组织培养报告
探究不同激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系
姓名：郭林
学号：10121910202
组员：覃治祯
日期：2014年11月13日
目录
摘要 (2)
关键词 (2)
0背景 (2)
1材料和方法 (3)
1.1实验材料 (3)
1.2组织培养环境 (3)
1.3试剂和器材 (3)
1.3.1实验试剂 (3)
1.3.2实验仪器 (4)
1.4实验方法 (4)
1.4.1培养基的配制 (4)
1.4.2外植体前处理与接种 (4)
1.4.3观察产生愈伤组织 (5)
1.4.4愈伤组织的培养 (5)
2结果 (5)
2.1诱导率 (5)
2.2形态学 (5)
3讨论与分析 (7)
3.1外植体的选择 (7)
3.2内源激素对愈伤组织诱导的关系 (8)
3.3外源激素对愈伤组织诱导的影响 (9)
参考文献 (10)
附录 (12)
探究激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系
摘要：本实验以MS培养基为基础培养，分别在MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L 和MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L两种培养基上对烟草叶片进行愈伤组织的诱导，探究相同烟草叶片不同激素6-BA和NAA浓度配比对烟草叶片愈伤组织诱导的关系。结果表明在MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织更利于叶的分化，且诱导出的愈伤组织的体积较大，在MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上诱导出的愈伤组织更利于根的诱导，且诱导出的愈伤组织的体积较小。
关键词：烟草，脱分化，愈伤组织，培养基，激素
0背景
我国大多数师范院校都普遍开设植物生理学或植物生物技术类实验课程，其中植物组织培养技术作为一项基础技术成为必修实验。我校植物组织培养实验属于《植物生理学实验》课的一部分，实验内容以诱导叶片脱分化形成愈伤组织为主。实验部分仍然按照传统的教学环节进行培养基配制（3学时）和无菌操作（3学时），着重实验技术的指导与学习。
根据植物细胞全能性的原理，特别是在生长素和细胞分裂素的作用下，植物可以脱分化成愈伤组织。烟草（Nicotiana tabacum），茄科，多年生植物，是重要的模式生物，因此也被我校选为植物组织培养的材料。众所周知，生长素在植物体内分布是不均匀的，嫩叶中生长素分布较多，老叶中分布较少，在诱导植物形成越伤组织的过程中，内源激素在一定程度上也起着重要的调节作用。除此之外，选取的外源激素的浓度配比不同都会对愈伤组织有一定影响。胡伟、陈豫、伍洋等人在对不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响中发现，在以萝卜直根为实验材料，不同激素NAA、2,4-D、6-BA浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量有一定的影响。[1]20世纪50年代以来，烟草愈伤组织的诱导遵循Skoog-MiUer分化模式：培养基内生长素和细胞分裂素的浓度和比值制约芽
和根的分化。这一原则被广泛地应用于植物组织培养实践。细胞分裂素的浓度低，生长素的浓度高时易形成愈伤组织；反之，细胞分裂素浓度高，生长素的浓度低时，有利于芽的分化。本课题实验选用烟草叶片，进行愈伤组织的诱导，并观察其在不同激素浓度的培养基上的诱导情况。
1材料和方法
1.1实验材料
烟草（Nicotiana tabacum）叶片
1.2组织培养环境
培养条件为28℃，暗处理一周后，进行24小时光照培养。如图1所示。
图表 1烟草愈伤组织培养环境
Fig.1 Tobacco callus culture environment.
1.3试剂和器材
1.3.1实验试剂
MS培养基(配方见附录)、琼脂、蔗糖、6-BA，NAA，75%酒精，0.1%HgCl2等。
1.3.2实验仪器
烧杯、玻璃棒、量筒、容量瓶、漏斗、培养室、无菌室、超净工作台、高压灭菌锅、三角烧瓶、移液枪、棉线、培养皿、滤纸、解剖刀、剪刀、镊子、牛皮纸、称量纸、天平、酒精灯、打火机、直尺。
1.4实验方法
1.4.1培养基的配制
本实验选用MS培养基为基础培养基加不同配比的激素及浓度。激素配比如表1所示。
表1 两个实验组激素的浓度配比
6-BA NAA
第一组1mg/L 0.2mg/L
第二组0.1mg/L 0.5mg/L
1.4.1.1称取15g蔗糖溶解于100mL水，定容到500mL配制MS培养基，平均分装到两个锥形瓶中。并按照表1所示加入激素配比。
1.4.1.2调节PH至5.8，然后分别分装到5个装有0.4g琼脂的100mL锥形瓶中，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶口，棉线扎牢，然后将培养基和解剖工具、装有滤纸的培养皿、蒸馏水一起在高压灭菌锅中121℃，20分钟灭菌备用。
1.4.2外植体前处理与接种
1.4.
