实验九植物原生质体的分离和培养
实验目的
掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。
实验原理
原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。
植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。
分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。
实验用品
一、材料
1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。
2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。
二、器材
超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45μm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。
三、试剂
1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏水。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），
PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~
6.2。
6. 酶液A
纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％
果胶酶(13ectinase，Serva) 1 %
(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。)
甘露醇0.6 mol／L
CaCl2·2H2O 0.05 mol／L
MES 0.1％
pH 5．8～6．2 7．酶液B
纤维素酶(Onozuka R-10) 2％
离析酶(Macerozyme R-10) 1％
半纤维素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2％
甘露醇0.4 mol／L CaCl2·2H20 0.1％
MES PH5.8～6.2 8．DPD培养基(表22-1)
表22-1 DPD培养基
9．C81V培养基(表22-2)
表22-2 C81V培养基
10. 0.1％酚藏花红(配在0.4 mol／L甘露醇中)。
11. 0.01％荧光增白剂(配在0.3 mol／L甘露醇中)。
(3、4、5用高压灭菌，6、7、8、9用过滤灭菌。)
实验方法
一、叶肉原生质体的分离和培养
1. 取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进行)。
2. 将叶片在0·1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水
漂洗5次
3. 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小心用镊
子撕去下表皮。
4. 将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每10ml酶
液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。
5. 将培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3 。在倒
置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。
6. 将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组
织。
7. 将滤液分装在刻度离心管中，用600r／min的速度离心5min，使原生质体沉淀下来。
8. 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O中。
9. 用注射糙生长针头)向离心簧生部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min下离心
5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂
质，碎片将沉到管底。
10. 注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。
11. 离心管中留下的纯净原生质体用8ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O悬浮。离心离心5min，
吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。
12. 将收集的原生质体悬浮在适量DPD培养基中，将其密度调整到5X104／m1左右(可
用血细胞计数板统计原生质体的密度)。
13. 用皮带头的刻度移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放2m1。
14. 用石蜡膜带封口。置26℃左右条件下进行暗培养。
二、愈伤组织原生质体的分离和培养
1. 胡萝卜松软愈伤组织的诱导和保存
(1) 取田间生长两个月左右的植株的根，用自来水冲洗干净。
(2) 在70％酒精中浸泡2min，取出后放在0.1％升汞溶液中浸泡10min。再用灭菌蒸
馏水换洗5次。
(以下操作在超净工作台上进行)
(3) 在大培养皿中用解剖刀切取根中央部分，并切成3～5mm厚的横切片。
(4) 将切片摆放在含2mg／L 2，4-D、0.2mg／L激动素和500mg／L。水解酪蛋白的
MS培养基上。在26℃左右条件吓进行暗培养，诱导愈伤组织。
(5) 培养2周以后，用镊子将外植体周围形成的愈伤组织取下转移到新鲜培养基上。
(6) 连续继代培养多次，每三周转移一次。待愈伤组织成为松软状态便可用于分离原
生质体。
2. 取转代培养一周左右，并处于旺盛生长期的愈伤组织，直接放在酶液B中，每10ml酶
液放2g左右。在室温下保温过夜，或26℃下保温6h以上，直到产生足够量的原生质体。
3. 将酶解后的原生质体悬液用不锈钢网筛过滤，除去未完全消化的组织。
4. 向过滤液中加入等体积的0.16 rnol／L CaCl2·2H2O溶液，混合之后转移到带盖离心管
中。
5. 吸去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.16 rnol／L CaCl2·2H2O溶液中。
6. 用注射器向离心管底部缓缓注入12％蔗糖溶液6ml，然后离心5～10min。两相溶液界
面间应出现纯净原生质体带，管底出现杂质沉淀。
7. 将注射器插入管底，吸出沉淀的杂质。并吸出下部蔗糖液及上部钙液。
8. 用0.16 mol／LCaCl2·2H2O悬浮，离心一次，再用C81V培养基如法洗涤一次。
9. 用C81V培养基培养，其操作同叶片原生质体培养。
三、培养结果观察
1．活力检查
凡是活力的原生质体均呈现圆球行，在显微镜下可观察到明显的胞质环流运动。
在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流。可取一滴原生质体悬液放在载波片上，加一漓0.1％酚藏花红溶液，凡生活的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即着染成红色。
2. 细胞壁再生的观察
培养24～28h后，大部分原生质体已再生新壁。并且体积增表，变成椭圆形。可用以下方法别细胞壁的再生。
（1）取一滴原生质体培养悬液放在载波片上，加一滴高浓度（25％）蔗糖溶液，有壁的细胞将发生质壁分离。
（2）取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加一滴0.01％荧光增白剂溶液。在荧光显微镜下，当用366nm波长的紫外光照射时，细胞壁将发黄绿色荧光。
3. 细胞分裂的观察
培养4天以后，将出现第一次分裂，可在倒置显微镜下观察。在培养8～10天后，应统计分裂频率，即出现分裂的原生质体占成活原生质体的百分率。
一般在细胞团形成后(大约在培养的15~20天)，应向培养瓶中补加渗透剂减半的新鲜培养基，以促进细胞团的增殖。待小愈伤组织形成后，转移到固体培养基上，进行植株分化的条件试验。
思考题
1. 酶解液以及原生质体起始培养液中，为何要保持较高的渗透压？
2. 为何在培养一段时间后，需向培养瓶补加降低渗透压的新鲜培养基?
3. 如何判断分离原生质体的活力和新壁再生?
