摘要......................................................................... (4)
【实验过程】 (3)
PartⅠ. NDV 抗血清制备 (3)
一、实验原理 (3)
二、实验仪器、材料和试剂 (4)
1. 仪器 (4)
2. 材料 (4)
3. 试剂 (4)
三、方法和步骤 (4)
（一）NDV 兔抗血清制备 (4)
1. 家兔捉拿方法 (4)
2. 家兔固定方法 (4)
3. 初次免疫 (5)
4. 二次免疫 (5)
5. 终末免疫 (6)
6. 试血 (6)
7. 颈动脉放血 (6)
8. 血清分离 (6)
9. 抗血清保存 (7)
（二）NDV 鼠抗血清制备 (7)
1. 小白鼠的捉拿和固定 (7)
2. 初次免疫 (7)
3. 二次免疫 (8)
4. 终末免疫 (8)
5. 试血 (8)
6．放血 (9)
7．血清分离 (10)
8．抗血清保存 (10)
Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (10)
一、基本原理 (10)
二、实验仪器、材料和试剂 (10)
1. 仪器 (10)
2. 材料 (10)
3. 试剂 (10)
三、方法和步骤 (10)
1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 (10)
2. 1%琼脂糖配制 (10)
3. 倒平板 (10)
4. 打孔 (10)
5. 稀释抗血清 (11)
6. 加样 (11)
7. 孵育 (11)
8. 结果观察 (11)
Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (12)
一、基本原理 (12)
二、实验仪器、材料和试剂 (12)
1. 仪器 (12)
2. 材料 (12)
3. 试剂 (12)
三、方法和步骤 (12)
1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 (12)
2、抗原包被 (13)
3. 封闭 (13)
4. 洗板 (13)
5. 稀释抗血清 (13)
6. 加抗血清 (13)
7. 洗板 (13)
8. 加酶标二抗 (13)
9. 洗板 (13)
10. 显色 (13)
11. 终止 (13)
12. 读数 (14)
13. 结果判定 (14)
Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (14)
一、基本原理 (14)
二、实验仪器、材料和试剂 (14)
1. 仪器 (14)
2. 材料 (14)
3. 试剂 (14)
（1）SDS-PAGE 相关试剂： (14)
（2）Western blotting 相关试剂： (15)
三、方法和步骤 (15)
1. SDS-PAGE (15)
2. 转膜 (16)
3. 免疫检测 (16)
（1）膜的封闭 (16)
（2）洗膜 (16)
（3）加入一抗 (17)
（4）洗膜 (17)
（5）与二级抗体作用： (17)
（6）洗膜 (17)
（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 (17)
【实验结果及分析】 (17)
NDV 抗血清制备及抗体效价测定
摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡
瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行家兔与小鼠的新城疫病毒抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验、兔疫印迹实验对其进行抗体效价检测。
关键字：NDV 抗血清抗体效价免疫
【实验过程】
本次实验一共分为四个大步骤：
PartⅠ. NDV 抗血清制备
一、实验原理
将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应 B 细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫
病
毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病
毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的
一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。
二、实验仪器、材料和试剂
1. 仪器
5mL 无菌冻存管，2.5mL 和 1mL 注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL 无菌三角瓶，50mL 无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL 吸头和移液器，温箱，离心机。
2. 材料
家兔：1-2kg 清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF 级 6-8 周龄昆明鼠。
3. 试剂
鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以 NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。
三、方法和步骤
（一）NDV 兔抗血清制备
1. 家兔捉拿方法
动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图 1）。
图 1. 家兔的捉拿方法
2. 家兔固定方法
家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。使用时时可将
家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。（如图2）
图 2. 家兔固定箱固定方法
在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。固定方法是：先以四条 1cm 宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。（如图3）
图 3. 家兔手术台固定方法
3. 初次免疫
在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.1～0.2mL。如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒 Ulster 2C 株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。（如图4）
图 4. 家兔耳缘静脉注射方法
4. 二次免疫
第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种
点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。
5. 终末免疫
第二次免疫后间隔 2 周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。
6. 试血
终末免疫免疫 7 天后经兔耳缘静脉采血 2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达 1:16 以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫 l 次后，再
行检测。
7. 颈动脉放血
将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部。沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。（如图5）
图 5. 兔颈部血管神经分布图
将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端，
（图 6）。
图 6. 兔颈部动脉血管
先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。
8. 血清分离
将血液置室温中凝固约 1hr，然后置 4℃过夜，使血块收缩；用 5mL 无菌移液管吸取上层血清，转移至 50 mL 无菌尖底离心管中。然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一 50 mL 无菌尖底离心管，在 4℃下 2,500g 离心 10 分钟，取上清液即血清部分与前
述血清混合，将混合血清 4℃1,500g 离心 10 分钟，弃沉淀收集血清。
9. 抗血清保存
（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入 0.0l％硫柳汞或 0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放 3 个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。
