实验一抗体的制备及效价检测
实验目的：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。
一．实验原理
机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。
抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。
二．实验步骤
1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。免疫作好标号。分笼饲养。
2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。
3．佐剂和抗原乳剂的制备
佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。
抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。（3）油剂和水剂1：1混合。混合方式：研磨或者注射器混合。
4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。
第1次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。
A组2只（1-2号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组4只（3-6号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。
第2次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。
A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。
第3次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。
A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。
5．抗血清的制备
第3次免疫一周后，眼眶取血或心脏取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。
6．抗体的效价检测：双向免疫扩散法。
琼脂凝胶板的制备：胶布包围一片载玻片使之形成不透水的槽，或在培养皿中。用生理盐水加热溶解琼脂配成1%溶液，均匀浇注于玻片内。注意勿产生气泡，琼脂厚度约2.5mm 。
打孔：待琼脂凝固后，用去尖头的吸头（直径约为3-4mm ）在凝胶上打孔，孔间距为3-5mm 。在小孔中加少量加热的液体琼脂，防止渗漏。打孔样式为梅花样，如图
加样：加样于孔内，左中间孔为抗原；右中间孔为无关抗原（牛血清白蛋白）；边孔为不同浓度的抗体（系列用生理盐水稀释的抗体1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32）。注意不要外溢（加满为止）。
结果观察：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，在室温或37 扩散18-24小时后，观察结果。 三．实验结果
四．结果讨论
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
摘要............................................................................. .. (4) 【实验过程】 (5) PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5) 一、实验原理 (5) 二、实验仪器、材料和试剂 (7) 1. 仪器 (7) 2. 材料 (7) 3. 试剂 (7) 三、方法和步骤 (7) （一）NDV 兔抗血清制备 (7) 1. 家兔捉拿方法 (7) 2. 家兔固定方法 (8) 3. 初次免疫 (9) 4. 二次免疫 (10) 5. 终末免疫 (10) 6. 试血 (10) 7. 颈动脉放血 (10) 8. 血清分离 (12)
9. 抗血清保存 (12) （二）NDV 鼠抗血清制备 (12) 1. 小白鼠的捉拿和固定 (12) 2. 初次免疫 (13) 3. 二次免疫 (15) 4. 终末免疫 (15) 5. 试血 (16) 6．放血 (18) 7．血清分离 (19) 8．抗血清保存 (19) Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (19) 一、基本原理 (19) 二、实验仪器、材料和试剂 (20) 1. 仪器 (20) 2. 材料 (20) 3. 试剂 (20) 三、方法和步骤 (20) 1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 . 20 2. 1%琼脂糖配制 (20) 3. 倒平板 (21) 4. 打孔 (21) 5. 稀释抗血清 (22)
6. 加样 (22) 7. 孵育 (23) 8. 结果观察 (23) Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (23) 一、基本原理 (23) 二、实验仪器、材料和试剂 (24) 1. 仪器 (24) 2. 材料 (24) 3. 试剂 (24) 三、方法和步骤 (25) 1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 . 25 2、抗原包被 (25) 3. 封闭 (25) 4. 洗板 (25) 5. 稀释抗血清 (25) 6. 加抗血清 (26) 7. 洗板 (26) 8. 加酶标二抗 (26) 9. 洗板 (27) 10. 显色 (27) 11. 终止 (27) 12. 读数 (27)
血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第 10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。 2．离心后试管内上清液出现溶血，表明不仅有抗原抗体反应，而且有补体激活，具有重要临床意义。 血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
