园艺学报，（）：– 2014411121962207 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@https://www.doczj.com/doc/c715447819.html,
收稿日期：2014–07–08；修回日期：2014–10–10 基金项目：国家自然科学基金项目（31201592）
梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析
蒋 爽，蔡丹英，滕元文*
（浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058）
摘 要：基于生物信息学方法对‘酥梨’基因组中不同类型的逆转录酶进行预测，共获得345条copia 类和99条gypsy 类逆转录酶。通过系统聚类，copia 类逆转录酶可分为Ivana 、Ale 、TAR 、Angela 、Maximus 和Bianca 等6类；gypsy 类逆转录酶可分为Athila 、Tat 、CRM 、Reina 和Tekay 等5类。序列比对结果显示梨中逆转录酶具有较高的异质性，copia 类逆转录酶序列分歧度为0.44，gypsy 类为0.38。挑选出8类逆转录酶设计引物，并对梨属其它植物进行PCR 扩增，结果显示这8类逆转录酶广泛存在于梨属植物中。在砂梨品种‘圆黄’的叶片、种子和果实中均发现该8类逆转录酶存在一定的转录水平，这是首次发现在梨属植物正常生长组织中逆转录酶发生转录。
关键词：梨；Ty1-copia ；Ty3-gypsy ；逆转录酶；预测
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X （2014）11-2196-12
Prediction ，Evolution and Expression Analysis of Reverse Transcriptase of LTR Retrotransposons in Pear
JIANG Shuang ，CAI Dan-ying ，and TENG Yuan-wen *
（Department of Horticulture ，The State Agricultural Ministry Laboratory of Horticultural Plant Growth ，Development & Quality Improvement ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，China ）
Abstract ：Different types of reverse transcriptase （RT ）sequences in the whole genome of Pyrus pyrifolia white pear group ‘Suli ’were predicted by bioinformatics methods. A total of 345 RT sequences were obtained from copia group and 99 RT sequences were from gypsy group. The cluster analysis indicated that there were six lineages （Ivana ，Ale ，TAR ，Angela ，Maximus and Bianca ）in copia group and five lineages in gypsy group （Athila ，Tat ，CRM ，Reina and Tekay ）. Sequence alignment showed a high heterogeneity in both copia group and gypsy group ，and the divergence of RT in both groups was 0.44 and 0.38，respectively. Eight types of RT were selected to design primers ，each pair of primers showed clear amplified bands by PCR using genomic DNA of other Pyrus species. Eight types of RT were expressed with different levels in leaves ，seeds and fruits of ‘Wonhwang ’pear ，which was the first report on the expression of RT in the organs of pear trees under normal growing condition.
Key words ：Pyrus ；Ty1-copia ；Ty3-gypsy ；reverse transcriptase ；prediction
* 通信作者 Author for correspondence （E-mail ：ywteng@https://www.doczj.com/doc/c715447819.html, ）
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反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子，它们以RNA为媒介，在基因组中不断自我复制（Beauregard et al.，2008）。在高等植物中，反转录转座子有丰富的拷贝，是基因组的重要成分之一（Ellis et al.，1998；Kalendar et al.，2000；Petit et al.，2007）。反转录转座子的转座机制不同于其它转座元件，它首先转录形成RNA，再以RNA为媒介在逆转录酶作用下逆转录成DNA，最终插入到基因组的靶基因片段上。这种“复制—粘贴”的转座机制使得反转录转座子能够快速自我扩增，从而在漫长的进化历史中改变整个基因组的大小（Kumar & Bennetzen，1999；Havecker et al.，2004）。植物中反转录转座子根据其结构域可以分为5大类型（Wicker & Keller，2007），其中以LTR反转录转座子报道较多。逆转录酶在LTR反转录转座子转座过程中发挥重要的作用，而在梨基因组中，25.5%和16.9% 的基因组为copia类型和gypsy类型反转录转座子（Wu et al.，2013）。因而逆转录酶的特征及其转录水平是深入研究反转录转座子在梨属植物进化过程中作用的关键。Wicker和Keller（2007）在研究水稻、小麦和拟南芥的逆转录酶后认为在单子叶和双子叶植物分化前copia类型逆转录酶就存在有6个原始支系，分别为Maximus、Ivana、Ale、Angela、TAR和Bianca。植物中gypsy类型逆转录酶也可以分为6大支系，分别为Galadriel、CRM、Reina、Takay、Tat和Athila（Lloren et al.，2009）。
逆转录酶基因序列存在保守部分，前人的研究中多使用简并引物采用基因克隆方式测序得到反转录转座子中的逆转录酶序列（Ma et al.，2008；刁卫平等，2012；范付华等，2012；Fan et al.，2013）。周鹏等（2014）通过简并引物从早酥梨及红色芽变材料中共扩增获得了59条copia类型逆转录酶序列。但通过PCR扩增方式获得序列存在以下不足：（1）使用的简并引物并不能通用于所有植物；（2）使用克隆测序得到的序列多为逆转录酶的部分序列；（3）通过PCR扩增并不能够扩增出全部类型的逆转录酶序列。由于一些分布广泛的逆转录酶在PCR过程中存在优势扩增现象，造成测序结果中逆转录酶类型少。随着越来越多的生物基因组的公布，可以用生物信息学的方法进行预测，从而克服上述缺点。本研究中使用生物信息学的方法从已经公布的‘酥梨’基因组（Wu et al.，2013）数据中分离出编码逆转录酶的基因序列，并分析这些序列的特点，同时根据一些高同源性的逆转录酶基因序列设计引物并对其在梨不同组织中的转录水平进行研究，进一步了解反转录转座子在梨属植物中的转座情况，有助于深入了解梨属植物进化过程中的基因组变化。
1 材料与方法
1.1试验材料
以‘酥梨’基因组数据（AJSU00000000）为基础，采用生物信息学方法预测逆转录酶序列。2013年4月选择‘圆黄’（Pyrus pyrifolia Nakai‘Wonhwang’）、‘酥梨’（P. pyrifolia white pear group‘Suli’）（Bao et al.，2008）、杜梨（P. betulaefolia Bge.）、‘考密斯’（P. communis L.‘Comice’）叶片提取DNA（Doyle & Doyle，1987）作为后续试验的PCR模板。从‘圆黄’梨的叶片、果肉、果皮及种子中提取RNA（Zhang et al.，2011），用分光光度计测试浓度，选择1 μg RNA逆转录成cDNA备用。
1.2逆转录酶序列的预测及聚类分析