2.1选取健壮的烟草叶片在自来水下将表面的灰尘及杂质冲洗掉，切成小快；
1.4.
2.2在无菌室用75%酒精侵洗30s，然后用无菌水洗3-5次；
1.4.
2.3叶片放于0.1%升汞溶液中浸泡3-5min，然后无菌水洗3-5次，滤纸吸干；
1.4.
2.4把叶片切成1.5cm*1.5cm小块，转移植物到培养基中进行培养，每瓶3块。
1.4.3观察产生愈伤组织
观察愈伤组织的分化情况直至长出根和芽，比较不同激素条件下诱导的愈伤组织的差别。
1.4.4愈伤组织的培养
将接种好的烟草愈伤组织放入恒温培养室中，温度为28℃，暗处理一周后，进行24小时光照培养。对培养20天后的烟草愈伤组织诱导率进行统计学分析，并对成形的愈伤组织进行观察，且从接种的第1天到第45天对烟草叶片的变化情况进行观察记录。
2结果
2.1诱导率
接种15天后对不同培养基上愈伤组织数量进行统计，从是否出现愈伤组织的情况来看：MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L培养基和MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L培养基两种培养基上诱导出的愈伤组织的诱导率相同，即愈伤组织的诱导率与激素的配比无直接关系。如表2所示。
表2 两种培养基上的诱导率
MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2mg/L MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L
外植体个数污染个数15
15
愈伤组织数污染率15
15
诱导率（%）100 100
注：诱导率=（产生愈伤组织的叶片数/接种的叶片数）×100%
2.2形态学
在两种培养基上接种的烟草叶片的变化历程为：接种后的第4天，MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L和在MS+6-BA 0.1 mg/L +NAA 0.5mg/L两种培养基上的叶片边缘的几个角都与培养基接触，其他部分脱离培养基呈现拱形；接种后的第6-9天，MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上的烟草叶片，与培养基接触的
部分长出一小点的愈伤组织，接种后的第9-11天，接种在MS+6-BA 0.1 mg/L +NAA 0.5mg/L培养基上的烟草叶片，与培养基接触的几个角出现愈伤组织；愈伤组织逐渐从边缘像中间生长，最终几乎整个烟草叶片都长成愈伤组织。在接种后的第16天，MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上的愈伤组织上出现绿色组织，MS+6-BA 0.1 mg/L +NAA 0.5mg/L培养基上的愈伤组织长白色的毛状组织；第20天后，在MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上可明显分辨出愈伤组织分化出的叶片，0.1 mg/L +NAA 0.5mg/L培养基上愈伤组织分化出的根。如图2所示。
图2 愈伤组织的生长历程
但在MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L培养基上形成愈伤组织的时间快，约为6-9天，且形成愈伤组织的体积较大，在MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L形成愈伤组织的时间较慢，约为9-11天，且愈伤组织的体积较小。如图3所示。
a b
图3 不同培养基上愈伤组织大小比较
注：图为接种第25天后的照片.a为MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L培养基上生长的愈伤组织，b为MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L培养基上生长的愈伤组织
在MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织以长叶为主，生长一段时间后，有少量的根状组织出现，且组织块较大。在MS+6-BA 0.1 mg/L +NAA 0.5mg/L培养基上诱导出的烟草叶片的愈伤组织以长根为主，生长一段时间后又少量的绿色组织出现。如图4所示。
a b
图4 接种30天后愈伤组织
注：图a为MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织，以长叶为主，有少量的根，图b为MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L培养基上诱导的烟草叶片的愈伤组织，根发到，可见少量绿色组织。
3讨论与分析
3.1外植体的选择
研究表明，外植体的选择对愈伤组织的诱导有很大影响。王晓娟等人在对大花萱草不同外植体诱导愈伤组织的比较研究中发现，外植体的取材读愈伤组织的诱导有影响。内源激素对胚性细胞及体胚的形成有重要影响。[2]范小峰，杨颖丽，郭晓强，刘秀丽在对乌拉尔甘草不同外植体愈伤组织的诱导及影响因子研究中发现，不同外植体对乌拉干草愈伤组织的诱导有一定影响。[3]总的来说，含有大量分生组织的植物器官是理想的材料。烟草幼嫩叶片含有大量活跃分裂的细胞，很适合愈伤组织的诱导。实验中，虽然取材于同一批烟草，但由于烟草叶片的取材位置不一样，所以不同实验组在相同培养基上愈伤组织的诱导不尽相同。如图5所示。
图5 不同实验组在相同培养基上诱导情况
注：图为接种44后拍摄的不同实验组在同一时间的MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L 培养基上接种的烟草叶片的愈伤组织的诱导剂分化情况。
3.2内源激素对愈伤组织诱导的关系