（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存 5 年抗体效价不会有明显下降。抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。（二）NDV 鼠抗血清制备
1. 小白鼠的捉拿和固定
小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。如操作时间较长，也可固定于小白鼠固定板上。（如图7）
图 7. 小白鼠的捉拿和固定
2. 初次免疫
分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。
（1）腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，颈部拉直，右手持注射器（5～6 号针头），从耻骨联合上一侧向头端以 30 度角刺入腹腔（应避开膀胱）。可先刺入皮下 2～3mm，再刺入腹腔，以防药液外漏。针头刺入部位不宜太高太深，以免刺破内脏。注射量一般为 0.1～0.25mL/10g 鼠重。
图 8. 小鼠腹腔注射法
（2）皮下注射法：一般两人合作。一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾；另一
人左手提高背部皮肤，右手持住注射器（针头号同上），将针头刺入提起的皮下。若一人操作，左手小指和手掌夹住鼠尾，拇指和食指提起背部皮肤，右手持注射器给药。一般用量为0.05～0.25mL/10g 鼠重。
图 9. 小鼠皮下注射法
（3）肌肉注射法：两人合作时，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一侧后肢，右手持注射器，注射部位多选后腿上部外侧（针头号同上）。如一人操作，抓鼠方法类似腹腔注射，只是药液注射在肌肉内，每腿的注射量不宜超过 0.1mL。
（4）尾静脉注射法：将小鼠置于待置的固定筒内，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂擦，或插入 40℃～50℃温水中浸泡片刻，使尾部血管扩张。左手拉尾，选择扩张最明显的血管；右手持注射器（4～5 号针头），将针头刺入血管，缓慢给药。如推注有阻力而且局部变白，说明针头不在血管内，应重新插入。穿刺时宜从近为尖部 1/3 处静脉开始，以便重复向上移位注射。一般用药量为 0.1～0.2ml/10g，不宜超过 0.5ml/10g。
图 10. 鼠尾皮下注射法
3. 二次免疫
第一次免疫后间隔 2 周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。
4. 终末免疫
第二次免疫后间隔 2 周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。
5. 试血
末次注射 7 天后鼠眼球采血 0.2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16 以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强 l-2 次后，常可使效
价增高。鼠眼球采血可采用以下两种方法：
（1）眼眶后静脉丛采血：用 7~10cm 长的玻璃取血管，其一端内径为 1—1.5 mm，另一端逐渐扩大，细端长约 1cm 即可，将其尖端折断，使其锋利。将取血管浸入 1%肝素或其它抗凝剂溶液处理，干燥后使用。采血时，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动 1min，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。取用肝素过的医用毛细采血管，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约 2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2—0.3 ml，大鼠一次可采 0.5—0.1ml（图 11）。
图 11. 鼠眼眶后静脉丛采血法
（2）眶动脉和眶静脉取血法：右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，用镊子拔去一侧鼠眼球，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用无钩弯镊子或弯止血钳迅速摘除眼球，立即将鼠倒置，头朝下，眼眶内很快流出血液，将鼠血滴入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。注意不要让小鼠流血过多，以免死亡。一般只适用于一次采血。大部动物采血后可以存活，可采另一侧眼球取血。此法既能采取较大量的血液，又可避免断头取血法中因组织液的混入导致溶血的现象，现常取代断头取血法。先使动物眼球突出充血后，以弯头眼科镊迅速钳取眼球，并将鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液，让血液滴入盛器，直至不流为止。此法由于取血过程中动物未死，心脏不断在跳动，因此取血量比断头法多，一般可取鼠体重 4～5％的血液量，是一种较好的取血方法。
（3）剪尾采血：需血量少时可用此方法。将动物固定，显露尾部，将尾尘剪去约 5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。若用二甲苯棉球涂擦尾部或事先将鼠尾浸在 45℃水中数分钟，使尾部血管充盈，可采到较多的血，但注意二甲苯可致溶血。也可用锋利刀片割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出，采血后，消毒，止血。如将动物麻醉取血量可更多些。三根尾势脉可交替切割，并自尾尖向尾根方向切割，小鼠每次采血约 0.1ml。
6．放血
小鼠也可以采取眶动脉和眶静脉取血法放血，此外还可用如下方法：
（1）断头取血：当需要较大量的血液，而又不需继续保存动物生命时采用此法。左手捉持动物，使其头略向下倾，右手持剪刀猛力剪掉鼠头，让血液滴入盛器。小鼠可采血 0.8～1.0ml，大鼠可采用 5～8ml。
（2）心脏取血：动物仰卧固定在固定板上，剪去心前区部位的被毛，用碘酒酒精消毒皮肤。在左侧第 3～4 肋间，用左手食指摸到心搏处，右手取连有 4～5 号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，当针刺入心脏时，血液由于心脏跳动的力量自动进人注射器。此法要求实验者掌握以下要点：要迅速而直接插入心脏，否则，心脏将从针尖处滑脱；如第一次没刺准，将针头抽出重刺，不要在心脏周围乱探，以免损伤心、肺；要缓慢而稳定的抽吸，否则，太多的真空反而使心脏塌陷。若不需保留动物生命时，也可麻*醉后切开动物胸部，将注射器直接刺人心脏抽吸血液。
7．血清分离
血清分离方法与（一）8 相同。
8．抗血清保存
抗血清保存方法与（一）9 相同。
Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价
一、基本原理
抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，称为免疫扩散实验（immuno diffusion）。将抗原与其相应抗体加入含有一定电解质的琼脂凝胶平板中邻近孔内，抗原和抗体从小孔向四周自由扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位时，出现白色的免疫复合物沉淀线，即双向琼脂扩散试验。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。如果反应材料中有两种以上的抗原抗体系统，则两孔间出现多条沉淀线。此方法最早由 Ouchterlony 提出，因此又称为 Ouchterlony 技术。本次实验将以 WF83 株酚水抗原检测兔抗 APP 抗血清效价，其中酚水抗原以 APP 的荚膜和脂多糖抗原为主，本方法也是 APP 血清学分型的常用方法。
二、实验仪器、材料和试剂
1. 仪器
11cm 平皿，200μL 微量可调移液器和吸头，打孔器，针头，1.5mL eppendorf 管，50 mL离心管，离心管架，温箱，微波炉，离心机。
2. 材料
鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。
3. 试剂
0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），琼脂糖，鸡新城疫病毒抗血清，氯仿。
三、方法和步骤
1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取
取鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司）1mL，加氯仿500μL，漩涡振荡器上充分混合均匀，高速台式离心机 12000rpm 离心 15min，收集上清备用。
2. 1%琼脂糖配制