采用LTR-harvest（Ellinghaus et al.，2008）对‘酥梨’基因组进行反转录转座子的预测，将预测获得的反转录转座子和Repbase（http：//https://www.doczj.com/doc/c715447819.html,/repbase/）数据库进行比对并将反转录转座子分为copia类型和gypsy类型，将分类后的序列翻译成氨基酸序列（http：//https://www.doczj.com/doc/c715447819.html,/Tools/st/ emboss_transeq/）。采用Hmmer3.0（Eddy，1998）并根据RVT_1（Pfam：PF00078）和RVT_2（Pfam：
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PF07727）逆转录酶蛋白质家族结构域（http：//pfam. janelia. org/）分别对反转录转座子序列中逆转录酶序列进行预测，所得到匹配的氨基酸序列即为反转录转座子逆转录酶序列。根据Pfam数据库中逆转录酶蛋白质家族结构域的描述，RVT_1和RVT_2涵盖了绝大部分物种中的逆转录酶类型，在Hmmer检索过程中发现根据RVT_2只能在‘酥梨’copia类型反转录转座子中找到逆转录酶，而根据RVT_1仅在gypsy类型反转录转座子中发现逆转录酶。说明Pfam数据库中这两种类型逆转录酶分别代表了反转录转座子中的copia和gypsy类型逆转录酶，这与Muszewska等（2011）的研究结果一致。根据Hmmer检索结果，通过Bioperl程序查找梨基因组中与氨基酸序列对应的碱基位置。
采用Clustal W软件对逆转录酶氨基酸序列进行多重比对，采用MEGA5.0（Tamura et al.，2011）NJ法构建系统发育进化树。采用dnasp5（Rozas et al.，2003）计算支系同义突变和非同义突变。
1.3逆转录酶基因序列的PCR扩增
选择成员数多、相似度大的8种类型逆转录酶设计引物，对梨属其它植物DNA进行PCR扩增。反应体积20 μL。95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 次循环；72 ℃ 10 min。
1.4‘圆黄’梨不同组织中逆转录酶基因的半定量分析
使用内参基因actin（PyActin，JN684184）对‘圆黄’梨叶片、果肉、果皮以及种子中获得的cDNA分别进行23、26、29和32个循环的PCR扩增，根据电泳结果调整上述样品浓度使其一致。选择8种类型逆转录酶引物对调整浓度后的样品分别进行PCR扩增并电泳检测。
2 结果与分析
2.1反转录转座子及逆转录酶的预测
从‘酥梨’全基因组中共预测出1 836条反转录转座子并将其分为copia和gypsy类型，将每条序列翻译成6种类型的氨基酸序列，共获得11 016条。对预测的反转录转座子氨基酸序列中逆转录酶进行预测，共获得769条copia和121条gypsy类型逆转录酶（表1）。
表1 梨中不同类型逆转录酶的数量
Table 1 The number of copia and gypsy RT sequences in pear
类型Group 移码突变
Frameshift mutation
终止突变
Prop. stops
后续分析
Sequences for analysis
总计
Total
copia 209215345769
gypsy22099121
copia类型和gypsy类型逆转录酶氨基酸序列长度分别为246和216个氨基酸。本试验中获得的copia类逆转录序列平均长度为242个氨基酸，与数据库中数据相近，而gypsy为153个氨基酸。通过比对‘酥梨’gypsy逆转录酶和RVT_2蛋白质结构域发现，‘酥梨’中gypsy发生了60个氨基酸的缺失。在预测的769条copia类型逆转录酶氨基酸序列中，209条较短（< 180个氨基酸），这些序列只有部分区域被匹配找到，其余序列未能在Hmmer检索中被发现，推测这部分序列可能发生了移码突变或者较大的变异。215条序列（30.0%）出现终止密码子突变，剩余345条序列被用来做进一步分析。在gypsy类型中，两条序列长度过短（<120个氨基酸），20条序列（16.5%）出现终止密码子突变。剩余的99条序列用做进一步分析。根据Hmmer预测的结果分别找到逆转录酶在基因组中的位置（表2），大部分序列AT含量高。AT所占比例范围50.79% ~ 70.83%。
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表2 copia类和gypsy类逆转录酶基因在‘酥梨’基因组中的位置
Table 2 Positons of copia group and gypsy group RT identified in‘Suli’pear
Copia 位置
Position
AT含量/%
AT content
Gypsy
位置
Position
AT含量/%
AT content
Pbcrt4 AJSU01026189（8812-9543）57.51 Pbgrt3 AJSU01012234（56295-56774） 59.38 Pbcrt20 AJSU01008317（46768-47502）55.51 Pbgrt10 AJSU01022140（22001-21522） 60.63 Pbcrt31 AJSU01009938（53908-54642）55.24 Pbgrt11 AJSU01016051（2270-2752） 56.52 Pbcrt33 AJSU01022200（23078-22344）55.51 Pbgrt14 AJSU01010035（3374-2892） 58.18 Pbcrt40 AJSU01002612（9359-8625）58.50 Pbgrt16 AJSU01011102（4613-5089） 54.93 Pbcrt45 AJSU01013470（25325-24591）57.82 Pbgrt20 AJSU01020436（55164-55640） 54.93 Pbcrt78 AJSU01023954（12934-12203）53.69 Pbgrt38 AJSU01024573（45806-45327） 61.25 Pbcrt80 AJSU01022914（55050-54319）58.06 Pbgrt39 AJSU01023659（15998-15528） 59.02 Pbcrt102 AJSU01005217（15253-15999）57.56 Pbgrt40 AJSU01007319（79924-79463） 57.79 Pbcrt116 AJSU01002821（16360-15629）58.33 Pbgrt44 AJSU01013147（2262-2621） 70.83 Pbcrt125 AJSU01015728（1797-2522）57.44 Pbgrt47 AJSU01025597（6749-7213） 60.22 Pbcrt142 AJSU01023984（12197-11463）59.32 Pbgrt55 AJSU01002139（106863-106402） 58.87
Pbcrt171 AJSU01009248（28518-29267）62.80 Pbgrt59 AJSU01004780（7418-7882） 60.22 Pbcrt184 AJSU01006776（46310-45561）60.40 Pbgrt60 AJSU01024920（5826-5362） 60.22 Pbcrt197 AJSU01003478（10996-11733）59.76 Pbgrt61 AJSU01024345（15587-16054） 64.74 Pbcrt218 AJSU01015271（38369-39094）59.23 Pbgrt68 AJSU01017936（47593-47126） 61.32 Pbcrt220 AJSU01015815（99607-98876）60.79 Pbgrt74 AJSU01019172（8075-7611） 60.65 Pbcrt221 AJSU01020199（100112-99378）59.32 Pbgrt78 AJSU01014939（43519-43058） 63.20 Pbcrt228 AJSU01000612（10791-11516）58.95 Pbgrt85 AJSU01022982（5079-4615） 64.52 Pbcrt230 AJSU01023896（23930-24664）60.82 Pbgrt94 AJSU01017133（9043-9420） 50.79 Pbcrt233 AJSU01010120（2669-3397）59.26 Pbgrt96 AJSU01021763（1072-1533） 62.77 Pbcrt251 AJSU01017100（20349-19615）60.82
Pbcrt256 AJSU01013922（32000-32707）56.21
Pbcrt257 AJSU01011481（7017-7751）59.86
Pbcrt259 AJSU01023139（53450-54184）59.86
Pbcrt288 AJSU01003183（18045-18782）59.62
Pbcrt302 AJSU01008260（64270-63587）62.72
Pbcrt324 AJSU01011368（3207-3860）55.66
Pbcrt329 AJSU01014431（26747-26019）61.87
Pbcrt330 AJSU01017172（17302-16574）61.04
注：部分相似性大的序列仅列出一个为代表。
Note：Only one sequence was list in some similarity of sequences.
