｃＳ奸¨ｇｔｈｆｒｏｍＯ
ｌｉｎｅｌ膏于■鹰０．２０Ｍ。Ｌａａｅ２膏予曩鹰Ｏ．１５Ｍ。Ｌａｎｅｓ膏于薯ｔｔ８．１０Ｍ．Ｌａｎｅ４膏于曩廑Ｏ．０５Ｍ
Ｌａｍｅ５膏予曩应Ｏ．ＯＩＭ－ｈ耻６■于量度０－工．帅７标准■自‘ｐＨ均为曼５）
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