称取琼脂糖粉 0.3 克，放入三角瓶，加入无菌生理盐水 30mL，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
3. 倒平板
取无菌 9cm 玻璃培养皿 1 个，平放于实验台（台面要水平），将融化的 1%琼脂溶液趁热倒培养皿中（约加 25mL），使琼脂厚度达 4mm，在室温下放置使琼脂冷却凝固。
4. 打孔
先取一张一张纸，画上将要打孔的图样，通常双向琼脂扩散实验打孔有双孔、线性排列3 孔、三角形排列 3 孔、正三角形排列 4 孔、十字形排列 5 孔、梅花形排列 7 孔琼脂糖
等模式（图）。将图样放在琼脂糖平板下方，将打孔器在正对图样为空的正上方垂直于琼脂糖平板上轻轻按下再用注射器针头挑取孔中琼脂糖，即形成加样微孔。注意在用注射器针头挑取孔中琼脂糖时不要碰伤了孔周围的琼脂。待微孔全部打好后，将平板经过酒精灯外火焰加热封底（温度不宜过高，防止琼脂融化过多，孔塌陷）。为了测定 NDV 免疫血清的效价，本实验采用梅花状排列的小孔，孔径为 8mm，空间距为 5-8mm。打好孔后用记号笔在琼脂平板的底面将孔编号。
图 12.琼脂双扩散实验打孔图样
5. 稀释抗血清
取 1.5mL 无菌尖底 12支离心管排列于离心管架上并做好标记，在每管各加生理盐水100μL，吸取 100μL 免疫血清加入第 1 管，并充分混匀后吸出 100μL 加入第 2 管，经充分混匀后吸出 100μL 加入第 3 管中，如此依次 2×稀释至第 10 管，混匀后吸出 100μL 弃去。此时 1～10 管血清稀释度为 1:2～1:64。
图 13 稀释抗血清
6. 加样
在每组呈梅花状排列的小孔的中央孔加入一滴灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原（30μL），周围各孔依次加入未免疫动物血清、不同稀释度抗血清各 30μL。加样时注意不要使液体溢出孔外。
图 13.琼脂双扩散实验加样图
7. 孵育
盖上平板盖放入湿盒，置 37℃温箱孵育 24～48h。
8. 结果观察
将平板从湿盒中取出，在散射光的背景下（平板后方约 15cm 处用手或深色物挡住）观
察，或在凝胶成像系统上用白光光源观察，看抗原孔与不同稀释度的抗血清孔之间是否有白色沉淀线，有沉淀线为阳性，否则为阴性。
图 14. 琼脂双扩散沉淀线
Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价
一、基本原理
酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, 简称 ELISA）是酶免疫技术的
一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶催化反应的高效性相结合而建立的一种技术，其基本原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，当酶标记抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液的参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量呈比例关系，用酶标仪测定其吸光值进行定量分析。ELISA 技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，在生物学及相关学科中应用广泛。本次实验以 APP 分泌到细胞外的天然毒素 ApxIIA 为检测抗原，包被酶标板，通过间接ELISA 方法检测抗血清中针对毒素的抗体。
二、实验仪器、材料和试剂
1. 仪器
96 孔聚苯乙烯酶标板，200μL 和 10μL 微量移液器和吸头，10mL 无菌小烧杯，温箱，酶标仪，洗板机。
2. 材料
鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。
3. 试剂
包被液：0.01M 碳酸盐缓冲液（1.59 g NaCO3，2.93 g NaHCO3，加去离子水至 1000 mL），洗涤液：0.01M PBST（pH7.2，含 0.05％ Tween-20 的 PBS），封闭液：含 1％牛血清白蛋白（BSA）的 PBST，酶标二抗：辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG，使用时用PBST以1:5000稀释，显色液：四甲基联苯胺（3,3’,5, 5’-Tetramethylbenzidine,TMB）显色液，终止液：2M H2SO4 或 1％ SDS。
三、方法和步骤
1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取
取鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司）1mL，加氯仿 500μL，漩涡振荡器上充分混合均匀，高速台式离心机 12000rpm 离心 15min，收集上清备用。
2、抗原包被
取上述离心上清 100μL 加入用 900μL 包被液（碳酸盐缓冲液）稀释，在 96 孔酶标板各孔中加入稀释的灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原 100μL，在湿盒中于 37℃温箱孵育2h，或 4℃包被过夜。
3. 封闭
取出 96 孔酶标板，甩干各孔中包被液，将 96 孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干，每孔加入封闭液（含 1%BSA 的 PBST）100μL，37℃孵育 1h。
4. 洗板
取出 96 孔酶标板，甩去封闭液，每孔添加 PBST 200μL，浸泡 1min，甩干后再重复洗涤操作 2 次，将 96 孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干或拍干。
5. 稀释抗血清
取 1.5mL 无菌尖底离心管 9 支排列于离心管架上并做好标记，在第 1 管中加入洗涤液297μL，其余各管各洗涤液 150μL，吸取 3μL 免疫血清加入第 1 管，并充分混匀后吸出150μL加入第 2 管，经充分混匀后吸出 150μL 加入第 3 管中，如此依次 2×稀释至第 9 管，此时 1～9 管血清稀释度为 1:100～1:25600。
图 15稀释抗血清
6. 加抗血清
在 12 孔酶标板条第 1-9 孔依次加入 1:100～1:25600 各稀释度抗血清各 100μL，第10、11 孔每孔加入 100μL 1:100 稀释的未免疫动物血清作为阴性对照，第 12 加 PBST 作为空白对照，将酶标板平放在 37℃培养箱温浴 1hr。
图16 加抗血清
7. 洗板
操作同步骤 4，需重复 4 次。
8. 加酶标二抗
在酶标板各孔加入 1:5000 稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG 100μL，将酶标板平放在 37℃孵育 1hr。
9. 洗板
操作同步骤 5，需重复至少 5 次。
10. 显色
在酶标板各孔加入 TMB 显色液 100μL，将酶标板置室温避光静置 10min。
11. 终止
在酶标板各孔加入 50μL 2M H2SO4，终止反应。
12. 读数
在 405nm 波长下以 12 孔为空白孔调零，测定光密度值。
13. 结果判定
P/N＝检测孔 OD 值/阴性孔 OD 值，P/N>2.1 为阳性，P/N<1.5 为阴性，介于其间为可疑。效价判定：以出现阳性孔的最高稀释度作为待检血清效价。
Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性
一、基本原理
免疫印迹（Western blotting）最早是由 Towbin 等于 1979 年将 Southern blotting 技术扩展到蛋白质领域，并与特异灵敏的免疫分析技术相结合而发展的技术。它的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫结合起来，其主要的操作分为三个过程：1）将抗原物质经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离；2）将分离的组分从 PAGE 凝胶上转移到固相基质上，如硝酸纤维素膜等，此过程称为印记，以利于随后的检测反应的进行；3）对转移后的组分分别进行免疫检测，与抗血清一起孵育，使一级抗体与待检测的抗原决定簇结合，再与经荧光素、酶或核素标记的第二抗体反应，显示出蛋白组分区带，并可对其进行定量。
图 17. 免疫印迹实验流程图
二、实验仪器、材料和试剂
1. 仪器
电泳仪，垂直电泳槽，电转膜仪，水平摇床，无菌培养皿，凝胶成像系统或相机
2. 材料
鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。
3. 试剂
（1）SDS-PAGE 相关试剂：
①5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：75.5g Tris 碱，470g 甘氨酸，250mL 10% SDS，加去
离子水溶解定容至 5000mL；
②：1.5mol/L（pH8.8）：Tris 碱 181.7g 溶于去离子水中，用 HCl 调 pH 值至 8.8，定容至 1000mL；