2.2逆转录酶的系统进化分析
对预测出的345条Ty1-copia类逆转录酶氨基酸序列和已鉴别的39条其它物种的逆转录酶进行聚类分析（图1）。该39条序列分别对应了6个已报道的copia类逆转录酶的6个支系（Wicker & Keller，2007），分别为Maximus、Ivana、Ale、Angela、TAR和Bianca。聚类结果显示‘酥梨’中存在上述6个支系（表3），其中最大的为Ivana（150个成员）和Ale（115个成员）。Ivana可细分为两个亚支系：I-1支系包含有59个成员，这些成员表现出较高的同源性，平均序列分歧度为0.14；而I-2支系包含有91个成员，平均序列分歧度为0.35。Ale支系115个成员平均序列分歧度为0.4，表现出较高的异质性。Ale可细分为两个亚支系：A-1支系序列包含78个成员，序列分歧度范围为0 ~ 0.5，平均为0.38，说明大部分序列同源性低；A-2支系包含有38个成员，与已报道的大麦leojyg 逆转录酶聚在一起。Maximus支系中仅发现了3个成员。TAR支系中共发现了27个成员，其中9个成员（Pbcrt 133、126、103、102、87、85、83、152和177）表现出较高的同源性（序列分歧度0.015）。Angela支系中有24个成员，其中Pbcrt 279、282、286、288、291、292、294、303、301和290同源性高。Bianca支系包含有26个成员，该类型反转录转座子最初是从大麦中分离获得。‘酥梨’中Bianca 支系序列分歧度范围为0 ~ 0.32，除了Pbcrt334和Pbcrt345外，其余成员的序列表现出较高同源性。
2200 园艺学报41卷
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图1 ‘酥梨’345条以及已报道的其他植物39条Ty1-copia类逆转录酶氨基酸序列聚类树Fig. 1 Phylogenetic tree of the RT in copia group based on 345 RT amino acid sequences of‘Suli’pear and 39 identified
copia-type RT amino acid sequences
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表3 不同支系Ty1-copia类型逆转录酶基因序列变异度分析
Table 3 Within-lineage estimates of RT sequence variation in Ty1-copia
支系 Lineage 数量Number 长度/平均（bp）Length/Average变异度/平均Diversity/Average 非同义突变πn同义突变πs πn/πs
Ty1-copia345 543 ~ 750/727 0 ~ 0.60/0.44
Ivana 150 585 ~ 738/730 0 ~ 0.51/0.37
Subclade I-1 59 615 ~ 735/728 0.01 ~ 0.47/0.14 0.09 0.30 0.30 Subclade I-2 91 585 ~ 738/731 0 ~ 0.47/0.35 0.23 0.73 0.32
735 /
Maximus 3
Ale 115 543 ~ 735/720 0 ~ 0.54/0.4
Subclade A-1 78 573 ~ 735/719 0 ~ 0.50/0.38 0.28 0.73 0.38 Subclade A-2 37 543 ~ 735/722 0 ~ 0.47/0.33 0.23 0.63 0.37
TAR 27 723 ~ 750/746 0 ~ 0.48/0.32 0.22 0.68 0.32 Angela 24 615 ~ 741/726 0 ~ 0.45/0.32 0.22 0.67 0.33 Bianca 26 636 ~ 729/724 0 ~ 0.32/0.04 0.02 0.09 0.22
将‘酥梨’的99条Ty3-gypsy和已鉴别的22条其它物种分别对应6个已报道的支系Athila、Tat、CRM、Reina、Galadriel和Tekay（Llorens et al.，2009）的序列进行聚类分析（图2）。‘酥梨’中存在5个支系（表4），未能找到Galadriel支系，绝大部分成员聚类到Athila支系（60个成员）；第2
图2 ‘酥梨’99条以及其他植物22条Ty1-gypsy类型逆转录酶氨基酸序列聚类树
Fig. 2 Phylogenetic tree of the RT in gypsy group based on 99 RT amino acid sequences of
‘Suli’pear and 22 identified gypsy-type RT amino acid sequences
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大支系Tat包含22个成员，变异度比Athila支系高，但内部存在一个高度同源含有13个成员的分支。另外3个支系CRM（7个成员），Reina（2个成员）和Tekay（5个成员）包含了较少的成员。Pbgrt42、43和44被独立聚到一支上，长度为360个氨基酸，这些逆转录酶序列有待进一步研究。
表4 不同支系Ty3-gypsy逆转录酶基因序列变异度分析
Table 4 Within-lineage estimates of RT sequence variation in Ty1-gypsy
支系 Lineage 数量Number 长度/平均（bp）Length/Average变异度/平均Diversity/Average 非同义突变πn同义突变πs πn/πs
Ty3-gypsy99 360 ~ 480/460 0 ~ 0.58/0.38
Athila 60 375 ~ 480/467 0 ~ 0.32/0.19 0.07 0.62 0.11
Tat 22 369 ~ 477/448 0 ~ 0.47/0.26 0.19 0.50 0.38 CRM 7 447 ~ 480/475 0 ~ 0.03/0.02 0.01 0.06 0.13 Reina 2 480 /
Tekay 5 363 ~ 484/455 0.05 ~ 0.13/0.09 0.03 0.30 0.10 Unclassified 3 360 /
2.3不同支系逆转录酶序列分析
根据图1和图2的分类结果，对不同类型的逆转录酶核酸序列特征进行分析（表3、表4），copia 类型逆转录酶核酸序列长度范围为543 ~ 750 bp，而gypsy类型为360 ~ 480 bp。两种类型均表现出较高的异质性，其中copia类变异度（0.44）高于gypsy类型（0.38）。‘酥梨’中所有支系逆转录酶核酸序列非同义突变与同义突变的比值均小于0.4，说明这些支系逆转录酶经历了很强的负选择。
为了深入了解逆转录酶序列的特征，在每个不同支系的copia类逆转录酶氨基酸序列中选择一条序列进行比对。比对结果（图3）显示‘酥梨’copia类型逆转录酶序列存在3个较为保守的区域，
图3 梨的逆转录酶氨基酸序列比对
Fig. 3 Alignment of inferred RT amino acid sequences isolated from pear
2204 园艺学报41卷
分别是前部的KARLV A区域、中部的LYGLKQ区域、后部的YVDD保守区域，与其它已报道的逆转录酶序列相似；但序列其余部分的同源性低。‘酥梨’gypsy类逆转录酶在序列上游含有相对保守的SGY*Q以及中部保守的MPFG区域。从序列比对上可以看出‘酥梨’中copia类型逆转录酶比gypsy类型逆转录酶更为保守。
2.4梨属植物中逆转录酶PCR扩增及半定量分析
与已报道的其他植物类似，‘酥梨’的逆转录酶也具有高度异质性，甚至同一支系内部不同逆转录酶序列分歧度也较大（表3、表4），所以很难设计出一对通用引物可以扩增出全部类型的逆转录酶序列。本研究中根据‘酥梨’逆转录酶聚类图，从中挑选出8个较保守的小分支进行转录活性分析（图1和图2中分别标注了这些小分支位置），每个小分支要满足成员数大于10个且序列之间同源性大于95%。8个小分支所属支系及其代表序列如表5所示。
表5 PCR扩增中使用的引物序列
Table 5 Primers used for PCR amplification
类型Group 引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
来源
Origin
参考序列
Reference sequence
copia RT1 F：CAAGATAAAGCGTCGTCCAA；R：ATTTCTGCCTCATCATCACC Ivana I-1 Pbcrt20 RT2 F：GCAATCTGGACGAATGTGGT；R：AAGCCTTGTCCATACCAAATCG Binaca Pbcrt330
RT3 F：CGCAAGATACAAAGCACGACT；R：CCACATTCGTCCAGATTGCT Ivana I-2 Pbcrt4
RT4 F：CTACATTCAGCAACCGTCAG；R：CTGCTTGACTTCAATGCCTA Ivana I-2 Pbcrt40
RT5 F：ACGGCTCTATTGACCGCTAC；R：GCACTAGCATCATTGCCTGTA Ale A-2 Pbcrt233