植物在生长发育的过程中，内源激素对愈伤组织的生理状态有着极其重要的影响，其种类、含量极其协调平衡是关键。内源激素对胚性细胞及体胚的形成有重要影响。[4，5，6，7]刘清等人在研究内源激素对水稻的研究中发现，IAA含量过高不利用愈伤组织的诱导和生长，Z对愈伤组织诱导的启动有决定性作用，如果外植体中的Z含量太低，即使有较高的IAA含量也诱导不出愈伤组织；过高的ABA对愈伤组织的诱导不利。[8]内源激素一样对其有很大影响。顶芽和侧芽之间有着密切的关系，顶芽生长旺盛时，侧芽会受到抑制。如果由于某种原因顶芽生长受到抑制，则侧芽迅速生长。这种顶芽优先生长，侧芽受到抑制的现象叫做顶端优势。在Wertheim S.J的研究中发现苹果的冠果产生的可扩散性生长素明显高于侧位果的生长素的量。[9]Gruber J把番茄作为实验材料, 证明先期发育的器官可以通过其向外运输的生长素抑制后发育的器官中生长素的向外运输, 从而抑制它的生长。[10]朱庆生在文献提出，生长素在植物体内由上到下有一个浓度梯度，顶芽可以较快得到生长而侧芽生长受抑制。[11]
3.3外源激素对愈伤组织诱导的影响
外源激素对植物组织培养有着重要的影响。胡伟、陈豫、伍洋等人在对不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响中发现，在以萝卜直根为实验材料，不同激素NAA、2,4-D、6-BA浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量有一定的影响。[1]高瑛用不同的外源激素对黄芩无菌短枝组织培养，发现不同的外源激素对黄芩愈伤诱导有很大影响。[12]阮氏钏等人研究发现不同外源激素及其浓度对青钱柳愈伤组织不定芽的发生有着重大影响。[13]葛淑芳、章艺等人在研究外源水杨酸对烟草叶片代谢的影响的研究中发现，喷施适宜浓度的SA能够显著提高植株叶绿素a,b含量[14]。20世纪50年代以来，烟草愈伤组织的诱导遵循Skoog-MiUer分化模式：培养基内生长素和细胞分裂素的浓度和比值制约芽和根的分化。这一原则被广泛地应用于植物组织培养实践。细胞分裂素的浓度低，生长素的浓度高时易形成愈伤组织；反之，细胞分裂素浓度高，生长素的浓度低时，有利于芽的分化。
本实验目的是探究烟草叶片在以MS培养基，都含有NAA、6-BA两种激素，但激素浓度配比不一样，分别为MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L培养基。本实验中也发现MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织更有利于叶的分，在MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L培养基上诱导出的愈伤组织更有利于根的分化。如图6所示。
a b
图6.两种培养基上诱导的愈伤组织的分化情况
注：图a为MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织的再分化情况，图b为MS+6-BA 0.1 mg/L +NAA 0.5 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织的再分化情况。
参考文献
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附录
烟草植物组织培养实验 一实验目的学习和掌握植物组织培养技术。深刻理解植物细胞的全能性。 二实验原理 植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸IBA）细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤6-BA、6-糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（KT-30，CPPU））等。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括：1. 矿质营养。矿质营养又叫无机营养，
粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.doczj.com/doc/c66469867.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
烟草植物组织培养实验实验目的一学习和掌握植物组织培养技术，理解植 物细胞的全能性。实验原理二年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地世纪30植物组织培养是从20少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物、萘乙4-D4-二氯苯氧乙酸2，，质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2）细胞分裂素IBA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸NAA酸、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA））等。分裂期是，KT-30CPPU糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（6-（苄氨基嘌呤6-BA、6-指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化1 / 5 矿质营养。矿质营养又叫无机营起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括： 1. 、养，是指植物在生长发育的过程中所需要的各种化学元素，其中包括大量的元素如N、P 2. Mn、Zn、Cu等，其对植物的生长发育中有着重要的生理作用。FeK和微量元素如、B、维生素。维生素能够以辅酶的形式参与多种酶系的反映，直接影响到蛋白质、糖、脂肪等植物生长物质。其
烟草叶片的组织培养 一、实验原理与实验步骤 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 植物材料：烟草植株 药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞 仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子 二、实验方法与步骤
注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。 （2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。 三、培养基配制和灭菌 本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
烟草的组织培养技术 一、目的与要求 1.验证“植物细胞全能性”理论。 2.学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。 二、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织（器官或细胞）的技术。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出细胞的全能性，从已经分化的细胞通过脱分化，成为重新具有分裂能力的胚性细胞，并能再分化重新生长发育成完整的植株。 愈伤组织：是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的细胞团。 脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。 再分化：经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。 三、材料和用具 1.材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽），拟南芥。 2.用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解 剖刀、大、小镊子、30ml烧杯、500ml烧杯、药勺、玻璃棒、培养 瓶、平皿、试纸（PH5.4-7），报纸等。 3.试剂：MS培养基、0.5mol/LNaOH、1mol/L HCl。 四、操作步骤 （一）诱导培养基配制（见表1）
1.加MS储液（储液配置见附表） 大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀，建议加完大量元素后先加水（约总体积3/4），再加各微量元素和有机成分。 铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。储液中的铁盐存于棕色瓶中。配好的储液应当4℃保存。表1是4瓶培养基（1组）的配置方案。 表1 诱导培养基配制表 成分实际称取量 蒸馏水120 ml MS母液15 mL 蔗糖 4.5 g 用蒸馏水粗略定容至100ml pH值 5.8 琼脂 1.2 g 2.加蔗糖（3%）（m/v）。蔗糖是碳源，同时起到维持渗透压的作用。 3.调pH=5.8。pH过低，高温处里时间过长，都可能会使培养基不凝。 4.加琼脂（0.7-0.8%）（m/v）琼脂粉是固化剂、支持物。 （二）灭菌 1.培养基、解剖刀、镊子、平皿需在高压灭菌锅120℃，灭菌15min。 2.接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射30min。 3.用肥皂洗手和手腕。进入无菌间，先用70%酒精或新洁尔灭喷手。关掉 无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，关掉超净工作台上的紫外灯。（三）接种 1.坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦拭双手、培养瓶和超净台面。 2.待手上的酒精干了，点燃酒精灯。 3.将培养瓶的盖子旋松，但不要打开，放到无菌风道侧面备用。 将镊子、解剖刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后，放到培养皿上备用。 4.用镊子和解剖刀取出一块叶盘，放到平皿上，切取烟草叶芽1-2块，插 入培养基。
烟草叶片愈伤组织诱导 摘要用不同成分培养基，附加0.8%琼脂，3%蔗糖，调pH5.8—6.0，取烟草叶片 作为外植体进行愈伤组织诱导培养，计算污染率、诱导率以及诱导情况，观察愈伤 组织的发生情况。实验表明，养分较高的培养基，外植体生长情况较好。当细胞分 裂素高于生长素的浓度时，有利于分化出芽；细胞分裂素低于生长素的浓度时，有 利于分化出根；当细胞分裂素及生长素的浓度适合时，愈伤组织不分化，但是生长 旺盛。 关键词：烟草叶片愈伤组织诱导 前言 烟草（Nicotiana tabacum）又名草烟，属茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种，原产于美洲和大洋洲[1]。烟草是重要的经济作物和工业原料作物，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料[2]。有报道烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质，因此很有必要对烟草的组培快繁进行研究，以获得更有效的方法提高产率和产量。柯善强综述植物细胞的遗传全能性与组织培养形态发生控制[3]，戴冕进行了烟草叶肉原生质体再生植株的研究[4] ,徐瑞娟等通过烟草花序苞叶的离体培养分化出花芽[5],战淑敏用烟草叶组织培养直接获得再生植株[6]。本实验以烟草叶片组织为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织，观察愈伤组织诱导情况。 1.材料与方法 1.1 配置培养基母液，每2人为一个小组，配置以下培养基，并分装，灭菌，然后室温下放置一周。 1.2 取烟草叶片取烟草的嫩叶片作外植体。先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗2次后，置于超净台上，于无菌条件下先用75%的酒精浸泡30秒，然后置于无菌瓶中用10%次氯酸钠溶
液浸泡20分钟至30分钟，再用无菌水冲洗4次，最后在无菌培养皿中将嫩叶片切成1cm见方小块，接种在培养基中。 1.3.1 观察污染情况：观察是否有细菌性污染（菌斑呈粘液状,接种后1-2天出现）和真菌性污染（出现不同颜色霉菌,接种后3-10天出现），并计数。计算污染率。 污染率(%)=污染的材料数/总接种材料数×100%[7] 1.3.2 观察各培养基中的外植体产生愈伤组织的情况，愈伤组织出现时间和愈伤组织形态特征（颜色和质地等），计数形成愈伤组织的材料数，并计算诱导率。 诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%[7] 2.结果及分析 2.1愈伤组织诱导情况 三天后发现部分组有细菌性污染（如图1），7天后发现部分有真菌性污染。计算出污染率和如表1所示： 表1. 愈伤组织诱导的污染情况 造成污染的可能原因有：叶片消毒灭菌不彻底，接种室超净工作台消毒不彻底，接种操作时操作不规范等等。 叶片在第4天后边缘慢慢上卷，外植体开始膨胀，于接种后第7 天膨大成圆拱型，愈伤首先发生在叶片边缘, 为黄绿色颗粒状，有些呈现半透明。随着进一步培养, 10天愈伤组织不断加大。 排除褐变及感染的外植体后，诱导情况如表2所示： 表2.愈伤组织诱导情况
实验1 愈伤组织的诱导 1、实验目的 （1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术； （3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。 由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂 仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。 无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。 试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤 （1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。 （2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。 （3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。 （5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。 （6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。 （7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。 5、结果记录与分析 （1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100% （2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题 （1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。 （2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？ 实验二真菌菌丝DNA提取 1实验目的 学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各
2,4- D和6-BA对烟草组织培养的影响刘璐华南师范大学生命科学学院 08生物科学一班 20082501055 摘要：以烟草为实验材料，在不同配方的培养基（①MS + 6-BA0.5 mg/L + 2,4- D0.5mg/L ②MS + 2,4-D0.5mg/L ③MS + 6-BA2.0mg/L + 2,4-D0.5mg/L）中进行组织培养， 观察其愈伤组织的形成及分化。通过实验，我们得出，6-BA与2,4- D配合使用， 可以更有效地诱导愈伤组织的形成。单独使用2,4- D可促进愈伤组织根的分化，而 6-BA则可以有效地诱导愈伤组织芽的分化，且6-BA浓度为2.0mg/L时的效果比浓 度为0.5 mg/L时要好。 关键词：烟草组织培养2,4- D 6-BA 烟草(Nicotiana tabacum L.) ，属茄科烟草属，是植物组织培养的模式植物。生长调节物质是植物组织培养中不可缺少的一类物质，虽然用量极少，但它们对外植体愈伤组织诱导起着重要的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。常用的生长素类有2,4- D、NAA、IAA、IBA，而细胞分裂素类主要有KT、6-BA、ZT、2-iP、4-PU和TDZ。 本研究以烟草叶片为材料，结合本小组和其他两组的实验结果，探讨2,4-D对愈伤组织形成与分化的作用，以及它和不同浓度6-BA共同使用的效果。 1 材料与方法 1.1材料 烟草（Nicotiana tabacum L.） 1.2方法 1.2.1配制MS培养基母液和植物生长调节物质母液。[1] 1.2.2配制培养基和灭菌。[1]培养基的配方为①MS + 6-BA0.5 mg/L + 2,4- D0.5mg/L（我们第2实验小组所做）②MS + 2,4-D0.5mg/L（由第1实验小组所做）③MS + 6-BA2.0mg/L + 2,4-D0.5mg/L（由第7实验小组所做） 1.2.3外植体（烟草叶片）的消毒与接种。[1]观察记录各组的愈伤组织生长情况以及污染情况。 1.2.4愈伤组织的继代培养。将愈伤组织转入配方为MS + 6-BA1.0mg/L + NAA0.5mg/L的培养基上进行继代培养，观察记录生长情况。 2 结果分析 2.1愈伤组织的形成 培养开始的3天内，外植体在形态上并无明显变化，只是其体积比接种时稍微大了一些。5天后，外植体从切口处开始膨大并出现黄色小颗粒，形成愈伤组织，外植体隆起且边缘有卷曲现象。而污染方面，我们第2组一共接种16瓶培养基，有5瓶出现了霉菌污染，污染率为31.25% 。 对比三个实验组的愈伤组织，可以发现，我们第2实验小组的愈伤组织生长情况与第7