孕妇血清IgG抗体效价检测操作规程 [样本要求]：血样标本最好采用EDTA抗凝（也可以用枸橼酸钠等抗凝），用血清代替血浆进行检测时，用前离心，2000g×10min，防止纤维蛋白干扰反应结果。 [样品准备]： 试剂配制：用985ulPH7.4的PBS(或者生理盐水)溶解15ul二巯基乙醇（2-Me）,即为0.2M(2-Me)应用液,密封，避光，置2---6℃保存. 红细胞标本的制备：用生理盐水配置红细胞悬液，红细胞最终浓度为1%左右. 血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃ 放置2小时后离心,2000Rpm,10分钟,取上清.该上清不得有 絮状物或沉淀； [配套试剂]：孕妇IgG抗体 效价卡，标准A、B、O红细 胞（取决于父亲血型）， 0.2M(2-Me)应用液 [实验步骤] 1、试剂卡室温平衡， 离心一次，标记编 号； 2、配制中和血浆：先取待检者血浆200微升与生理盐水600微升做4倍稀释，然后取稀释后的标本和 0.2M巯基乙醇(2-Me)应用液各200ul，混匀，37℃孵育30---60分钟，（充分破坏标本中IgM类抗体） 既得到孕妇的中和血浆。 3 4、在所有孔中加入50ul健康人O型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体)或所有孔 中加入50ul健康人A型或B型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体)，然后加入上述表格中稀释的中和血浆各50ul 5、把加有血浆和红细胞的微柱卡置37 ℃专用孵育器孵育15分钟； 6、用专用离心机离心5分钟（900r/min2分钟1500r/min3分钟）。判定结果。 [结果判定]效价值：产生3+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 [参考值] 1、RH系统抗体效价16有临床意义 2、ABO系统抗体效价64有临床意义 [注意事项] 1.据文献报道微柱凝胶法检测出的母体效价值比常规聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度 （根据P.L.Mollison所著教材《临床医学中的输血（Blood Transfusion in Clinical Medicine）》） 2. 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不 得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
抗体效价测定操作规程 操作步骤： 一.IgG 类 I.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200］加等体积2—Me溶液混合，封口，置37C水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清 600L 生理盐水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；） 3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1 液3d,混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点, 终点血清稀释度的倒数为效价（Titer ）,或称滴度。 二.IgM 1?血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐
水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L,第一管和第二管中各加入稀释血清200L,第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2. 加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L,混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）三．此类为IgM 类盐水抗体可立即离心后观察。 四． 五．（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）
标准血清效价测定 （一）凝集效价的测定 1．取小试管20 支，分两排放置于试管架上，前排标明 A ，后排标明 B ，再将各排由左而右注明号码。 2．各管均加生理盐水0．2 ml 。 3．吸取A 型被测血清0．2 ml ，加入A 排第1 管中，混匀，从第一管 中吸出0．2 ml 加入第2 管中，依次稀释至第10 管，从第10 管吸出 的0．2ml 弃掉，用同样的方法取B 型被测血清在B 排中稀释，最后两 排管的血清稀释倍数分别为1∶2 、1∶4 、1∶8 、1∶16 、1∶32 、1∶ 64 、1∶128 、1∶256 、1∶512 、1∶1024 。 4．A 排管各加B 型2 ％红细胞生理盐水悬液0．2ml；B 排管各加A 型 2 ％红细胞生理盐水悬液0．2ml，混匀。 5．放置室温（18 ～22 ℃）1 ～2 小时观察结果，以稀释倍数最高而 又显凝集者为其凝集效价。上述操作过程见下表。 表 A 型标准血清(抗B)效价测定
表 B 型标准血清(抗A)凝集效价测定 如被测血清在第七管仍显凝集，则其凝集效价为1∶128 。如第八管仍显凝集则其凝集效价为1∶256 。O 型标准血清抗A 、抗B 的凝集效价测定，可参照上述 （二）标准血清的质量要求 A 型（抗B）效价应在1∶64 以上， B 型（抗A）效价应在1∶128 以上，如果低于上述标准，不能使用。并要检查效价低的原因，重新制备，如果效价太高，可按效价规定加适量等渗盐水稀释。且不含其它血型抗体，不形成缗钱状的假凝集，冷凝集素效价＜1∶4 。 （三）亲和力的测定 所谓亲和力是指标准血清与相对应的红细胞混合后出现的凝集速度及凝集块的大小而言。测定方法如下： 取待测血清0．1ml 放于玻片或瓷板上，取对应的10 ％红细胞生理盐水悬液0．05 ml ，加于血清中混匀并涂成直径约1cm 的圆形，立即记时。观察出现凝集的时间。并继续转动玻片或瓷板，至3 分钟时观察凝集块的大小。标准血清亲和力的质量要求，在15 ～30 秒以内应出现凝集，3 分钟时凝集块应在1m- m2 以上，标准血清中不应含脂肪（脂肪可使效价迅速降低），不可污染细菌。
实验一抗体的制备及效价检测 实验目的：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。 一．实验原理 机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。 完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。 抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。 二．实验步骤 1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。免疫作好标号。分笼饲养。 2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。 3．佐剂和抗原乳剂的制备 佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。 抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。（3）油剂和水剂1：1混合。混合方式：研磨或者注射器混合。 4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。 第1次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。 A组2只（1-2号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组4只（3-6号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。 第2次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。 第3次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。 5．抗血清的制备 第3次免疫一周后，眼眶取血或心脏取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。