gypsy RT6 F：TAAA TGCCA TGACTAGGAAAGA；R：TTCCCAA TTCAAGACAAGGTTA Athila Pbgrt60 RT7 F：GTGTTTGCACCGATTACAGG；R：ATATGCAAATGTGCCAAAGG Athila Pbgrt38
RT8 F：GAAGACGAGGAACTAACAGCC；R：TCCAGAGGTGACGCCAAACG Tat Pbgrt16
使用RT1 ~ RT8所对应的引物对分属于不同梨属种或品种（‘酥梨’、‘圆黄’、杜梨和‘考密斯’）的DNA进行PCR扩增，结果表明这8类逆转录酶广泛存在于不同梨属种或品种中（图4），不仅存在于东方梨的较原始种杜梨中，同样也存在于西洋梨‘考密斯’中，说明在东西方梨分化之前逆转录酶就已经存在于梨属植物中。使用这8种类型逆转录酶序列分别对苹果基因组（ACYM00000000）和桃基因组（CM001826 ~ CM001833）进行Blast检索，苹果基因组中发现有匹配到上述8种类型逆转录酶的序列，而在桃基因组中，RT1、RT3、RT6和RT8未能找到与之匹配的序列，说明桃基因组中不包含有这些类型的逆转录酶。
图4 不同梨品种DNA的RT1 ~ RT8 PCR扩增情况
A：‘酥梨’；B：‘圆黄’；C：杜梨；D：‘考密斯’。
Fig. 4 Genomic-PCR of pear RT1–RT8 in four pear accessions
A：P. pyrifolia white pear group‘Suli’；B：P. pyrifolia‘Wonhwang’；
C：P. betulaefolia；D：P. communis‘Comice’.
11期蒋爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2205
为了进一步阐明逆转录酶在梨属植物不同组织中的转录情况，分别提取‘圆黄’梨的叶片、种子、果皮、果肉RNA进行半定量分析，结果显示RT1 ~ RT8在这些组织中均有转录（图5），其中RT5在所有组织中表达丰度均较高，RT1在果肉中表达丰度高，而RT4在叶片和果肉中的表达水平显著高于种子和果皮，说明梨不同组织中，逆转录酶转录水平存在一定差异。由于选择的试材均为正常生长状态下的梨组织，说明在梨属植物中，逆转录酶并非一定需要逆境条件下才能激活，在正常生长的‘酥梨’组织中该酶基因就有一定的表达。
图5 RT1 ~ RT8在‘圆黄’梨不同组织中的表达情况
Fig. 5 RT-PCR of RT1–RT8 in different tissues of‘Wonhwang’pear
3 讨论
本研究中使用生物信息学方法对梨的Ty1-copia和Ty3-gypsy类型反转录转座子逆转录酶序列进行了分离，共获得345条copia类型逆转录酶序列和99条gypsy类型逆转录酶序列，比以前报道的通过PCR克隆方法获得的序列（江彪等，2008；刁卫平等，2012；范付华等，2012）数量多，类型丰富，片段长度更长。NJ进化树分析得出，‘酥梨’中copia类型逆转录酶可以细分为6个支系（图1），这6个支系广泛存在于水稻，小麦和拟南芥中（Wicker & Keller，2007），说明梨属植物在进化过程中保留了这些类型的逆转录酶。在这6个支系中，Ivana和Ale在‘酥梨’中分布更为广泛，藜麦基因组中Ale支系成员也比较丰富，但Ivana支系成员少，说明不同的植物的反转录转座子的进化历程不同（Kolano et al.，2013）。‘酥梨’中Maximus支系仅预测到3条序列，说明在进化过程中，梨属植物逐渐丢失了该支系。在‘酥梨’中预测得到的gypsy类型逆转录酶可以分为5个支系（图2），60%的序列来自于Athila支系，而藜麦中大部分逆转录酶来自Tekay支系（Kolano et al.，2013），说明不同植物中逆转录酶类型存在较大差异。逆转录酶序列分类结果历来作为反转录转座子分类中的一个重要参考（Park et al.，2007；Hribova et al.，2010），本试验结果可以为梨属植物反转录转座子分类提供一定的依据，同时所得的逆转录酶序列可为基于反转录转座子标记开发提供素材。
逆转录酶氨基酸序列在其它物种中均显示出高度异质性（Ma et al.，2008；Ramallo et al.，2008），在梨中也存在类似现象。梨属植物在进化过程中逆转录酶有着丰富的变异来源，杜梨被认为是梨属植物中较为古老的种（Zheng et al.，2011），在杜梨中发现了同类型逆转录酶的存在（图4），表明反转录转座子及逆转录酶在梨属植物中存在时间久远。在漫长的进化过程中逆转录酶序列会发生一定的突变。反转录转座子广泛存在于梨基因组中，本研究中鉴别出1 836条反转录转座子，众多的反转录转座子提供了更多的变异来源。从目前报道来看，除了极少的一些反转录转座子插入到功能基因中引起植物的突变外（Kobayashi et al.，2004；Butelli et al.，2012），大部分反转录转座子在基因组中不具有功能，其突变过程不受自然选择的压力，这使得众多逆转录酶突变体在后代中被保留
2206 园艺学报41卷
下来，其中包括大量发生终止突变的逆转录酶。这可能是逆转录酶高度异质性最主要的原因。
本研究中成功分离了‘酥梨’中同源性高的一些逆转录酶序列（表4），并设计引物检测了其在‘圆黄’梨不同组织中的转录水平（图5）。前人报道逆转录酶多在受到胁迫时发生转录（Tapia et al.，2005；De Felice et al.，2009）。但是本试验在砂梨品种‘圆黄’中分别在正常生长的叶片、果实及种子中检测到逆转录酶的转录，而且通过Blast检索‘酥梨’芽的转录组数据（SRX147917）（Liu et al.，2012）发现有RT6、RT7和RT8等3种类型逆转录酶转录本的存在。这表明在梨属植物正常生长的组织中逆转录酶是活跃的。而逆转录酶在反转录转座子的转座过程中发挥重要的作用，芽及种子内发生的反转录转座子的突变能够造成芽变及后代变异并能稳定遗传给后代，所以推测梨属植物中逆转录酶的活跃可能是造成在梨基因组中42.4%反转录转座子的一个重要原因。RT1、RT3、RT6和RT8存在于苹果和梨基因组中，而通过检索桃基因组并未发现这4种类型的逆转录酶。说明在蔷薇科不同物种中逆转录酶进化方式也有所不同。RT2、RT4、RT5和RT7广泛存在于梨、苹果和桃中，而聚类结果（图1，图2）显示这4种类型的逆转录酶所在支系在‘酥梨’中分布广泛，推测这些类型的反转录转座子在梨属进化乃至蔷薇科进化过程中发生了多次转座。其中RT4和RT5在‘酥梨’中依然保持着较高的转录水平。
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逆转录病毒（Retroviruses）归类于逆转录病毒科（Retroviridae），包括一大类含有逆转录酶（reversetranscriptase）的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科、泡沫病毒亚科和慢病毒亚科，每一亚科又有若干个属（表33-1）。肿瘤病毒亚科（oncovirinae）大多引起禽类、猫、鼠、猴等动物肿瘤，与人类疾病相关者有人类嗜T细胞病毒（humanT-celllymphotropicvirus,HTLV）；泡沫病毒亚科（spumavirinae）的致病作用尚不清楚；慢病毒亚科（lentivirinae）中的人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）则是艾滋病的病原体，正受到人类的广泛关注。三个亚科病毒的生物演化和亲缘关系见图33-1。 第一节人类免疫缺陷病毒 人类免疫缺陷病毒（HIV），是获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）的病原体。AIDS首次报道于1981年，1984年证实其病原为HIV。因病毒最初分离于淋巴腺综合征的同性恋患者血清，曾称之为淋巴腺病相关病毒（lymphadenopathy-associatedvirus,LAV），此后分别又有人类嗜T细胞病毒Ⅲ型（HTLV-Ⅲ）、AIDS相关病毒 （AIDS-relatedvirus,ARV）之称。1986年经国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）建议，将LAV、HTLV-Ⅲ和ARV统一命名为人类免疫缺陷病毒，俗称艾滋病病毒。HIV分HIV-1型和HIV-2型，前者引起全球AIDS流行，后者主要分离自西部非洲的艾滋病患者。HIV感染的范围在逐步扩大，我国自1985年发现首例AIDS以来，感染人数逐年快速增长，严重威胁着人类的身心健康，受到人们的广泛关注。 一、生物学性状 （一）形态与结构 成熟的病毒直径100~120nm、20面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶，后者包括逆转录酶、整合酶（integrase）和蛋白酶（protease）。HIV的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白（gp120）和相嵌蛋白（gp41）两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。包膜内面为P17构成的基质蛋白（matrix），其内为衣壳蛋白（P24）包裹的RNA。。 HIV基因组由两个拷贝的正链单股RNA组成，在其5’端可通过氢键结合构成二聚体。HIV的基因组成较其他逆转录病毒复杂，全长约9.7kb，含有gag、pol、env三个结构基因，以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调控基因（图33-3）。在基因组的5’端和3’端各含长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)，HIV的LTR含顺式调控序列，控制着前病毒基因的表达。在LTR区有启动子、增强子及负调控区。核酸杂交显示，HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。 1．结构基因 （1）gag基因：是编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因。其表达产物初为55kD的前体蛋白（p55），后在HIV蛋白酶作用下进一步裂解为p24、p17和p15。P24组成包裹在HIV核酸外的衣壳蛋白(capsid,CA)，其特异性较强，除HIV-1和HIV-2之间存在轻度交叉反应外，与其他逆转录病毒无交叉抗原成分；p17构成包膜内的基质蛋白；p15则可进一步裂解为与RNA结合的蛋白（p9和p7）。 （2）pol基因：编码HIV复制所需的酶类，诸如逆转录酶（p66/p51）、整合酶（p32）和蛋白酶。Pol基因有万分之一的突变率，对抗叠氮胸苷（具有抗病毒作用的核苷类似物）的HIV突变株的形成，即与pol上HIV逆转录酶基因