③1.0mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）：Tris 碱 121.1g 溶于去离子水中，用 HCl 调pH 值至 6.8，定容至 1000mL；
④10%过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于 10mL 去离子水中，4℃保存；
⑤2×SDS 凝胶加样缓冲液：10mL 1.0mol/L Tris-HCl （pH6.8），3.1g 二硫苏糖醇（DTT），4g SDS，0.2g 溴酚蓝，20mL 甘油，定容至 100mL；
⑥30%聚丙烯酰胺母液：将 145g 丙烯酰胺和 5g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于 300mL 去离子水中，加热至 37℃溶解，定容至 500mL，4℃避光保存备用；
⑦考马斯亮蓝染色液：450mL 甲醇，450mL 去离子水，100mL 冰乙酸，2.5g 考马斯亮蓝 R250，溶解后定容至 1000mL；
⑧脱色缓冲液：450mL 甲醇，450mL 去离子水，100mL 冰乙酸，定容至 1000mL；
⑨其它：预染蛋白质 Marker，正丁醇
（2）Western blotting 相关试剂：
①转膜缓冲液：2.9g 甘氨酸，5.8g Tris 碱，0.37g SDS，200mL 甲醇，定容至 1000mL；
②洗涤液：含 0.5％ Tween 20 的 TBS。TBS（pH8.0）：称取 1.21g Tris 碱，8.77g NaCl，充分溶解，调 pH 至 8.0 后，定容至 1000mL；
③封闭液：含 10％脱脂奶的 PBST 溶液；
④一级抗体：鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔制备的抗血清，使用前用PBST 以 1:100 稀释；
⑤二级抗体：IRDye800 标记的羊抗兔 IgG，使用前用 PBST 以 1:15000 稀释；
⑥终止液：灭菌去离子水
三、方法和步骤
1. SDS-PAGE
（1）夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板；
（2）配制 12%的 SDS 丙烯酰胺分离胶 10mL，在烧杯中依次加入：
灭菌去离子水 3.3mL
30%丙烯酰胺溶液 8mL 4mL
1.5mol/L Tris（pH8.8）
2.5mL
10% SDS 0.1mL
10%过硫酸铵 0.1mL
TEMED 0.004mL
摇匀后用移液器加入到两块玻璃板的间隙中；
（3）在分离胶上加入正丁醇 0.3mL，置 37℃约 30min；
（4）待分离胶聚合后，倾出覆盖层的正丁醇液体，用去离子水淋洗凝胶表面 2～3 次，用滤纸片吸净残留液体；
（5）配制 5%浓缩胶 3mL，在烧杯中依次加入：
灭菌去离子水 2.1mL
30%丙烯酰胺溶液 8mL 0.5mL
1.0mol/L Tris（pH6.8） 0.38mL
10% SDS 0.03 L
10%过砀酸铵 0.03mL
TEMED 0.005mL
摇匀后加到分离胶上，立即插入梳子，置 37℃约 10min。
（6）待凝胶完全聚合后拔出梳子，固定于电泳装置。加电泳缓冲液，直至盖住点样孔；
（7）取 10μL NDV 与等体积的 2×SDS 凝胶加样缓冲液混合，加入已经预制好的SDS-PAGE 胶点样孔中；
（8）将电泳装置与电源相接，将电压调到 80V（约 30min），待指示溴酚蓝泳动至分离胶时，将电压调到 120V，待溴酚蓝泳动至分离胶底部时关掉电源（约 90min），取出聚丙烯酰胺凝胶。
2. 转膜
（1）待电泳结束后，戴上手套，取下凝胶，确定样品所在泳道，切除浓缩胶，测量实际电转所用胶块大小（长×宽）；
（2）剪切 6 张滤纸和 1 张硝酸纤维素滤膜，滤纸和硝酸纤维素滤膜的大小需同凝胶的大小完全相等或略小于凝胶；
（3）将硝酸纤维素滤膜浸于去离子水中，使其完全湿润，剪去一个角落作为记号，将6 张滤纸浸泱于电转缓冲液中；
（4）按照如下顺序于安装电转移装置（如图 15 所示）：
塑料夹板（黑色）－海绵垫－3 张滤纸－凝胶－硝酸纤维素滤膜－3 张滤纸－海绵垫－塑料夹板（白色），每加一层，需要精确对齐，并用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡。
摆放好后，将夹板固定于电转槽中，连接电源，根据凝胶面积按 0.65mA/cm2 接通电流，将电转槽放置于冰水混合物中电转移 1h。
图 18. 电转移装置安装示意图
3. 免疫检测
（1）膜的封闭
电转移结束后，取出硝酸纤维素滤膜放入洁净平板中，加入封闭液（含 10% 脱脂奶的PBST）10mL，平放于水平摇床上室温作用 1h。
（2）洗膜
把硝酸纤维素滤膜放入一个新的平板中，加入 20mL 洗涤液 PBST，平放于摇床上室温摇动 5min，并重复洗涤 2 次。
（3）加入一抗
把洗涤后的硝酸纤维素滤膜放入一个新的平板中，加入 10mL 一级抗体反应液（用 PBST 以 1:100 稀释的鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔制备的抗血清），平放于摇床上室温反应 30min。
（4）洗膜
将硝酸纤维素滤膜转移至一个新平板，用 PBST 洗膜 3 次，每次 5min。
（5）与二级抗体作用：
把硝酸纤维素滤膜放入一个新平板，加入 10mL 二抗反应液（用 PBST 以 1:15000 稀释的 IRDye800 标记的羊抗兔 IgG），平放于摇床上室温反应 30min。
（6）洗膜
将硝酸纤维素滤膜转移至一个新平板，用 PBST 洗膜 3 次，每次 5min；再用 PBS 洗膜2 次，每次 5min。
（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像
打开 Odessey 近红外成像仪，将上述硝酸纤维素滤膜平铺于扫描区表面，选定激发光和发射光波长，用 Odessey 近红外成像系统扫描拍照。
图 20. 免疫检测示意图
【实验结果及分析】
表格1小鼠酶联免疫吸附试验结果
由图可知，出现阳性孔的最高稀释浓度为25600，故小鼠血清效价为25600。
表格2 兔子酶联免疫吸附试验结果
由图可知，出现阳性孔
的最高稀释浓度为
25600，故兔子血清效价为25600。
兔疫印迹实验鉴定抗体特异性图（见图中标记处）
教育之通病是教用脑的人不用手，不教用手的人用脑，所以一无所能。教育革命的对策是手脑联盟，结果是手与脑的力量都可以大到不可思议。
由左图可知，最左边的为兔疫印迹条带，右边为鼠疫
印迹，都得到了较好的印迹图，说明抗体特异性较好。
抗菌肽检测方法 1、LB培养基配制 NaCl：1% 胰蛋白胨：1% 酵母浸粉：0.5% 葡萄糖：0.5% 技术琼脂粉：2 % 将上述培养基配比，以水为溶剂，调pH值7.0，121度30分钟，灭菌备用。 2、大肠杆菌菌液制备 2.1 菌液制备：将大肠杆菌（K12D31）从斜面上刮一环转接于装液量50ml的250ml摇瓶中，置于180rpm、37℃的摇床上培养16-24h。 2.2 分光光度计测定其消光值（OD600nm）：将上述大肠杆菌菌悬液用无菌生理盐水稀释，用无菌生理盐水做空白对照，调整菌液吸光值为1.0。于4度冰箱中储存备用（菌液储存时间不得超过4天）。 3、试验菌培养基制备 将无菌LB培养基置室温待其冷却至48-50度时，按100ml无菌LB培养基中加入100μl菌液（OD600nm =1.0），摇匀。吸取含菌LB培养基10ml，使在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。 4、样品制备 4.1 精密称定待测的试样1.0000g，倒入精准9ml水中震荡溶解，放入100度水浴中温浴10分钟，拿出移入离心管中10000rpm离心15分钟，倒出上清液，用针筒吸取上清液，备用。 4.2 将上述3中制备好的检测培养基上用灭菌的打孔器（2.7mm）打孔，每孔中分别加入5ul 的抗菌肽测试样品溶液，取3个平板每板1空重复3板，置于37度培养箱中培养16-20小时后，测定抑菌圈直径，取平均值。 5、抗菌肽效价测定 计算公式：U（单位/克）=2X×1000×稀释倍数；X=（y -2.7）/2.1，其中： Y：抗菌肽抑菌圈直径（mm）取平均值； 2.7：孔穴直径（mm）； 2.1：抗菌肽浓度与抑菌圈直径的比值常数。 使用时间: 2013年9月26日起
摘要............................................................................. .. (4) 【实验过程】 (5) PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5) 一、实验原理 (5) 二、实验仪器、材料和试剂 (7) 1. 仪器 (7) 2. 材料 (7) 3. 试剂 (7) 三、方法和步骤 (7) （一）NDV 兔抗血清制备 (7) 1. 家兔捉拿方法 (7) 2. 家兔固定方法 (8) 3. 初次免疫 (9) 4. 二次免疫 (10) 5. 终末免疫 (10) 6. 试血 (10) 7. 颈动脉放血 (10) 8. 血清分离 (12)