金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后LH、右前RF、右后RH编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 （2）泄殖腔拭子 以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 首次分离时，将样品在6.5%NaCl营养肉汤中，45℃，18-24小时预增菌进行选择性培养后，将上述培养物以划线方式接种在肠球菌选择性培养基（叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基，BEA）上，37℃，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取灰色，半透明，1-2mm大小的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在BEA琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 需要注意的是由于BEA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生，因此，可以将肠球菌疑似菌株在BEA琼脂上进行二次筛选，提高分离准确率。
植物原生质体的分离及融合 生93沈睿2009012372同组：古梦婷 实验日期：2011年11月2日 一．实验原理 1.原生质体分离 原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。 2.原生质体融和 诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体融和。 PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。 PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤 1.原生质体的制备 （1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。 （2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。 （3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。 （4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。 （5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。 （6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。 （7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。（8）蔗糖漂浮方法： 取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。配平后在700rpm下离心5min。用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。 2.PEG融和
病原菌分离方法 一、实验原理： 植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。 二、实验用具： 酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等 三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。 （2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。 （3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。 四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定） （2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸） （4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基 约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培 养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝
植物原生质体相关材料 2013-9-2 From HZB 一、植物材料 研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。 但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。 1. 细胞悬浮培养物 在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织： 取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。 2. 叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的： （1）光强为3000-6000lx。 （2）温度为20-25℃培养。 （3）相对湿度在60％-80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。 3. 植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。 例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。 二、酶 1. 酶的种类 构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等）、果胶质、半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。 2. 渗透稳定剂
植物原生质体培养方法 1 植物原生质体培养的简史 植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。 2 原生质体培养方法 2. 1 液体培养法 2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture) 这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。 2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture) 微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。 2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed) 固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。 2. 3 液体2固体结合培养 2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer) 这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,
第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg ／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时
原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。
原生质体融合技术的局限性 植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。 植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。 原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。 1.技术局限性 植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。 1.1诱导原生质体融合 诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。 而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。 1.2杂种细胞的选择 为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法： 1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来； 互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。 1.2.2机械选择法 利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异
普通植物病理学 实验十七、病原菌得分离培养与纯化 一、目得要求 (1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。 (2)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。 二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜得生活条件，即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其她菌生长得环境.从而得到纯菌株。植物病原頁?菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。最常用得方法就是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量砲子得病原真菌得分离。病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌得纯培养，必须要进行分离菌得纯化，纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1?材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyric u 1 a r ia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum t urcicum)0 ⑶玉米弯抱菌叶斑病叶(c u r v u lar i a 1 u n ata)。 (4 )玉米小斑病叶(bipo 1 aris may dis)。 (5)番茄灰霉病果(botryt i s cinefc a )。 (6 )黄瓜菌核病果(sclerotinia s c I erotio r um)? (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pscu d omo n as syringa e p v .lac h r y mans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xant h o mo n as canipc s tmspv、o r y eue)o
实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。 三．难点：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容: 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，
1引言 原生质体融合
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/c913925847.html, 植物原生质体融合方法的研究进展 作者：李琦 来源：《种子科技》2018年第06期 摘要：原生质体融合（protoplast fusion）是指通过物理或化学方法使两个细胞的原生质体进行融合，经培养获得具有双亲全部或部分遗传物质后代的方法。应用植物原生质体融合技术，可以克服远缘杂交不亲和的障碍，打破物种之间的生殖隔离，扩大杂交亲本范围，实现基因在物种间的转移和遗传重组，培育新品种和创造新物种。主要就植物原生质体融合的方法进行了阐述。 关键词：植物原生质体；融合方法；研究进展 文章编号： 1005-2690（2018）06-0038-02 中图分类号： Q943 文献标志码： A 原生质体是组成细胞的一个形态结构单位，原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液，在一定条件下培养一段时间后，发现大部分细胞的细胞壁被降解，从而制备出大量有活力的原生质体。 1 原生质体融合的目的及意义 原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力，使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合，进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞，克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。另外，可转移优良的生物性状，实现基因重组，而改良现有品种。目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等，还可按照人们预先的期望创造出新物种。 2 原生质体的融合方法 2.1 自发融合 在酶解细胞壁形成原生质体的过程中，相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体（homokaryon）。每个同核体内可包含两个或多个核，这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中，大约有50%是多核融合体。 2.2 高pH-高Ca2+法
病原菌的分离培养方法 一、基本原理 植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。 植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。 为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例） 1.分离的准备工作 （1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。 （2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。 2.组织分离法 （1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 （2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境； （3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。 （选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。 腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑 点病害应在临近健全组织的部分分离。）
酵母原生质体融合 ××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。 原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。 两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。 本实验将通过酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70的融合，以期获得具有更高发酵效率的酿酒酵母新品种并应用于制酒工业，在节省酿酒粮食的投入量前提下提高发酵产量。以期获得更好的经济价值。 1.材料与方法 1.1 材料
细胞工程 实验六植物原生质体的分离与融合 实验概要 本实验介绍了原生质体分离的方法及利用PEG原生质体融合的原理和方法。 实验原理 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法时原生质体培养中最基础也是最关键的环节。PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 主要试剂 1. 20%蔗糖； 2. 13%CPW洗液：
春季传染病病原菌的采集、分离和纯培养 实验方案 化药1104 赵金金
病原物的分离和纯化 摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在PDA培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。 关键词：分离培养、炭疽病、PDA培养基、灭菌 前言 柯赫氏法则(Koch’s Rule)又称柯赫氏假设(Koch's postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同”【1】。 如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家