第十五章转座子 基因组是通过获得新序列以及原有序列重排发展而来的。 新序列的意外引入改变基因组间承载信息的能力。染色体外元件(Extrachromosomal element)通过调节基因的长度(通常是很短的)来转移信息。在细菌中，质粒是通过接合作用(见12章)，而噬菌体则是通过感染来转移信息(见第11章)。噬菌体和质粒都会在其复制子(Replicon)中偶尔携带一些宿主基因。有些细菌中有通过转化作用直接转移DNA的现象。真核生物中，一些病毒(尤其是逆转录病毒)能够在感染周期内转移遗传物质。 重排(Rearrangement)是由基因组内部程序发起的，例如非互惠(Nonreciprocal)重组是由同源重组时错配导致的。非互惠重组导致座位的复制或重排(见第4章)。基因组的序列复制是产生新序列的主要来源。复制可能继承原来的功能或可能产生新功能，而且，在分子水平上发现独立基因组间差异明显，是由于重组导致了这些多态性(Polymorphism)。在第4章已经讨论过，微卫星间重组可调整其长度以便使每个基因组都是独特的。 多态性的另一个主要原因是由转移元件转座(Transposon)产生的：它们是基因组中可移动的不连续序列，可在基因组内从一个座位转到另一个座位。转座子特征是它们并不利用独立元件(如噬菌体或质粒DNA)，而只是从基因组的一个位点直接移动到另一个位点，与大多数基因组重构的其它程序不同，转座子不依赖序列供体和接体位点间的任何联系。转座子非常严格地自我转座到同一基因组的新位点，有时增加一些序列，因此它们可作为基因组间序列转移的内部载体，是基因组内突变的主要来源。 转座子可分两种类型。本章讨论的转座子与编码蛋白质的DNA序列共存并操纵这些DNA以便使其在基因组内复制自我。下章讨论的转座子与逆转录病毒相似。它们通过将RNA转录成DNA拷贝的能力而迁移；DNA拷贝同时被整合进基因组的新位点。 通过DNA移动的转座子在真核和原核生物中都已发现。每种细菌的转座子都携带编码其自身转座所需酶的基因，但也需要它所驻留基因组的辅助功能(如DNA聚合酶或DNA促旋酶)。类似的系统也存在于真核生物中，但其有关酶的功能还很清楚。一个基因组可同时包含功能元件和非功能元件。通常真核基因组中的主要元件是有缺陷的，它们失去了独立转座的能力，但它们仍可被功能性转座子产生的酶识别而被动专座。 转座元件可直接或间接启动基因组的重排。 ?转座元件本身可导致序列的缺失、插入或将宿主序列转到一个新的位点。 ?转座子作为细胞重组系统的底物是通过“同源便携区(Portable region of homology)”的功能实现的。在不同座位(或不同染色体)上同一转座子的两个拷贝可能为相应的重组提供位点。这种交换会产生缺失、插入、倒置或转座。 转座子的间歇活动似乎为自然选择提供了一个模糊的目标。这支持了以下观点：转座元件既对表型有积极的作用也有消极作用。它构成所谓“自私(Selfish)DNA”，只顾自身繁殖。实际上，转座可作为一个事件考虑，转座子是驻留在基因组内的独立实体，这是与其它细胞重组系统的区别所在。
转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）又称跳跃因子，其实质是基因组上不必借助于同源序列就可移动的ＤＮＡ片段，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。自１９５１年美国Ｍｃ－Ｃｌｉｎｔｏｃｋ在玉米中首先发现了ＤＮＡ转座子（ＤＮＡｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）以来，转座子已成为各种生物的基因分析的有效工具之一。不仅利用转座子诱变已找到原核生物的单性生殖基因［３］；而且在真核生物中，Ｐ－转座子的发现和运用极大地促进了果蝇遗传学的发展。近来，一些其他的转座子元件，如ｈｅｒｍｅｓ，ｈｏｂｏ，ｍａｒｉｎｅｒ，ｍｉｎｏｓ和ｐｉｇｇｙＢａｃ已成功在Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ、Ａｎａｓｔｒｅｐｈａｓｕｓｐｅｎｓｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｖｉｒｉｌｉｓ、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）以及包括鱼类、禽类在内的多种生物转基因中获得应用，２００５年７月复旦大学的丁昇在《ｃｅｌｌ》杂志上发表关于运用ｐｉｇ－ｇｙＢａｃ转座子作载体成功制作转基因脊椎动物—— —小鼠，更加显示了转座子作为转基因载体的优势与潜力。 １转座子的类型和基本结构 １．１ＤＮＡ转座子ＤＮＡ转座子是以ＤＮＡ－ＤＮＡ方式转座的转座子，可通过ＤＮＡ复制或直接切出两种方式获得可移动片段，重新插入基因组ＤＮＡ中，导致基因的突变或重排。但一般不改变基因组的大小。根据转座的自主性，ＤＮＡ转座子又分为自主转座子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ）和非自主转座子（ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ），前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则要在自主转座子存在时才能够实现转座。玉米的Ａｃ／Ｄｓ体系就是典型的一例。活化子Ａｃ（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）属于自主转座子，解离子Ｄｓ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）属于非自主转座子，只有在Ａｃ存在时，Ｄｓ才能转座。 １．２反转录转座子反转录转座子不同于转座子，是以ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡ的途径来实现转座的，在整合酶的作用下新生成的以ＤＮＡ状态存在的反转录转座子整合到宿主基因组中。这样，反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累，从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件，所以会影响宿主基因的表达，在生物进化过程中反转录转座子起着不可忽视的作用［４］。 根据是否具有编码反转录酶的能力，反转录转座子可以分为两个家族：自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子O按照序列结构中有无长末端重复序列（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅ－ｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＴＲ）又可分为有ＬＴＲ反转录转座子和无ＬＴＲ反转录转座子。自主性反转录转座子包括内源性反转录病毒（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＥＲＶ）、ＬＴＲ反转录转座子及长散在元件（ｌｏｎｇｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＬＩＮＥｓ）O非自主性反转录转座子包括短散在元件（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＳＩＮＥｓ）及修饰性反转录假基因（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄｒｅｔｒｏｐｓｅｕ－ｄｏｇｅｎｅ）。 ２转座子的转座机制 转座子都具有编码与转座作用有关的酶—— —转座酶的基因，而末端大多数都是反向重复序列。转座酶既识别转座子的两末端，也能与靶位点序列结合。转座作用的机制是转座子插到新的位点上产生交错切口，所形成的突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，然后由ＤＮＡ聚合酶填补缺口，ＤＮＡ连接酶封闭切口，交错末端的产生与填补说明了靶ＤＮＡ在插入位点存在正向重复，两条链上切口之间的交错取决于正向重复的长度，因此，每个转座子所特有的靶重复序列，反映了切割靶ＤＮＡ的酶的几何形状。 ３主要运用于动物的几种转座子 ３．１Ｐ－转座子Ｐ－转座子最初于果蝇中发现，并研究了其结构与功能，建立了Ｐ－转座子和转座酶辅助系统。该转座子能只在果蝇中作用。但该系统为以后的转基因动物提供了理论和实验基础。Ｐ－转座子长度为２．９ｋｂ，具有３１ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。中间有编码转座酶的可转录单位，以此产生转座子的精确切出和准确插入另一染色体位点（切出—粘贴反应）。Ｐ—转座子的功能还受其他核因子的影响，这些因子可能是不同昆虫中转座子发挥功能与否的条件。３．２Ｍｉｎｏｓ转座子Ｍｉｎｏｓ转座子是从海德尔果蝇Ｄ．ｈｙｄｅｉ中分离得到的，并首先应用与果蝇以外的昆虫转基因。Ｍｉｎｏｓ转座子长度位１．４ｂｐ，具有较长的１００ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。可转录单位为１个内含子。以地中海果蝇白眼基因为报告基因的研究表明，Ｍｉｎｏｓ转座子的转座效率在ＧＯ带１～３％，并能在双翅目核鳞翅目昆虫细胞及按蚊Ａｎｃｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ和大果蝇Ｄ。Ｖｉｒｉｌｉｓ昆虫个体中实现转座。３．３Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子是从马里塔尼亚果蝇Ｄ。Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ中发现的。长度２８ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）和特意性的ＴＡ目标结合位点。Ｍｉｎｏｓ转座子是至尽为止研究最深入的转座子之一。 ３．４ｈｏｂｏ转座子因为Ｐ转座子只能在果蝇中实现转座，因此寻找其他转座子系统十分必要。Ｈｏｂｏ转座子就是其中 转座子在转基因动物中的应用 刘冬 （山西农业大学研究生学院，太谷０３０８０１） 摘要：转座子是发现新基因和基因功能分析的有效工具之一，作为插入突变原和分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆，一些转座子已作为转化载体用于制备转基因动植物。转座子对多种生物尤其是对脊椎动物的成功转化让人们看到了他们作为转基因载体的巨大潜能。 关键词：转座子；转基因动物；昆虫；鱼类；哺乳动物 专论与综述 畜牧兽医科技信息２００７．０７ １８
逆转录酶（AMV）使用说明 货号：RT1060 规格：200U/500U/1000U 保存:-20℃保存，避免反复冻融，保质期为2年。 产品内容： 产品组成RT1060-200RT1060-500RT1060-1000逆转录酶（AMV）20μl50μl100μl 10×AMV Reaction Buffer50μl150μl300μl DTT30μl80μl150μl 产品简介： 逆转录酶（AMV）从Avian Myeloblastosis Virus分离出来，经过高度纯化，不含核酸酶。可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。 逆转录酶（AMV）一个活性单位U定义为：在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。 使用说明： 合成第一链cDNA的步骤 以下试剂客户自己提供 dNTPs(10mM)
引物（Oligo dT（18）或随机引物或特异性引物 无核酸酶双蒸水 RNA模板 RNase抑制剂 RT反应（20μl体系）： 1．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s； 2．取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入 2~5μg RNA Xμl 引物*1μl 【引物*：Oligo dT18(10μM)或随机引物(50ng/μl)或特异性引物(2μM)】 dNTPs(10mM)1μl 补加无核酸酶的双蒸水至总体积15.5μl 3．65℃保温5min，然后冰浴5min； 4．往步骤3的PCR管中依次加入下列组份 RNase抑制剂(40u/μl)0.5μl 10×AMV Reaction Buffer2μl DTT(200mM)1μl
逆转录和逆转录酶 1.逆转录酶的发现 在1970时，当科学家霍华德·马丁·特明和戴维·巴尔的摩两人各自都从酵素中发现反转录的反应，将此命名为逆转录酶，此种反转录的机制才被当时的主流接受。 逆转录酶首先是由霍华德·马丁·特明在劳氏肉瘤病毒中发现的，并且1970在麻省理工学院由戴维·巴尔的摩独立从两种R N A肿瘤病毒：R-M L V 以及在一次劳氏肉瘤病毒中分离出来。由于这些成就，两人在1975年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。 后来发现，逆转录酶不仅存在于某些R N A病毒，也存在于哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞。 2.逆转录的过程 逆转录酶的作用是以d N T P为底物，以R N A为模板，t R N A(主要是色氨酸t R N A)为引物，在t R N A3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与R N A模板互补的c D N A单链，它与R N A模板形成R N A-c D N A杂交体。 随后又在逆转录酶的作用下，水解掉R N A链，再以c D N A为模板合成第二条D N A链。至此，完成由R N A指导的D N A合成过程。 逆转录的简单过程 3.逆转录酶的生理功能 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖R N A的D N A聚合酶，即以R N A 为模板催化D N A链的合成。合成的D N A链称为与R N A互补N A（c D N A）。大多数逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下三种活性。 （1）D N A聚合酶活性以R N A为模板，催化d N T P聚合成D N A的过程。此酶需要R N A为引物，多为赖氨酸的t R N A，在引物t R N A3'－末端以5' →3'方向合成D N A。 （2）R N a s e H活性（R N A酶）由反转录酶催化合成的c D N A与模板R N A 形成的杂交分子，将由R N a s e H从R N A5'端水解掉R N A分子。 （3）D N A指导的D N A聚合酶活性以反转录合成的第一条D N A单链为模板，以d N T P为底物，再合成第二条D N A分子。 除此之外，有些逆转录酶还有D N A内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体D N A中有关。 4.研究意义
转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展 胡英考 (首都师范大学生物系,北京100037) 摘 要: 转座子标签法是克隆与分离植物基因的一项十分有效的方法。概述了转座子标签技术克隆与分离植物基因的基本原理与方法,介绍了可用于转座子标签技术的转座子,对于转座子标签系统以及在克隆与分离异源植物基因方面的主要成就进行了综述,并对将来的研究方向进行了讨论。 关键词: 转座子 转座子标签 基因克隆 Progress of Plant G enes Cloning and Isolation by T ransposon T agging Hu Y ingkao (Biology Depart ment of Capital Normal U niversity,Beiji ng100037) Abstract: Transposon tagging is an effective method for plant gene cloning and isolation.The principle and proce2 dure of transposon tagging are summarized and the trans poson used for plant gene cloning and isolation are introduced in this paper.The progress of transposon tagging system and alloplant gene cloning and isolation were reviewed.The per2 spective of trans poson tagging was also discussed. K ey words: Transposon Transposon tagging G ene cloning 分子生物学的迅速发展,为人们提供了许多分离植物基因的有效方法。传统上,可根据已知基因的产物推测其相应的核苷酸序列,再据此序列合成寡核苷酸探针,从cDNA文库或基因组文库中钓取目的基因,此即所谓的功能克隆(functional cloning)。近年来,表型克隆(phenotypical cloning)发展十分迅速,它是根据材料间表型的差异,来克隆引起这种差异的基因的方法。