9. 抗血清保存 (12) （二）NDV 鼠抗血清制备 (12) 1. 小白鼠的捉拿和固定 (12) 2. 初次免疫 (13) 3. 二次免疫 (15) 4. 终末免疫 (15) 5. 试血 (16) 6．放血 (18) 7．血清分离 (19) 8．抗血清保存 (19) Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (19) 一、基本原理 (19) 二、实验仪器、材料和试剂 (20) 1. 仪器 (20) 2. 材料 (20) 3. 试剂 (20) 三、方法和步骤 (20) 1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 . 20 2. 1%琼脂糖配制 (20) 3. 倒平板 (21) 4. 打孔 (21) 5. 稀释抗血清 (22)
6. 加样 (22) 7. 孵育 (23) 8. 结果观察 (23) Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (23) 一、基本原理 (23) 二、实验仪器、材料和试剂 (24) 1. 仪器 (24) 2. 材料 (24) 3. 试剂 (24) 三、方法和步骤 (25) 1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 . 25 2、抗原包被 (25) 3. 封闭 (25) 4. 洗板 (25) 5. 稀释抗血清 (25) 6. 加抗血清 (26) 7. 洗板 (26) 8. 加酶标二抗 (26) 9. 洗板 (27) 10. 显色 (27) 11. 终止 (27) 12. 读数 (27)
Q/HBY 抗体检验标准操作规程 杭州博茵生物技术有限公司发布
前 言 本规范由杭州博茵生物技术有限公司提出。 本规范起草单位:杭州博茵生物技术有限公司。 本规范主要起草人：李因来、徐东鑫、陈浙、潘剑用。本规范于2016年7月27日首次发布
编制人陈浙日期2016.07.26部门抗体研发部审核人徐东鑫日期2016.07.27部门质量部 批准人潘剑用日期2016.07.27部门抗体研发部发放编号Q/HBY QF0001‐2016生效日期2016.07.27 抗体检验标准操作规程 1.目的 对单克隆抗体成品的检验操作做出规定，以保证成品质检结果的准确性。 2.范围 适用于下述第6条“合格标准”表格中所列抗体成品的效价测定。 3.职责 操作人员依据本规程进行抗体检验。 4.材料与设备、试剂与溶液 见下述相关文件。 5.检验方法 5.1外观 包装完好，无漏液现象，标签准确。 5.2物理性能 自然光下目测，观察产品溶液是否澄清、是否有沉淀或悬浮物。 5.3浓度 按QC-0004《抗体浓度测定（A280）标准操作规程》测定样品的浓度。 5.4纯度 将样品稀释到1mg/ml，按QC-0003《蛋白SDS-PAGE检测标准操作规程》进行检测并作记录。其中，样品缓冲液含DTT或β-巯基乙醇，样品应加热处理，浓缩胶浓度为3%，分离 胶浓度为12%，染色方法为考染。 5.5效价 按QC-0002《效价检测标准操作规程》进行。
6.合格标准 项目 产品 M010101M010102 外观包装完好，无漏液现 象，标签准确 包装完好，无漏液现 象，标签准确 物理性能无色澄清液体、无沉 淀、无悬浮物 无色澄清液体、无沉 淀、无悬浮物 浓度≥3mg/ml，且偏差± 5% ≥3mg/ml，且偏差± 5% 纯度≥95%≥95% 效价 1.28ng/ml 1.28ng/ml 7.相关文件 QC-0002《抗体效价检测标准操作规程》 QC-0003《蛋白SDS-PAGE检测标准操作规程》 QC-0004《抗体浓度测定（A280）标准操作规程》 8.相关记录 QF-0001-RE-01《抗体检验报告》 QF-0002-RE-01《抗体效价检测记录》 QC-0003-RE-01《蛋白SDS-PAGE检测记录》 QC-0004-RE-01《抗体浓度测定（A280）记录》
血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第 10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。 2．离心后试管内上清液出现溶血，表明不仅有抗原抗体反应，而且有补体激活，具有重要临床意义。 血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。
肝素钠效价检测方法 试剂：羊血浆（冰冻保存）、0.9%生理盐水、0.25%CaCl2（用生理盐水配置）、8%柠檬酸钠溶液、8IU∕mg肝素钠标准溶液。 4.2.2.2 待检样品溶液的配置：精确称取肝素钠固体待检样品M mg，溶解并用0.9%生理盐水定容至100ml，再取V ml定容至25ml即得待检样品溶液，冷藏保存。 估计M及V的计算公式为：样品估计效价×MV∕100=25×8 估算时V只尽量小于10且取整数，从而计算出M值。 4.2.2.3检测方法：将恒温水域调制37℃恒温，取出冰冻羊血浆，融化，并过滤，待 用。取2组10只试管，分别加入标样110ul、120ul……200ul，然后每管加 入8%柠檬酸钠溶液20ul、0.25%CaCl2 0.8ml 及过滤后的羊血浆1ml，另一组 加入待检样品溶液110ul、120ul……200ul，同样每管加入8%柠檬酸钠溶液 20ul 、0.25%CaCl2 0.8ml及过滤后的羊血浆1ml。并将每只试管盖好管盖， 倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。1h后取出各管，检 查各管的凝固程度，并记录确定标样及待检样的1∕2凝固点及体积。 凝固程度标准： ①完全凝固：溶液完全凝固，倒转试管并猛敲一下时，凝块不从管壁脱落。 ②3∕4凝固：溶液完全凝固，但当猛敲一下时，凝块能从管壁脱落。 ③1∕2凝固：大约一半体积的溶液凝固。 ④1∕4凝固：少量溶液凝固。 ⑤0凝固：溶液悟凝固现象。 若相邻两管跳过1∕2凝固点则1∕2凝固点的计算公式为 V=V2-（V2-V1）×（0.5-S1）∕(S2-S1) (S1：小凝固度；S2：大凝固度；V1：相邻两管大凝固度加入的微升数；V2：相邻两管小凝固度加入的微升数。) 待检样品效价计算公式： 4.2.2.4F=待检样品估计效价×标品1∕2凝固点微升数÷样品1∕2凝固点微升数4.2.2.5 注意事项： 4.2.2.6.1 实验室操作环境必须控制在30℃以下。 4.2.2.6.2在使用新开启羊血浆前，需检测羊血浆是否能够正常使用。取试管一只，加入0.8ml 0.25%CaCl2及过滤后的羊血浆1ml ，盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域5min，5min后检查血浆是否凝固，如血浆凝固则可使用，未凝固则不能使用。 4.2.2.6.3 如在检测过程中，标样的1∕2凝固点高于200ul，则需重新调整羊血浆的1∕2凝固点。方法如下：取3组各10只试管 组一： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul 8%柠檬酸钠 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 ul 0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml 羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
新生儿溶血病血清学检查标准操作规程 (一)检验目的 检测孕妇产前与其丈夫ABO及Rh血型相容性、孕妇IgG 抗体效价、产后新生儿体内不相容抗体存在情况、新生儿与产妇之间血型相容性，为新生儿溶血病的预防、诊断及治疗提供可靠的实验室依据。 (二)检验原理 新生儿溶血病是由母婴血型不合，母亲体内与新生儿红细胞抗原不配合的IgG性质的血型抗体进入新生儿体内，破坏新生儿或胎儿红细胞而引起，可发生在胎儿期和新生儿早期，溶血严重者可出现死胎而流产，存活者则有不同程度的新生儿黄疸。新生儿溶血病产前诊断方法主要包括检测胎儿父母的ABO及Rh血型、孕妇不规则抗体筛查、外周血抗A ／抗B或Rh抗体效价来判断新生儿溶血病发生的可能性及严重程度；新生儿溶血病产后诊断主要包括母子ABO及RhD 血型鉴定试验、新生儿标本三项试验，为临床诊断及进一步采取治疗手段提供可靠的依据。 (三)适用范围 适用于新生儿溶血病产前、产后血型血清学试验。 (四)设备性能参数 参见血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、强生Ortho BioVue离心机及各全自动血型／配血系