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标， 绘制鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 实验步骤 1. 农杆菌感受态的制备： 1)接菌于5 ml YEB液体培养基(Rif 50 mg/L)中，28℃，200转/分钟，培养1～2天； 2)取1mL活化的菌液接种于50mlYEB液体培养基中，同样条件下培养至OD600值为
水稻愈伤组织的诱导实验 报告 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出
烟草组织培养实验方案 摘要本实验通过配制四种培养基来实现烟草种子萌发，种子苗叶片诱导、分化及植株再生，从而获得课题所需要的基因受体植株。 关键词烟草组织培养 前言 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。烟草是典型的基因工程模式植物,易于进行组织培养, 容易得到再生的转化植株。 一实验植物：华烟6号 二实验材料：华烟6号种子 三实验方法与步骤 1．培养基的配制 本次实验使用（1）种子萌发培养基：MS培养基+GA30.7mg/L；（2）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（3）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（4）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强度2 000 lx。 2. 培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） 3. 无菌苗的获得 把烟草种子用市售丝袜（或纱布）包好，先分别用75%乙醇或无菌水浸泡30 s，用无菌水洗净表面抑制种子萌发的药物，待洗涤的水清澈透明，然后将烟草种子用70%酒精浸泡1 min, 10%NaClO消毒10 min,经无菌水漂洗后，在超净工作台处（紫外灭菌20～30min）接种于以配置好的（1）培养基,放入(27±1)℃的光照培养架中培养。光照周期为10 h(8:00~18:00)光照,12 h暗培养。种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。 4. 烟草叶片愈伤诱导及不定芽分化 在超净工作台上取上述烟草无菌苗幼嫩叶片1~2片于无菌培养皿中，将叶片切成1.0～1.5平方厘米的小方块，接入（2）中培养。约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（3）上，3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。光照时间8～12小时，温度通常在23～28℃之间。 5. 诱导生根及移栽 取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（4）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。 四数据记录：
中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制 一 .实验目的 1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。 2、掌握植物MS 培养基的配制方法。 3、学会使用高压灭菌锅。学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定 二 .实验原理 概念： 1.植物组织培养： 将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。 2.愈伤组织及脱分化、再分化： 植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 培养基配置见下表 化合物 含量 mg/L 母 液 吸取母 液量 ml/L 编号 浓度 mg/ml 称量 mg 配制量 ml NH 4NO 3 1650 1 33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O 440 2 8.8 4400 500 25
三 .主要仪器试剂 三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4?7H2O 、CaCl2?2H2O 、 ZnSO4?7H2O 、MnSO4?4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。 四.实验操作步骤 1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处 a.可减少每次配制称量药品的麻烦. b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。 母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。 （2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。 2）实验中用到的各母液 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 0.86 430 500 5 MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62 310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4 0.25 125 500 0.5 CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025 12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸 0.5 11 1 25 25 0.25