但是,在大多数情况下,我们既不知道基因的表达产物,又没有适宜的相对表型用于表型克隆,此时最常用的基因克隆技术是图位克隆(map2based cloning or positional cloning)[1]和转座子标签(transposon tagging)技术[2]。以下仅对转座子标签技术在植物基因克隆中的研究进展作一综述。 1 转座子标签法克隆植物基因的原理与方法 转座子(transposon)又称转座因子或移动因子,最早在1951年由美国遗传学家McClintock在研究玉米籽粒色斑不稳定现象而提出来的,但该概念直到1967年在大肠杆菌中发现插入序列这类转座因子后才被普遍承认和接受,现在我们知道,转座子在生物界是普遍存在的。 转座子是染色体上一段可以移动的DNA序列,它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位,当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时,就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型,通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起,由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针,从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA 片段,获得含有部分突变株DNA序列的克隆,然后以该DNA序列为探针,筛选野生型植株的基因组文库,最终得到完整的目的基因[3]。在转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T2DNA整合到基因组所引起的插入突变,也可用上述原理来克隆基因,这样就大大提高了分离基因的效率。 利用转座子标签法分离植物基因的主要步骤如下:(1)构建含转座子的质粒载体;(2)将含转座子的质粒载体通过农杆菌介导或其他适当的转化方法导 生物技术通报 ?综述与专论? B IO TECHNOL O G Y BULL ETIN 2003年第2期
逆转录实验说明 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 RNA保存：为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及
转座子及其相关技术的研究 摘要：转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列，转录组的活动对生物体基因组的转录以及演变存在着严重影响，本文就转座子的基因机理及特征、转座子沉默、转座子的标签技术以及其在植物中的运用进行阐述。 转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。MclCintockl’嗜次在玉米中的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。目前认为，多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现的原因源于转座子的可动性，并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化，转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。 1.转座子特征与分类 基因转座时发生的插入作用中受体分子都有一段3-12bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。第二类转座子又称为返座元，在结构和复制上与反转录病毒类似，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。 2转座子相关技术 2.1转座子分离方法 有4种方法用来分离转座子:(l)转座子诱捕法，此法适用于分离具有相当高的整合和切割频率的转座子。(2)Southern杂交法，此种方法需要有适当的探针，用于检测已知的转座子。(3)重复DNA序列鉴定法，适用于高拷贝数的无论是否有活性的转座子。(4)PcR扩增法，对己知序列的转座子可以设计引物直接PCR扩增。
关于逆转录试剂的那些事 逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。 逆转录与反转录严格意义上来说没有什么区别，但是逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程；反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA 互补DNA(complementary DNA,cDNA)。逆转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 逆转录酶 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 BIOG Super Reverse Transcriptase是公司美国团队在西雅图的实验室研发出的一款具有卓越性能的逆转录酶。利用基因工程技术，我们成功地将BIOG Super的热稳定性大幅提高，即使在摄氏50多度时也有较好的逆转录表现，从而有效克服了RNA模板二级结构对逆转录反应的影响。与其它品牌的逆转录酶相比，BIOG Super与RNA模板具有更高的亲和力，更容易获得完整的cDNA片段，并可检测到低至1pg总RNA 中的目标片段，特别适合于总RNA量较少以及目标RNA拷贝数较低情况下的逆转录。 成分反应体系 组分2000单位10000单位 5×BIOG RT Buffer500ul500ul BIOG Super Reverse Transcriptase 10ul50ul RNase free ddH2O to20μl 5×BIOG RT Buffer4μl dNTP Mixture(10mM each)1μl Gene Specific Primers(2μM)1μl RNase inhibitor(40U/μl)1μl BIOG Super Reverse Transcriptase1μl 模板RNA100pg-5μg
植物反转录转座子及其分子标记 王子成1，2李忠爱2邓秀新1 （1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉，430070 2 河南大学生命科学学院，河南开封，475001） 摘要：反转录转座子（retrotransposon）是真核生物中一类可移动因子，可分为LTR反转录转座子和非LTR反转录转座子。反转录转座子以高拷贝在植物界广泛分布，可以通过纵向和横向分别在世代之间和不同种之间进行传递，同一家族的反转录转座子具有高度的异质性. 在一些生物的和非生物的逆境条件下，反转录转座子的转录可以被激活。由于反转录转座子的特点，使其作为一种分子标记得以应用。S-SAP，IRAP，REMAP和RBIP等分子标记相继发展起来，在基因作图、生物遗传多样性与系统进化、品种鉴定等方面具有广泛的应用前景。 关键词反转录转座子，分子标记 Plant retrotransposons and their molecular markers Wang Zicheng1，2Li Zhongai2Deng Xuixin1 1 National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agriculture university Hubei Wuhan, 430070 2 College of life science ,Henan University, Henan Kaifeng, 475001 Abstract: Retrotransposons are a class of eukaryotic transposable elements, consisting of the long terminal repeat (LTR) and non-LTRretrotransposons. Retrotransposons are ubiquitous in the plant kingdom by high copy number and can be transmitted between generations by vertical transmission and between species by horizontal transmission. The same family retrotransposons presented highly heterogeneous populations in all higher plant genomes. Many of the plant retrotransposons are transcriptionally activated by various biotic and abiotic stress factors. Retrotransposons are used as molecular markers for their traits. S-SAP, IRAP, REMAP and RBIP are developed and will be applied widely in gene mapping, genetic biodiversity and phylogeny studies, and cultivar certification. Key words: retrotransposons molecular markers 反转录转座子是广泛分布于真核生物中的一类可移动因子，因其转座需经过由RNA介导的反转录过程而得名。自从1984年第一例植物反转录转座子报道(Shepherd,1984) 以来，大多数的植物中都已发现有反转录转座子的分布(Price et al,2002; Linares et al, 2001; Hernandez et al,2001; V erries et al,2000; Asins et al,1999)。反转录转座子在植物基因组中占有相当大的比例，但国内关于这方面的研究相对较少，本文就近年来植物反转录转座子的研究进展进行综述，并对基于反转录转座子的分子标记及其应用进行初步的介绍，以引起大家对这一领域的关注。 1 植物中的反转录转座子类型与结构 在真核生物中，根据是否包含有LTR而将反转录转座子分为两大类，即LTR反转录转座子和非LTR反转录转座子。LTR是研究较多的反转录转座子，根据它们序列的相似程度 王子成，男，1974年12月生，华中农业大学00级博士生，主要从事植物生物技术方面的研究。E－mail:wangzichengainuo@https://www.doczj.com/doc/c715447819.html,.导师简介：邓秀新，男，1961年11月生，华中农业大学长江学者特聘教授，主要从事植物生物技术研究。E-mail:DXXWWLJ@https://www.doczj.com/doc/c715447819.html, 国家自然科学基金资助项目：编号（30170472）
逆转录-聚合酶链反应中文实验方法 作者：佚名来源：本站原创 2004-12-20点击：6478 【字体：小大】 逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为4 2℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cD NA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的
科技名词定义
程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。 2．逆转录酶与逆转录过程 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA （cDNA）。逆转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA 分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 逆转录的简要过程表示如下： 逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA桪NA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。 3．生物学意义 逆转录的发现有重要的理论意义和实践意义。 （1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA
植物基因组中微型反向重复转座元件(MITE)研究进展1 孙海悦，张志宏* 沈阳农业大学园艺学院，沈阳（110161） E-mail：zhangz@https://www.doczj.com/doc/c715447819.html, 摘要：微型反向重复转座元件(miniature inverted repeat transposable element， MITE)是一类特殊的转座元件，其在结构上与有缺失的DNA转座子相似，但具有反转录转座子高拷贝数的特点。MITE时常与基因相伴，对基因调控可能起重要作用，因此，MITE正逐渐成为基因和基因组进化及生物多样性研究的一种重要工具。本文综述了植物基因组中MITE的研究进展，并对其应用前景进行了展望。 关键词：微型反向重复转座元件，基因，进化 转座元件（transposable elements）是指在生物细胞中能从同一条染色体的一个位点转移到另一个位点或者从一条染色体转移到另一条染色体上的DNA序列。转座元件是真核生物基因组的主要成分，根据转座媒介的不同而分为两类，即类型I和类型II (Casacuberta and Santiago， 2003)。类型I转座元件以RNA为媒介进行转座，即作为DNA的转座元件首先被转录为RNA，再借助反转录酶/RNase H反转录为DNA，插入到新的染色体位点，因此，类型I转座元件也被称为反转录转座子(retrotransposon)。类型II转座元件直接以DNA为媒介进行转座，因此，类型II转座元件也被称为DNA转座子（DNA transposon）。反转录转座子的“复制和粘贴”转座机制使其可以快速地增加拷贝数，所以在真核生物基因组中占很高的比例；而DNA转座子的“剪切和粘贴”转座机制不增加拷贝数，所以其在基因组中仅有少量重复(Bennetzen， 2000)。微型反向重复转座元件(miniature inverted repeat transposable element， MITE)是20世纪90年代发现的一类特殊的DNA 转座子(Bureau and Wessler， 1992；Bureau and Wessler， 1994)，其在结构上与非自主DNA转座子相似，但具有反转录转座子的高拷贝数特点 (Feschotte， et al.， 2002a)。MITE在植物基因组中广泛存在，时常与基因相伴(Mao et al.， 2000)，对基因调控可能起重要作用 (Bureau and Wessler，1994; Wessler et al.，1995; Bureau et al.， 1996 )，并可能在基因组进化及生物多样性形成中扮演着重要角色。 1. MITE的结构 MITE最早发现于禾本科植物中（Bureau and Wessler， 1992），后来发现MITE也存在于其它显花植物及动物基因组中(Feschotte et al.， 2002b)。MITE在结构上与DNA转座子的非自主元件相似（图1），但MITE的高拷贝数、特征靶位点和家族内序列的一致性，使其明显不同于已鉴定出的非自主元件(Wessler et al.， 1995)，因此，MITE被认为是一类新的DNA转座子。MITE家族是丰富而多样的，但其仍有许多一般特性，如长度短（<500 bp），有靶位点重复(target site duplication，TSD) 和末端反向重复序列(terminal inverted repeat， TIR)，缺乏编码能力，一般富含A/T。在有些情况下，TIR可以形成稳定的茎环结构(Wessler et al.， 1995)。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金项目（编号：20050157003）资助 *通讯作者：张志宏，教授、博士，研究方向：果树生物技术。
中国科学院大学研究生“表观遗传学”课程 高等植物表观遗传调控 —转座子
Transposable Elements ?Classification and transposition ?Plant genomes and evolution ?Epigenetic regulation and transposon silencing ?Impact of transposable elements on plant development ?Impact of transposable elements on human disease
Transposons ?Fragments of DNA that can insert into new chromosomal locations ?Some copy themselves and increase in number within the genome ?Responsible for large scale chromosome rearrangements and single-gene mutagenic events Surridge, C. (2001) Nature Review Genetics. 2: 404.
Content of T ransposable Elements in Various Genomes 拟南芥 水稻 玉米 小麦 人
Controlling transposable element (TE) ?First identified by McClintock in maize ?Ubiquitously present with high abundant in plant and animal genomes ?Transposition of TEs is a major driving force for genome evolution ?Host genomes have evolved diverse mechanisms to limit harmful mobilization ?Epigenetic regulation has been implicated to control TE activities