统使用说明书。 (五)器材与试剂 1.器材血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、强生Or-tho BioVue离心机、塑料软试管、塑料硬质试管(75mmXl2mm)、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、移液枪、一次性移液枪头。 2.试剂DiaMed ABO／RhD血型卡、OrthoBioVueABO ／RhD血型卡、抗A、抗B血清、Rh分，型血清、生理盐水、抗球蛋白试剂(市售单克隆)、抗体筛查试剂红细胞、抗体鉴定试剂红细胞、致敏的阳性对照细胞(自制)。 (六)标本要求 1.夫妇标本EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml(手工操作时也可以使用不抗凝标本)，经B600-A型离心机在 1 760g条件下，离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。 2.患儿标本EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml(手工操作时也可以使用不抗凝标本)，经B600-A型离心机在 1 760g条件下，离心5分钟，离心后无明显乳糜。 (七)校准步骤 参照血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、OrthoBioVue离心机及各全自动血型／配血系统使用说明书中的校准要求执行。 ’ (八)操作程序
孕妇血清IgG抗体效价检测操作规程 [样本要求]：血样标本最好采用EDTA抗凝（也可以用枸橼酸钠等抗凝），用血清代替血浆进行检测时，用前离心，2000g×10min，防止纤维蛋白干扰反应结果。 [样品准备]： 试剂配制：用985ulPH7.4的PBS(或者生理盐水)溶解15ul二巯基乙醇（2-Me）,即为0.2M(2-Me)应用液,密封，避光，置2---6℃保存. 红细胞标本的制备：用生理盐水配置红细胞悬液，红细胞最终浓度为1%左右. 血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃ 放置2小时后离心,2000Rpm,10分钟,取上清.该上清不得有 絮状物或沉淀； [配套试剂]：孕妇IgG抗体 效价卡，标准A、B、O红细 胞（取决于父亲血型）， 0.2M(2-Me)应用液 [实验步骤] 1、试剂卡室温平衡， 离心一次，标记编 号； 2、配制中和血浆：先取待检者血浆200微升与生理盐水600微升做4倍稀释，然后取稀释后的标本和 0.2M巯基乙醇(2-Me)应用液各200ul，混匀，37℃孵育30---60分钟，（充分破坏标本中IgM类抗体） 既得到孕妇的中和血浆。 3 4、在所有孔中加入50ul健康人O型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体)或所有孔 中加入50ul健康人A型或B型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体)，然后加入上述表格中稀释的中和血浆各50ul 5、把加有血浆和红细胞的微柱卡置37 ℃专用孵育器孵育15分钟； 6、用专用离心机离心5分钟（900r/min2分钟1500r/min3分钟）。判定结果。 [结果判定]效价值：产生3+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 [参考值] 1、RH系统抗体效价16有临床意义 2、ABO系统抗体效价64有临床意义 [注意事项] 1.据文献报道微柱凝胶法检测出的母体效价值比常规聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度 （根据P.L.Mollison所著教材《临床医学中的输血（Blood Transfusion in Clinical Medicine）》） 2. 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不 得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。
抗体效价测定操作规程 操作步骤： 一.IgG 类 I.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200］加等体积2—Me溶液混合，封口，置37C水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清 600L 生理盐水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；） 3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1 液3d,混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点, 终点血清稀释度的倒数为效价（Titer ）,或称滴度。 二.IgM 1?血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐
水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L,第一管和第二管中各加入稀释血清200L,第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2. 加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L,混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）三．此类为IgM 类盐水抗体可立即离心后观察。 四． 五．（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）
输血相容性检测作业指导书范本 目录 第一章规章制度 第一节临床输血管理委员会一、临床输血管理委员会组成 二、临床输血管理委员会工作职责三、临床输血管理委员会工作计划第二节临床用血申请与审批管理一、临床用血计划的拟定 二、临床用血申请和审批制度 三、临床退血管理 第三节临床输血操作步骤及岗位职责 一、临床输血操作步骤 二、各岗位职责流程图 第四节输血科管理制度 一、科室工作守则 二、临床用血有控制感染的方案及管理制度三、输血反应及输血感染疾病的登记报告与调查处理制度 四、消毒隔离及污物处理制度 五、工作人员健康体检制度 六、考勤制度 七、请假制度 八、人事考核制度 九、奖惩制度 十、计算机使用管理制度 十一、仪器设备管理制度
十二、值班工作制度 十三、临床用血计划申报登记制度十四、配输血查对制度 1 十五、血型鉴定与交叉配血的复查与核对制度十六、血液储存、发放、临床输血和血液报废制度 十七、血液质量监测制度 十八、仪器设备认购、验收、使用管理、保养、维修及报废制度 十九、试剂的认购与入库、领用制度二十、计量管理制度 二十一、差错事故登记、报告制度二十二、方便病人配合临床制度二十三、科学合理用血制度 二十四、紧急用血制度 二十五、输血治疗知情同意制度二十六、各种登记记录管理和保存制度二十七、库房管理制度 二十八、档案保管制度 二十九、输血不良反应处理和回报制度三十、交接班制度 三十一、血液标本的留取接收保存制度三十二、实验室管理制度 第五节、岗位职责 一、输血科主任岗位职责 二、主任、副主任技师岗位职责三、主管技师职责 四、输血科技师岗位职责 五、输血科技士岗位职责 六、临床医师在用血时的职责 七、临床护士在用血时的职责 第二章仪器、设备使用操作规程
链霉素效价测定方案 试验目的： 1、设计链霉素效价测定方案 2、 熟悉并掌握抗生素效价测定方法 试验器材： 双碟 陶瓦盖 钢管、钢管放置器、玻璃容器 、毛细滴管 、灭菌刻度吸管 、称量瓶 、恒温培养箱 、万分之一天平、干燥箱、恒温水浴箱 、显微镜、抑菌圈测量仪或游标卡尺 、超净工作台 、冰箱、酒精灯、接种环 供试品称量量：50mg 缓冲液： 磷酸盐缓冲液（ph7.8）取磷酸氢二钾5.59g 与磷酸氢二钾0.41g,加水使成1000ml,摇匀滤过。121℃蒸汽灭菌30min 备用。 培养基制备数量 营养琼脂培养基：100ml,作为菌种活化用。 双碟数量：8套（供试品效价测定）+8套（预试验）。共16副 小钢管：32个（供试品效价测定）+32个（预试验），共64个，每个双碟中放置4个。 1个 供试品效价测定 4个 用于预试验 5个每瓶100ml 1个 用于预试验 1个供试品效价测定 2个 每瓶250ml 7个三角瓶
操作步骤 菌种 1）枯燥芽孢杆菌【Bacillus subtilis CMCC(B) 63 501】 2）枯燥芽孢杆菌菌悬液的制备 菌液制备 取枯燥芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，加灭菌水2ml冲下菌苔，制成悬液，用吸管将此悬液接种于营养琼脂培养基上，均匀摊布，在37℃培养7天，取菌苔少许涂片，用革兰染色镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，65℃水浴内加热30min，将菌体杀死，待冷后放冰箱储藏为浓菌液。 供试品溶液的制备 供试品估计效价1000000U/g.精密称取样品50.0mg，加水50ml，稀释制成1000U/ml溶液，吸取2ml加入100ml容量瓶中，加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成20U/ml溶液，吸取7ml加入100ml 容量瓶中，制成1.4U/ml溶液, 吸取25ml加入50ml容量瓶中，制成0.7U/ml溶液,作为滴碟用供试品及标准品溶液。 培养基Ⅰ 胨5g 牛肉浸出粉3g 磷酸氢二钾3g 琼脂20g 水1000ml 除琼脂外，混合上述成分，调节ph值使比最总的ph值略高0.2，加入琼脂，加热溶化后滤过，调ph值使灭菌后为7.8～8.0，在115℃灭菌30min。
实验一抗体的制备及效价检测 实验目的：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。 一．实验原理 机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。 完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。 抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。 二．实验步骤 1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。免疫作好标号。分笼饲养。 2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。 3．佐剂和抗原乳剂的制备 佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。 抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。（3）油剂和水剂1：1混合。混合方式：研磨或者注射器混合。 4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。 第1次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。 A组2只（1-2号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组4只（3-6号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。 第2次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。 第3次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。 5．抗血清的制备 第3次免疫一周后，眼眶取血或心脏取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。
标准血清效价测定 （一）凝集效价的测定 1．取小试管20 支，分两排放置于试管架上，前排标明 A ，后排标明 B ，再将各排由左而右注明号码。 2．各管均加生理盐水0．2 ml 。 3．吸取A 型被测血清0．2 ml ，加入A 排第1 管中，混匀，从第一管 中吸出0．2 ml 加入第2 管中，依次稀释至第10 管，从第10 管吸出 的0．2ml 弃掉，用同样的方法取B 型被测血清在B 排中稀释，最后两 排管的血清稀释倍数分别为1∶2 、1∶4 、1∶8 、1∶16 、1∶32 、1∶ 64 、1∶128 、1∶256 、1∶512 、1∶1024 。 4．A 排管各加B 型2 ％红细胞生理盐水悬液0．2ml；B 排管各加A 型 2 ％红细胞生理盐水悬液0．2ml，混匀。 5．放置室温（18 ～22 ℃）1 ～2 小时观察结果，以稀释倍数最高而 又显凝集者为其凝集效价。上述操作过程见下表。 表 A 型标准血清(抗B)效价测定
表 B 型标准血清(抗A)凝集效价测定 如被测血清在第七管仍显凝集，则其凝集效价为1∶128 。如第八管仍显凝集则其凝集效价为1∶256 。O 型标准血清抗A 、抗B 的凝集效价测定，可参照上述 （二）标准血清的质量要求 A 型（抗B）效价应在1∶64 以上， B 型（抗A）效价应在1∶128 以上，如果低于上述标准，不能使用。并要检查效价低的原因，重新制备，如果效价太高，可按效价规定加适量等渗盐水稀释。且不含其它血型抗体，不形成缗钱状的假凝集，冷凝集素效价＜1∶4 。 （三）亲和力的测定 所谓亲和力是指标准血清与相对应的红细胞混合后出现的凝集速度及凝集块的大小而言。测定方法如下： 取待测血清0．1ml 放于玻片或瓷板上，取对应的10 ％红细胞生理盐水悬液0．05 ml ，加于血清中混匀并涂成直径约1cm 的圆形，立即记时。观察出现凝集的时间。并继续转动玻片或瓷板，至3 分钟时观察凝集块的大小。标准血清亲和力的质量要求，在15 ～30 秒以内应出现凝集，3 分钟时凝集块应在1m- m2 以上，标准血清中不应含脂肪（脂肪可使效价迅速降低），不可污染细菌。
NDV抗血清制备及抗体效价测定 【实验目的】 1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采 血技术。 2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。 3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读 方法。 4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。 PartⅠ. NDV抗血清制备 一、实验原理 将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。 本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器
抗生素的生物效价测定法 测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。 生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。 抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。 稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。 比浊法原理及操作大致与稀释法相同。比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。 扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。扩散法有几种，或中一种叫管碟扩散法（筒称管碟法）为国际上常用的方法，在我国也作为法定的抗生素检定法。 下面我们将详细地讨论管碟法的原理和实验方法。 一、管碟法测定的设计原理及计算方法 管碟法所用的管子系用瓷、铝或玻璃制成，较好的用不锈钢制成，它是内径为6+0.1毫米、外径为8+0.1毫米、高10+0.1毫米的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。 摊布固体培养基的容器可用双碟，亦可用平底下班盘。管子放在混有菌种的固体培养基上时，可用人工放臵，也可用特定的管子放臵器放臵。
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程 【原理】 新生儿溶血病HDN发生的主要原因在于母子血型不合，血型系统最主要的类型为ABO血型系统，本实验采用微柱凝胶检测孕妇血清中的抗A（B）IgG抗体效价。 【试剂】 6%牛血清白蛋白；生理盐水；凝胶卡 【标本采集】 孕妇静脉血3毫升，肝素钠抗凝，孕妇爱人静脉血3毫升，肝素钠抗凝。将孕妇标本制作成血清标本，孕妇爱人标本制成0.5%红细胞标本（用生理盐水洗涤后配制）。 【操作步骤】 1．取孕妇血清标本50微升加入等体积的牛血清白蛋白，37度水浴温育30～60分钟；2．将血清倍比稀释成9管，依次为1：4、8、16、32、64、128、512、1024、2048管；3．将卡作好标记，在所有孔中加入经处理好的孕妇血清标本50ul； 4．然后在所有孔中加入50ul的孕妇爱人0.5%红细胞标本； 5．37度孵育15分钟（专用孵育箱）； 6．专用离心机离心5分钟；900rpm2分钟，1500rpm3分钟； 7．取出判定结果； 【结果判定】 阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中； 阴性结果：红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。 【结果报告】 产生1+阳性凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 【注意事项】 1．红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应，尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本试验。 2．血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。 3．如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所臻溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。 4．本凝胶卡价格不菲，成本较高，请您节约使用。 【临床意义】 有人观察1632例孕妇血清中IgG抗A（B）≥1：64者249例；ABO-HDN发生率随IgG抗A（B）效价升高而上升；HDN与妊娠史的频率有关，随着年龄上升，孕妇个体IgG抗A（B）抗体效价也随之上升。夫妇间ABO血型不合者应及时检查产前血型抗体水平，用于预防不良妊娠的发生；IgG抗A（B）效价的高低与HDN的发病率成正比；孕妇血清IgG抗A（B）效价≥1：64需定期检测抗体效价水平及时用药降低抗体效价，以预防新生儿溶血病的发生。
沈阳药科大学 硕士学位论文 诺西肤发酵工艺的研究 姓名:韩果红 专业:微生物与生化药学 导师:何建勇教授 二00四年五月 P24 诺西肚的定性与定量测定 2.2，2.1生物效价测定法 1.检定菌菌悬液的制备 加40一5Oml无菌水到培养好的枯草芽抱杆菌茄形瓶斜面上[枯草芽抱杆菌斜面培养基(%):蛋白陈1.0·NaCI0.5,牛肉膏0.5,琼脂粉1.5.,pH7.8(灭菌前)蒸馏水配制].用接种环刮下芽抱和菌体，摇匀，65℃水浴保温3Om加，杀死营养细胞，保留芽抱，即为检定菌菌悬液。 2.生测平板的制备 将生物检定培养基[生物检定培养基(%):牛肉膏0.3蛋白陈0.5,K2HPO4 0.3,琼脂粉1.5， pH8.0-8.2(灭菌前)蒸馏水配制] 2OOml灭菌后自然冷却到50一60℃后，倒入20x3Ocm的生物检定盘中，自然凝固，作为生测平板的下层。 将生物检定培养基100ml灭菌后自然冷却到50一60℃，向培养基中加入一定量的检定菌(枯草芽抱杆菌)菌悬液，混匀，然后倒入检定盘内己凝固的下层培养基上，自然凝固。 3.点样 用无菌小镊子取中Sunll的无菌圆滤纸片，按一定规律摆放在上层培养基的表面。每个待测样品应点样2一3个滤纸片，以其抑菌圈的平均值进行计算。盘内同时摆放加有不同剂量诺西肤标准溶液(IO00u/m)l的圆滤纸片，每个剂量点2一3个滤纸片，以其抑菌圈的平均值进行计算。每个纸片上的加样量不超过5ul。 4.培养 将点好样的检定盘倒置于4℃冰箱中扩散10小时左右，然后于37℃恒温箱中培养16一18小时，不同点样量的诺西肤在检定盘中产生的抑菌圈大小不同，根据标准品的剂量及相应抑菌圈直径之间的对应关系得标准曲线方程，根据样品的抑菌圈直径通过标准曲线方程计算出对应的效价。 P35 高产菌株选育方法的建立 由于出发菌株的产量极低，为了加快高产菌株的筛选进度，为以后的菌种选育打下基础，需要建立一种简便、快捷的菌种选育方法。为此，用琼脂块初筛的方法进行试验。将经过自然分离(或诱变)后在分离平板上生长好的单菌落先目测筛选，挑选菌落丰满抱子量大的菌株用牙签点种至准备好的琼脂块上，28℃保湿培养5一6天，待菌落长好后用扩散法测定各个琼脂块的抑菌活性，根据抑菌圈的大小初步确定菌株的生产能力，挑选抑菌圈大的菌株，再通过摇瓶液体复筛初步确定高产菌株。因为诺西肤属于脂溶性抗生素，在检定培养基中的扩散速度较慢，加上出发菌株的产量较低，所以37℃培养16一18小时后看不到抑菌圈。 为了解决这一问题，将待测活性的固体琼脂块在生测培养基上先扩散一段时间(4℃，12一16小时，该条件下对链霉菌本身无影响)，此时检定菌不能生长，诺西肤在此期间逐渐扩散到检定培养基中。之后再将检定盘置于37℃培养16一18小时，则可以看到清晰的抑菌圈，从而建立了一种快速的高产菌株筛选方法(如图3一3所示)，并利用此方法挑选出了出发菌株YM4一2(发酵单位为61ou/ml)。
实验一免疫抗体的制备及效价检测 一．教学目标：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向 免疫扩散法测定抗体的效价。 二．重点难点：给小鼠注射抗原的实验操作，小鼠心脏取血的实验操作。载玻片琼脂 凝胶板打孔实验操作。 三．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 四．教学内容: 实验原理 机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。 完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。 抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。 实验步骤 1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。免疫作好标号。分笼饲养。 2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。 3．佐剂和抗原乳剂的制备 佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。 抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。（3）油剂和水剂1：1混合。 混合方式：研磨或者注射器混合。 4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。 第一次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。 A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。 C组6只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。 第二次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。 C组3只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml纤维素酶液。 第三次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/c615237656.html, 禽流感免疫抗体效价检测 作者：何生 来源：《湖北畜牧兽医》2013年第07期 摘要：为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解乌鲁木齐市米东区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区不同鸡场进行了禽流感抗体检测。结果表明，40只免疫鸡，免疫抗体 效价合格数33只，总合格率为82.5%。说明近几年对高致病性禽流感采取的强制免疫措施达到了比较显著的效果。 关键词：禽流感；免疫；抗体效价；血凝试验；血凝抑制试验 中图分类号：S855 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）07-0029-02 禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病。禽流感病毒感染后，呈现出较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。禽流感病毒不仅能引起禽类严重的疾病，而且对人类和哺乳类动物也能造成感染。在世界各种家禽和野生禽类中，按照血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面抗原来区分，已发现了数千种属于许多不同抗原亚型的病毒。各种品种和不同日龄的禽类均可感染高致病性禽流感。该研究为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解本地区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区鸡场进行了禽流感抗体检测，并对不其检测结果进行了对比分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物 40只鸡由米东区铁厂沟镇大草滩村养禽场提供。 1.1.2 试剂禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原，禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验阳性血清，1%鸡红细胞悬液。 1.1.3 仪器 96孔V型微量反应板、台式离心机，单道、多道微量可调移液器，吸嘴，微量振荡器，加样槽。 1.2 方法 1.2.1 血凝（HA）试验在微量反应板的1～12孔均加入0.025 mL的PBS，换滴头，吸取0.025 mL病毒悬液加入第1孔混匀，从第1孔吸取0.025 mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025 mL加入第3孔，依次倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025 mL弃之，换滴头，每孔再加入0.025 mL PBS。每孔均加入0.025 mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液，充分混匀后加入。在微量振荡器上振荡2 min，在25 ℃恒温箱内静置40 min后观察结果。