血型检查化验单怎么看 在了解血型检查化验单之前，让我们先了解下抗原与抗体的关系。 抗原是指病原体等异物侵入人体之后，引起人体产生抗体的物质（即病原体等异物）。 抗体指的是病原体侵入人体之后，刺激了淋巴细胞，淋巴细胞产生一种抵抗该病原体的特殊蛋白质，是一种可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。 圆规正传，接着就来了解下血型检查化验单到底应该怎么看吧！ 血型检查化验单上会出现孕妇及其配偶的血型，如，孕妇血型为O型，丈夫血型为A型，化验单上显示IgG抗A效价是1：4，大于1：64的参考值，也就是说ABO溶血检查结果正常，不会发生溶血现象；分母如果大于64，则表示有溶血的可能。 如报告单上显示，Rh（D）+也就是说孕妈妈的血型中含有Rh因子为阳性，绝大部分人的都是这样的数据；如果显示为RH（D）-，那么就有可能发生Rh溶血病，需做密切的观察和检查。 溶血化验单怎么看 关于溶血化验单主要分为两部分： 1、Rh血型不合 首先要知道Rh阴性血型在不同人群和种族中存在差异，在我国汉族中仅为0.34%，少数民族中则在5%以上。Rh血型共有六种抗原，即C和c，D和d，E和e，D抗原是最早发现的，所以临床上凡是D抗原阳性者称为Rh阳性，无D抗原者称为Rh阴性。Rh血型的抗原中以D抗原的抗原性最强，而Rh血型抗原的抗原性决定了溶血的严重程度。 Rh-血型的准妈妈，所怀第一胎为Rh+血型，那么胎儿则含有D抗原，准妈妈体内无D 抗原，因而准妈妈体内对抗D抗原的抗体还不够多，因此在第一胎时发生溶血病的可能性比较小。而在第二胎时，准妈妈因为在第一胎分娩时接触到了胎儿的D抗原，所以体内也产生了更多的D抗体，如果在第二胎所怀胎儿为Rh+血型的话，那么D抗体会增加，会与胎儿体内的抗原发生反应，抗体会透过胎盘把第二个婴儿的血液溶解，这样就会导致第二胎发生溶血病。
NDV抗血清制备及抗体效价测定 【实验目的】 1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采 血技术。 2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。 3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读 方法。 4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。 PartⅠ. NDV抗血清制备 一、实验原理 将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。 本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器
ABO 血型鉴定总结 -临床医学检验考试 1.AB0血型鉴定原理 常用盐水凝集法检测红细胞上存在的血型抗原,以及血清中存在的血型抗体,依据抗原抗体存在的情况判定血型。常规的方法有:①正向定型:用已知抗体的标准血清检查红细胞上未知的抗原。②反向定型:用已知血型的标准红细胞检查血清中未知的抗体。结果判定:凡红细胞出现凝集者为阳性,呈散在游离状态为阴性。 2. 鉴定方法 (1生理盐水凝集法:①玻片法:操作简单,适于大量标本检查,但反应时间长;被检查者如血清抗体效价低, 则不易引起红细胞凝集,因此,不适于反向定型。②试管法:由于离心作用可加速凝集反应,故反应时间短,而且,借助于离心力可以使红细胞接触紧密, 促进凝集作用,适于急诊检查。 红细胞亚型抗原性弱, 如抗 A 抗 B 标准血清效价低时, 易造成漏检或误定。如加用 O 型(抗 A 、 B 血清和反向定型,可避免此类错误医学 `教育网搜集整理。 玻片法凝集结果判断:红细胞呈均匀分布,无凝集颗粒,镜下红细胞分散。在低倍镜下凝集程度强弱判断标准:①呈一片或几片凝块, 仅有少数单个游离红细胞为(++++。②呈数个大颗粒状凝块,有少数单个游离红细胞为(+++。③数个小凝集颗粒和一部分微细凝 集颗粒,游离红细胞约占 1/2为(++。④肉眼可见无数细沙状小凝集颗粒。于镜下观察, 每凝集团中有 5~8个以上红细胞凝集为 (+ 。⑤可见数个红细胞凝集在一起,周围有很多的游离红细胞(±。⑥可见极少数红细胞凝集, 而大多数红细胞仍呈分散分布为混合凝集外观。⑦镜下未见细胞凝集,红细胞均匀分布为(-。 (2凝胶微柱法:是红细胞抗原与相应抗体在凝胶微柱介质中发生凝集反应的免疫学方法。血型抗体为单克隆抗体,加入试剂、标本, 用专用离心机离心后可直接用肉眼观察结果或用血型仪分析。此法操作标准化,定量加样,确保结果准确性。 3. 抗 A 、抗 B 和抗 AB 标准血清标准
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程 【原理】 新生儿溶血病HDN发生的主要原因在于母子血型不合，血型系统最主要的类型为ABO血型系统，本实验采用微柱凝胶检测孕妇血清中的抗A（B）IgG抗体效价。 【试剂】 6%牛血清白蛋白；生理盐水；凝胶卡 【标本采集】 孕妇静脉血3毫升，肝素钠抗凝，孕妇爱人静脉血3毫升，肝素钠抗凝。将孕妇标本制作成血清标本，孕妇爱人标本制成0.5%红细胞标本（用生理盐水洗涤后配制）。 【操作步骤】 1．取孕妇血清标本50微升加入等体积的牛血清白蛋白，37度水浴温育30～60分钟；2．将血清倍比稀释成9管，依次为1：4、8、16、32、64、128、512、1024、2048管；3．将卡作好标记，在所有孔中加入经处理好的孕妇血清标本50ul； 4．然后在所有孔中加入50ul的孕妇爱人0.5%红细胞标本； 5．37度孵育15分钟（专用孵育箱）； 6．专用离心机离心5分钟；900rpm2分钟，1500rpm3分钟； 7．取出判定结果； 【结果判定】 阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中； 阴性结果：红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。 【结果报告】 产生1+阳性凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 【注意事项】 1．红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应，尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本试验。 2．血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。 3．如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所臻溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。 4．本凝胶卡价格不菲，成本较高，请您节约使用。 【临床意义】 有人观察1632例孕妇血清中IgG抗A（B）≥1：64者249例；ABO-HDN发生率随IgG抗A（B）效价升高而上升；HDN与妊娠史的频率有关，随着年龄上升，孕妇个体IgG抗A（B）抗体效价也随之上升。夫妇间ABO血型不合者应及时检查产前血型抗体水平，用于预防不良妊娠的发生；IgG抗A（B）效价的高低与HDN的发病率成正比；孕妇血清IgG抗A（B）效价≥1：64需定期检测抗体效价水平及时用药降低抗体效价，以预防新生儿溶血病的发生。
实验一免疫抗体的制备及效价检测 一．教学目标：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向 免疫扩散法测定抗体的效价。 二．重点难点：给小鼠注射抗原的实验操作，小鼠心脏取血的实验操作。载玻片琼脂 凝胶板打孔实验操作。 三．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 四．教学内容: 实验原理 机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。 完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。 抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。 实验步骤 1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。免疫作好标号。分笼饲养。 2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。 3．佐剂和抗原乳剂的制备 佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。 抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。（3）油剂和水剂1：1混合。 混合方式：研磨或者注射器混合。 4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。 第一次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。 A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。 C组6只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。 第二次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。 B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。 C组3只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml纤维素酶液。 第三次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。 A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/229623034.html, 禽流感免疫抗体效价检测 作者：何生 来源：《湖北畜牧兽医》2013年第07期 摘要：为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解乌鲁木齐市米东区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区不同鸡场进行了禽流感抗体检测。结果表明，40只免疫鸡，免疫抗体 效价合格数33只，总合格率为82.5%。说明近几年对高致病性禽流感采取的强制免疫措施达到了比较显著的效果。 关键词：禽流感；免疫；抗体效价；血凝试验；血凝抑制试验 中图分类号：S855 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）07-0029-02 禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病。禽流感病毒感染后，呈现出较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。禽流感病毒不仅能引起禽类严重的疾病，而且对人类和哺乳类动物也能造成感染。在世界各种家禽和野生禽类中，按照血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面抗原来区分，已发现了数千种属于许多不同抗原亚型的病毒。各种品种和不同日龄的禽类均可感染高致病性禽流感。该研究为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解本地区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区鸡场进行了禽流感抗体检测，并对不其检测结果进行了对比分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物 40只鸡由米东区铁厂沟镇大草滩村养禽场提供。 1.1.2 试剂禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原，禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验阳性血清，1%鸡红细胞悬液。 1.1.3 仪器 96孔V型微量反应板、台式离心机，单道、多道微量可调移液器，吸嘴，微量振荡器，加样槽。 1.2 方法 1.2.1 血凝（HA）试验在微量反应板的1～12孔均加入0.025 mL的PBS，换滴头，吸取0.025 mL病毒悬液加入第1孔混匀，从第1孔吸取0.025 mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025 mL加入第3孔，依次倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025 mL弃之，换滴头，每孔再加入0.025 mL PBS。每孔均加入0.025 mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液，充分混匀后加入。在微量振荡器上振荡2 min，在25 ℃恒温箱内静置40 min后观察结果。
单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1．国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体
说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody ，北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围
的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3?5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟， 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X 105/ml，备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基: