专题二克隆技术
最新考纲
1．植物组织培养Ⅱ
2．动物细胞培养和体细胞克隆Ⅰ
3．动物细胞融合和单克隆抗体Ⅱ
考纲解读
1．植物组织培养、植物体细胞杂交的过程及应用
2．动物细胞培养、单克隆抗体的制备及应用
3．动物细胞的培养与有毒物质的检测
知识点一植物组织培养技术
看一看：在诱导愈伤组织分化时哪些物质起作用？
想一想：什么是人工种子？它有什么优点？
议一议：如何通过细胞培养检测有毒物质毒性的大小？
知识点二 动物克隆技术
?????单克隆抗体?????制备：
优点：特异性强，灵敏度高，产量大
应用?
???
?作为诊断试剂用于治疗疾病和运载药物：制成○33
“ ”
议一议：鼠的单克隆抗体能否用于人体疾病的治疗？
在单克隆抗体的制备过程中，两次筛选的目的不同
(1)由于B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合方式有多种，因此第一次筛选的目的是选出杂交瘤细胞，淘汰掉未融合的或同种细胞融合的细胞。
(2)由于从小鼠体内提取的B淋巴细胞可能有多种，因此第一次筛选到的杂交瘤细胞可能有多种，通过克隆化培养和抗体检测进行第二次筛选，以选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
自我校对：
①无菌和人工控制②离体③愈伤组织④植物细胞的全能性⑤离体⑥愈伤组织⑦再分化⑧杂种细胞⑨杂种细胞○10纤维素酶和果胶酶?纤维素酶和果胶酶?原生质体?脱分化?愈伤组织?人工种子?花药?纯合二倍体?极大地缩短了育种年限，节约了人力物力?无菌、无毒?营养○21温度、pH○22气体环境○23两个○24DNA○25杂交○26远缘○27B细胞—B细胞○28杂交瘤细胞
○29骨髓瘤—骨髓瘤细胞○30杂交瘤细胞○31产生专一抗体○32单克隆抗体○33生物导弹
看一看：植物激素在愈伤组织的分化中起重要作用，生长素用于诱导细胞的分裂和根的分化。细胞分裂素是促进细胞的分裂和不定芽的分化。
想一想：①人工种子是以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，包装上人工薄膜制成。
②它的优点是可以保持优良品种的遗传特性，生产上也不受季节的限制。
议一议：用含有一定浓度有毒物质的细胞培养液和正常细胞培养液同时培养正常细胞，通过对照观察变异细胞的百分数来确定其毒性强弱。
议一议：不能。因为小鼠的B淋巴细胞所产生的抗体与人体B淋巴细胞产生的抗体是不同的。
,植物组织培养与动物细胞培养的比较
高考地位：5年9考 （2011江苏卷、安徽卷，2010浙江卷……）
裂素可促进愈伤组织生芽。
②在动物细胞的传代培养中，细胞可能癌变。
③两种技术手段培养过程中都进行了有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂。
④植物组织培养最终产生新个体，体现了细胞的全能性；动物细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，故不能体现细胞的全能性。
本考点多与基因工程综合在一起考查，以非选择题的形式进行命题，近年高考单科试卷也多有涉及，也多与必修内容综合在一起考查。 【典例1】?(2011·江苏)下列有关植物组织培养的叙述，正确的是( )。 A ．愈伤组织是一团有特定结构和功能的薄壁细胞
B ．二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株
C．用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子
D．植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl的培养基培养筛选而获得
解析本题考查植物细胞工程，同时考查综合分析与迁移能力。愈伤组织细胞是一团排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的、具分生能力的薄壁细胞，不具有特定的结构和功能。二倍体植株的花粉中只含一个染色体组，培养得到的个体为单倍体，高度不育，幼苗用秋水仙素处理后得到的植株才能稳定遗传。人工种子中包裹的不能是愈伤组织。用特定的选择培养基可筛选出所需要的突变体类型。
答案 D
【训练1】?动物细胞培养与植物组织培养的重要区别在于()。
A．培养基不同
B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能
D．动物细胞能够大量培养，而植物细胞不能
解析动物细胞培养所用的培养基是液体培养基，其中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。而植物组织培养所用的培养基是固体培养基，通常含有水、矿质元素、激素、蔗糖、氨基酸、琼脂等。可见，动物细胞培养所用的培养基与植物组织培养的培养基是不相同的。
答案 A
,植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较
高考地位：5年6考（2011福建卷、浙江卷……）
提醒 (1)在细胞融合时，可出现多种杂种细胞，如B 细胞—B 细胞，骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞，B 细胞—骨髓瘤细胞。
(2)动物细胞融合和植物体细胞杂交，均需对杂种细胞进行筛选，但筛选的方法不同，前者可用免疫法，后者可用机械方法、生理学或遗传学方法。
(3)各项技术在使用中一般要借助于其他某种技术的协助，如动物细胞融合、单克隆抗体的制备、胚胎移植、核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程技术的基础。
本考点内容是高考命题的热点内容，特别是单克隆抗体的制备是高考命题的热点，复习中应引起重视。
【典例2】?(2010·福建卷)[生物—现代生物科技专题]
红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO 来源极为有限，目前临床上使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)，其简要生产流程如右图。
请回答下列问题。
(1)图中①所指的是________技术。
(2)图中②所指的物质是________，③所指的物质是________。
(3)培养重组CHO 细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换________。
(4)检测rhEPO 的体外活性需用抗rhEPO 的单克隆抗体。分泌该单克隆抗体的________细胞，可由rhEPO 免疫过的小鼠B 淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。
解析 (1)核DNA 的体外扩增是利用PCR 技术。(2)由图示分析：从人胚胎干细胞提取出②，经反转录可形成cDNA ，可知②为翻译EPO 的模板mRNA ，③为rhEPO 。(3)细胞培养过程
中，应定期更换培养液，以添加营养物质，清除代谢废物。(4)由rhEPO 免疫过的小鼠B 淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，可以筛选出能够分泌抗rhEPO 的单克隆抗体的杂交瘤细胞。 答案 (1)PCR (2)mRNA rhEPO (3)培养液 (4)杂交瘤 【训练2】?(2011·金华模拟)下列有关植物体细胞杂交的叙述，不正确的是( )。 A ．用酶解法去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体 B ．诱导两种植物的原生质体融合，进而形成杂种细胞 C ．植物体细胞杂交的最终目的是获得细胞代谢产物
D ．植物体细胞杂交技术可以克服不同种间远缘杂交不亲和的障碍 解析 去除植物细胞壁可以用纤维素酶和果胶酶；原生质体融合后再产生出细胞壁标志着杂种细胞的形成；植物体细胞杂交的目的是为了获得杂种植株；植物体细胞杂交不经过有性生殖过程，所以可以克服远缘杂交不亲和的障碍。 答案 C
【训练3】?(2011·潍坊模拟)下列关于单克隆抗体制备过程的叙述，正确的是( )。 A ．制备过程中不需要动物细胞培养技术
B ．杂交瘤细胞具有浆细胞与癌细胞的所有特点
C ．经选择性培养基筛选出来的杂交瘤细胞即可用于单克隆抗体的生产
D ．单克隆抗体最广泛的用途是用作体外诊断试剂
解析 单克隆抗体的制备是将骨髓瘤细胞与浆细胞结合，经过选择培养基的筛选得到杂交瘤细胞并经专一抗体检测后，培养能产生特定抗体的杂交瘤细胞即可得单克隆抗体，杂交瘤细胞能无限繁殖但不具有癌细胞的转移能力。 答案 D
,动物体细胞核移植与克隆动物
高考地位：5年4考 （2011广东卷、浙江卷……）
1．原理
动物细胞核的全能性。动物细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。 2．供核细胞
一般选优良动物的传代培养10代以内的细胞。 3．受体细胞
去核的M Ⅱ期卵母细胞。 4．过程
胚胎――→胚胎
移植
代孕个体→生出与供体遗传物质相同的个体
本考点内容在高考中单独考查较少，但在高考命题中多以此内容为背景进行命题考查其它方面知识。
【典例3】?日本研究人员依靠体细胞克隆技术进行反复“拷贝”，成功培育出第四代克隆猪。这个研究小组培育的第一代克隆猪于2004年4月诞生，此后，他们又从长大的克隆猪唾液腺中提取细胞，将细胞核植入未受精的卵子中，依次培育出第二代和第三代克隆猪。研究人员发现，猪与人类身体构造相似，克隆猪可作为研究人类疾病的实验动物。根据材料回答下列问题。
(1)第四代克隆猪利用了动物细胞核的________性。
(2)在细胞核植入受体卵母细胞之前，要用显微针去除卵母细胞的________，再将唾液腺细胞核注入。获得的重组胚胎需要体外培养，培养时不仅要有无机盐类和有机盐类，而且还要有________________等营养成分及________等物质。当发育到囊胚期时，将其移植到受体雌性动物体内。
(3)研究显示，利用克隆技术根本无法培育出完全相同的个体，究其原因，除了发育过程中的环境因素的影响外，还可能有________________等原因。
(4)如果希望克隆猪都能生产人体胰岛素，那么需要利用________技术，把________________拼接到猪的核基因中。转基因是否成功都可以用________检测。
解析体细胞核移植技术利用了动物细胞核的全能箼；在供体细胞的细胞核移入受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。哺乳动物胚胎的培养液成分一般都比较复杂，除一些无机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分以及血清等物质。克隆技术根本无法培育出完全相同的个体，原因可能是在细胞分裂过程中发生基因突变或个体发育中受细胞质基因及环境的影响。基因探针技术的原理是DNA分子杂交，可用于疾病诊断、生物检测等。
答案(1)全能(2)细胞核维生素、激素、氨基酸、核苷酸动物血清(3)细胞分裂过程中可能发生基因突变或卵母细胞的细胞质内也有遗传物质DNA，也控制后代的性状表达(4)基因工程人的胰岛素基因基因探针
【训练4】?在克隆羊多利的过程中，下列哪项技术没有运用到()。
A．细胞培养技术B．细胞核移植技术
C．胚胎移植技术D．基因工程技术
解析克隆技术需利用核移植以产生重组细胞，重组细胞经细胞培养形成早期胚胎后，需移植到母体子宫内发育成个体。
答案 D
1．(2011·江苏卷)关于现代生物技术应用的叙述，错误的是()。
A．蛋白质工程可以合成自然界不存在的蛋白质
B．体细胞杂交技术可以用于克隆动物和制备单克隆抗体
C．植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒
D．动物细胞培养技术可用于转基因动物的培养
解析克隆动物应用的是细胞核移植技术，所以B选项叙述错误。
答案 B
2．(2010·广东卷)新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术(或仪器)与应用匹配正确的是(双选)()。
A．PCR技术——扩增蛋白质
B．杂交瘤技术——制备单克隆抗体
C．光学显微镜——观察叶绿体的基粒
D．花粉离体培养——培育单倍体植物
解析本题主要考查学生的理解能力。PCR技术只能用来扩增核酸，不能用来扩增蛋白质；利用光学显微镜无法观察到叶绿体中的基粒。
答案BD
3．(2010·浙江卷)下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是()。
A．培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞
B．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变
C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的
D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养
解析本题主要考查细胞工程的有关知识，动物细胞培养可以分为原代培养和传代培养，原代培养到一定程度后要进行传代，因为细胞有接触抑制现象，当细胞接触时就会停止分裂(在细胞培养过程中进行的为有丝分裂，所以培养出来的多数细胞基因型相同)，但是细胞在培养过程中，传代次数也是有限的，一般为50次就会死亡，留下来的细胞就是发生了癌变的细胞，遗传物质发生改变，具有不死性，不再保留接触抑制现象，仍能进行传代培养，所以答案为D。
答案 D
4．(2009·全国卷Ⅰ)下列关于植物体细胞杂交或植物细胞质遗传的叙述，错误的是()。A．利用植物体细胞杂交技术可克服生殖隔离的限制，培育远缘杂种
B．不同种植物原生质体融合的过程属于植物体细胞杂交过程
C．两个不同品种的紫茉莉杂交，正交、反交所得F1的表现型一致
D．两个不同品种的紫茉莉杂交，F1的遗传物质来自母本的多于来自父本的
解析植物体细胞杂交可以用两种不同的植物细胞，从而可克服生殖隔离的限制，植物体细胞杂交的过程，实际上是不同植物体细胞的原生质体融合的过程。紫茉莉枝叶的性状的遗传是细胞质遗传，两个不同品种的紫茉莉杂交，正交、反交所得F1枝叶的表现型应与母本一致，F1的遗传物质来自母本的多于来自父本的，因为受精卵中的细胞质几乎全部来自母本。故C错误。
答案 C
5．(2009·浙江卷)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是()。A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基
C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性
解析动、植物成体的体细胞进行离体培养都要在无菌条件下进行，动物成体的体细胞离体培养用液体培养基，不能体现细胞的全能性，植物成体的体细胞离体培养不一定用液体培养基，能体现细胞的全能性。故C正确。
答案 C
6．(2009·山东卷)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒。该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：
请回答下列问题。
(1)过程①代表的是________。
(2)过程②构建A基因表达载体时，必须使用________和________两种工具酶。
(3)过程③采用的实验技术是________，获得的X是________。
(4)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的________所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行________比较；或用图中的________进行特异性结合检测。
解析本题以图展示了疫苗的生产和单克隆抗体的制备的过程，考查了中心法则、基因工程、动物细胞工程等现代生物科技。
(1)中心法则中，对于少数的以RNA为遗传物质的病毒，其遗传信息的传递过程需要补充的过程有RNA的逆转录和RNA的复制的过程，图中过程①正代表的是逆转录的过程。(2)基因工程的步骤是：目的基因的提取——构建基因表达载体——导入受体细胞——目的基因的检测和表达，其中构建基因表达载体中需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和载体。
(3)过程③是将瘤细胞与B淋巴细胞融合的过程，获得的叫杂交瘤细胞，其具备了瘤细胞的无限增殖的特性和B淋巴细胞的产生抗体的特性，从而制备单克隆抗体。
(4)本题考查了免疫预防的操作过程，以及欲确诊疑似患者而采取的方法。本题中提示该RNA 病毒表面的A蛋白为主要的抗原，故而可选用通过基因工程生产的A蛋白制备疫苗；确诊时为判断该病毒是否为题目中的RNA病毒，可以进行核酸序列的比对，也可以利用单克隆抗体具备特异性，利用抗A蛋白的特异性单克隆抗体通过能否特异性结合判断病毒表面是否有A蛋白的存在，进一步进行检测是否为目的RNA病毒。
答案(1)逆转录(2)限制性核酸内切酶(限制酶、限制性内切酶)DNA连接酶(两空可以互换)(3)细胞融合杂交瘤细胞(4)A蛋白核酸(基因)序列抗A蛋白的单克隆抗体7．(2009·江苏卷)动物器官的体外培养技术对于研究器官的生理、病理过程及其机制意义重大。下图是一个新生小鼠的肝脏小块培养装置示意图。请回答下列问题。
(1)肝脏切成小薄片，这有利于肝脏细胞____________________________________________。
(2)气室中充入5% CO2气体的主要作用是__________________________________________。
(3)培养液中添加抗生素是为了抑制细菌生长，但要注意选择抗生素的________，以保证抗
生素对肝脏无害。
(4)有机物X有毒性，可诱发染色体断裂。利用上图所示装置和提供的下列材料用具，探究肝脏小块对有机物X是否具有解毒作用。
材料用具：
肝脏小块，外周血淋巴细胞，淋巴细胞培养液，植物凝集素(刺激淋巴细胞分裂)；显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃皿，滴管；吉姆萨染液(使染色体着色)，有机物X溶液等。
实验过程：
①在淋巴细胞培养液中加入植物凝集素培养淋巴细胞，取4等份，备用。
②利用甲、乙、丙、丁4组上图所示装置，按下表步骤操作(“√”表示已完成的步骤)。
。
③培养一段时间后，取4组装置中的等量培养液，分别添加到4份备用的淋巴细胞培养液中继续培养。
④一段时间后取淋巴细胞分别染色、制片。在显微镜下观察________________，并对比分析。若丙组淋巴细胞出现异常，而甲组的淋巴细胞正常，则说明____________________________。解析本题考查动物细胞培养的相关知识。(1)把肝脏切成小薄片，有利于肝脏细胞的呼吸代谢，即吸收氧气和营养物质、排出代谢废物。(2)气室中充入5% CO2的作用是形成碳酸来维持培养液适宜的pH。(3)同时也要注意选择抗生素的种类和数量来抑制细菌生长。(4)乙组或丁组没有处理，向乙(或丁)组装置中放置肝脏小块作为对照实验，有机物X有毒性，可诱发染色体断裂所以要观察淋巴细胞的染色体形态和数量是否变化。甲组添加肝脏小块淋巴细胞染色体正常，丙组没有添加出现染色体异常，说明肝脏小块对有机物X具有解毒作用。答案(1)吸收氧气和营养物质、排出代谢废物(2)维持培养液适宜的pH(3)种类和剂量(4)向乙(或丁)组装置中放置肝脏小块染色体形态和数量肝脏小块对有机物X具有解毒作用
世界上没有比结实的肌肉和新鲜的皮肤更美丽的衣裳。
——马雅可夫斯基(1893～1930
论克隆技术的利与弊 湘潭大学化工学院环境科学与工程 LYL 摘要：自从克隆羊多利诞生以来,有关克隆技术的伦理学争论就一直喋喋不休。本文分析了克隆技术的发展过程,论述了克隆技术在科学技术中的应用前景,并对其所引出的伦理、道德等问题进行了探讨。 关键词:克隆,多利,伦理. 前言 1997年2月27日,著名的《自然》杂志发表了苏格兰罗斯林研究所威尔莫特(Ian Wilmut)等人撰写的实验研究论文,作者声明采用动物体细胞核移植技术(也即人们常说的克隆技术)成功产生出一例小羊羔,后来被命名为“多利”。许多人赞誉这是一项划时代的科学成果。例如,中国科学院院士邹承鲁先生曾经指出,“克隆羊”的出生是生物工程技术发展史中的一个里程碑[1]。同时,一石激起千层浪,宗教人士、法律专家、哲学家、社会学家等对克隆技术派生出的治疗性克隆和生殖性克隆产生强烈反响,并引发伦理问题的广泛争议。 1克隆技术的发展 1952年,科学家用青蛙进行克隆实验。从此以后,动物克隆的试验结果不断涌现。1970年克隆青蛙实验取得突破,青蛙卵发育成了蝌蚪。1984年第一只胚胎克隆羊诞生。1997年2月24日,英国罗斯林研究所的科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。1998年7月,日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。2000年1月,美国科学家宣布克隆猴成功。2000年3月14日,曾参与克隆小羊“多利”的英国PPL公司宣布,他们成功培育出5头克隆猪。随着一系列克隆技术突破的完成,克隆人从技术上来讲已成为可能。有的科学家认为,从技术上说克隆人并不比克隆其它哺乳动物更困难。克隆人即将出世的消息也不断传来。意大利著名的“克隆狂”安蒂诺里曾宣布,克隆胎儿将于2003年1月问世。2003年第一期《发现》杂志也把2002年“命名”为“克隆年”,理由是克隆技术在当时已经进入了克隆人的阶段。该杂志断言:“虽然世界不想要克隆人,但克隆
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 一、名词解析 1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
Germany embryologists pointed out for the first time, and then was born dolly, then what the pig sheep cow came, Use the way monkey cloning embryos split researchers recently announced that they in biotechnology fields have achieved a landmark progress. Scientists use the cloning of embryos split ways, created a monkey. Rather, it is a rhesus monkeys, named "TaiTeLa", it is the first time scientists have been cloned way to foster primates. Now the technology have been developed to human cloning is not a problem, but it is the condemnation of the factors against, so it YuKeLong application on organs necrosis, for the benefit of mankind. 德国胚胎学家首次提出的，然后就诞生了克隆羊多莉，接着的什么猪羊牛的都来了， 运用分裂胚胎的方式克隆猴子科研人员最近宣布,他们在生物工艺学领域取得了一项有里程碑意义的进展。科学家们利用分裂胚胎的克隆方式,培育出了一只猴子。确切地说,这是一只恒河猴,名叫“泰特拉”,它是科学家首次以克隆方式培育出的灵长目动物。 现在的技术已经发展到克隆人是不成问题的，但这会受到社会的谴责的因素的反对，所以就把它应用于克隆坏死的器官上，为人类造福。 Cloning technology, has experienced three periods: the first period is microbial cloning, which is a bacteria soon copies of tens of thousands of and it exactly the same bacteria, and become a bacteria group; The second period is biological cloning technology, such as by using the genetic gene-DNA cloned; The third period is animal cloning, namely the a cells cloned into an animal. Cloned sheep "duoli" by a head of s omatic cells and to which cloning, the use of animal cloning technology is. 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 As the new century advanced science, cloning technology from its birth of the moment attracts many the world's attention. As the world's largest developing country, China has been dedicated to the frontier science research. 作为新世纪的尖端科学，克隆技术从它诞生的那一刻起就吸引了众多世人的目光。作为世界最大的发展中国家，中国一直在致力于前沿科学的研究。 Science has always been a double-edged sword. But, a scientific and technological progress is not really good for people, the key lies in how to treat and apply it to humans, and not for the temporary unreasonable of it. 科学从来都是一把双刃剑。但是，某项科技进步是否真正有益于人类，关键在于人类如何对待和应用它，而不能因为暂时不合情理就因噎废食。 Cloning, is Clone of transliteration, meaning asexual reproduction, cloning technology which asexual reproduction technology. Recently reported the roslin institute of British trials are successful dolly, is for the first time use somatic cells cloned successfully, it in the biological engineering in history has turned a new page. 克隆，是Clone的译音，意为无性繁殖，克隆技术即无性繁殖技术。前不久报道的英国罗斯林研究所试验成功的克隆羊多利，是首次利用体细胞克隆成功的，它在生物工程史上揭开了新的一页。 At present, cloning, gene engineering research is improved by leaps and bounds of forward development, the establishment of the gene concept and the theory, opened the humans to understand life and control the window of the life. Genetic research has become the current scientific research of one of the most decisive field, become the impetus biological pharmaceutical industry, food and the development of the engine. As is known to all, the development of the 20 th century genetics worldwide attention, because the genetics of development, the social function of science and social science to the restriction of the more concern, from the test tube babies to cloning technology to the human genome map the affects all the hearts of men. 21 century is the century of biological technology revolution, the cloning technology application will promote genetics, cell developmental biology, produce scientific disciplines such as research, and to the whole world of scientific progress and improve the quality of life, the life of mankind will have
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
克隆技术与胚胎工程专题 一、考纲解读 1．考纲内容 《考试大纲》规定了考试的性质、内容、形式等，是广大教师和学生备战高考的重要依据。高考试题理应严格按照《考试大纲》编制，具有较高的信度、效度、必要的区分度和适当的难度。把《考试大纲》与高考试题进行科学比较，是评价高考命题成败的重要依据。2009浙江省考试说明对本专题的要求如下： 2．分析解读 该专题中浙江省考试说明作了三点改动：对植物的组织培养和胚胎工程的应用的要求由原来的Ⅱ级降为Ⅰ级；细胞融合与单克隆抗体的内容不作要求。本专题中所有考点的要求都为Ⅰ级；所列知识点要知道其含义，能够在试题所给予的相对简单的情境中识别和使用它们。对知识内容要求掌握的程度不高，但并不是说这个内容不重要，或者说不是考试的热点。其中胚胎工程的内容是课标教材新增添的内容，也是生物技术的重要组成部分，它赿来赿成为各国研究的重点和科技竞争的热点之一。这也将成为今后高考的热点，而且也是现代生物科技专题最有可能考的内容之一。 二、从前几年高考题目看高考趋势 (一)、理科综合试卷生物部分比较 1．题考查的知识点分布：
(四) 08年高考真题、09调研卷和样卷的比较
三、知识点归纳 动物的克隆知识结构 动物细胞培养 过程：取动物体内一部分组织，经机械或酶消化分散成单个细胞，原代 培养→传代培养→细胞系（细胞株） 应用：生产干扰素、病毒疫苗、单克隆抗体等 诱导剂：灭活的仙台病毒、聚乙二醇等 应用：主要用于制备单克隆抗体 效应B 骨髓瘤细胞 检验、克隆 体外培养、体内培养 过程： 应用：预防、治疗和诊断疾病 动物细胞融合 单克隆抗体 全能干细胞：具有形成机体的任何组织或器官直至形成完整个体的 多能干细胞：多能干细胞具有分化成多种组织的潜能，但不能发育 成完整个体 专能干细胞：只能分化成某一类型的细胞 动物细胞全能性 利用一个细胞的细胞核(供体核)来取代另外一个细胞中的细胞核， 形成一个重建的“合子”。 例如：豹蛙的囊胚细胞核移植、绵羊“多莉”的克隆过程。 细胞核移植 动物克隆
分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法： (1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段； ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重
专题2克隆技术 一、单项选择题 1.图为植物组织培养的基本过程，则制作人工种子和生产治疗烫伤、割伤的药物一一紫草素，应分别选用编号（） 脱分化再分化 ①———? ②一一一?③—— A .④② B .③②C.③④D.④③ 2 .单克隆抗体产生于（） A .促融剂作用下形成的杂交瘤细胞 B .单个杂交瘤细胞增殖形成的细胞群 C. B淋巴细胞分化形成的浆细胞 D .胚胎干细胞定向诱导形成的淋巴细胞 3. （2010年浙江理综）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（） A .培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 B .克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变 C.二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的 D .恶性细胞系的细胞可进行传代培养 4. （2010年浙江二测）下列有关克隆的叙述，错误的是（） A .转基因植物的培育利用了细胞的全能性 B .动物组织培养过程中不会发生组织分化 C. “多利”绵羊的性状与供核绵羊不完全相同 D .肝细胞难以克隆成个体是因为存在阻止核基因表达的调节蛋白 5. （2010年杭州月考）下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（） A .培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B .培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C.离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D .同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因型相同 6. （2010年佛山调研）下列有关生物技术的叙述，错误的是（ ） A .在植物细胞组织培养中胚不能作为组织培养的材料 B .多种显微操作和处理技术使体外受精、胚胎移植和胚胎分割成为可能 C.利用植物组织培养可以筛选出对人类有用的突变体
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
专题30 克隆技术 1．(2018·高考江苏卷)某种极具观赏价值的兰科珍稀花卉很难获得成熟种子。为尽快推广种植，可应用多种技术获得大量优质苗，下列技术中不． 能选用的是( ) A ．利用茎段扦插诱导生根技术快速育苗 B ．采用花粉粒组织培养获得单倍体苗 C ．采集幼芽嫁接到合适的其他种类植物体上 D ．采用幼叶、茎尖等部位的组织进行组织培养 解析：选B 。利用扦插、嫁接、植物组织培养的方法能快速繁殖种苗，且能够保持亲本的优良性状；花粉粒离体培养可获得单倍体幼苗，其性状可能与亲本不一样。 2．(2018·高考重庆卷)某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是( ) A ．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害 B ．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞 C ．出芽是细胞再分化的的结果，受基因选择性表达的调控 D ．生根时，培养基通常应含α -萘乙酸等生长素类调节剂 解析：选B 。消毒主要是为了杀死材料表面的微生物，同时要注意减少消毒剂对植物细胞的伤害，A 项正确；植物细胞融合前必须先去除细胞壁才能诱导融合，直接在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，不能得到融合细胞，B 项错误；出芽从细胞水平上看，是细胞分化的结果，从分子水平上看，是基因选择性表达的结果，C 项正确；生长素类调节剂可促进愈伤组织生根，因此生根时，培养基中应含有生长素类调节剂，D 项正确。 3．(2018·高考浙江卷)实验小鼠皮肤细胞培养(非克隆培养)的基本过程如图所示。下列叙述错误的是 ( ) 实验小鼠――→甲皮肤组织――→乙皮肤细胞――→丙培养细胞1――→丁培养细胞2 A ．甲过程需要对实验小鼠进行消毒 B ．乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化 C ．丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型 D ．丁过程得到的细胞具有异质性 解析：选C 。分析图示技术流程，结合动物细胞培养的基础知识作答。甲过程表示从实验小鼠身上取皮肤组织小块，该过程需要对小鼠进行消毒，故A 项正确。乙过程表示将皮肤组织分散为单个细胞，可用胰蛋白酶进行酶解消化，故B 项正确。丙过程表示由组织细胞培养到细胞系的过程，小鼠细胞是二倍体细胞，其细胞系大多数为有限细胞系，能继续培养下去具有异倍体核型的连续细胞系很少，故C 项错误。丁过程表示通过选择或纯化从细胞系中获得具有特殊性质的细胞株的过程，细胞株具有异质性，故D 项正确。 4．(2018·高考重庆卷)下图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述，正确的是( ) A ．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T 淋巴细胞 B ．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成 C ．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性 D ．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群 解析：选D 。①是从小鼠脾脏中获得的能产生抗体的浆细胞，A 项错误；②中应该使用能
克隆技术带来的伦理反思 许芳，长安大学，科学技术哲学，2011111078 【摘要】现代科学技术的快速发展，给人类带来了福祉的同时，也引发了科学技术与伦理道德的两难问题。科学技术是一把双刃剑，既有对人类有利的一面，也有其可能产生不利的一面。当科技改变生活，人类的命运也就开始逐渐被自己所掌握。生物科学技术的每一次飞跃，必然随之而来众多的非议，因为即使是一小步，都是在迈向那片禁区的一大步。单纯的科学，却很有可能带来不单纯的后果。克隆技术就是如此，它可能给人类带来巨大的利益，也可能给人类带来严重的后果。已经在动植物领域运用的克隆技术，是否适应于人类，尤其是生殖性克隆，对人类的生育方式、婚姻方式等方面的影响，也对伦理道德产生了全面冲击。解决这一问题不仅需要立法，更需要完备的道德体系，要做到既尊重科学技术，又要尊重人。 【关键词】克隆技术伦理道德尊重 一、克隆技术的概述 克隆是指生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。该术语很快得到学术界的认同并加以广泛使用。随着一系列克隆技术突破性的完成，克隆人也从技术上来讲已成为可能。这给我们带来了前所未有的伦理大思考，观念大考验。 克隆开始进入普通大众的视野，应当是由威尔姆特博士创造出“多利”这一轰动性的新闻传遍全球所引起的。克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎,再将发育到一定程度的胚胎植入动物子宫中使其怀孕，以产下与提供细胞者基因相同的动物，简单的说就是人工诱导的无性生殖方式。 二、克隆技术的发展 1952年，第一次进行动物克隆，罗伯特.布瑞格和托马斯.金对小蝌蚪的细胞核进行无性繁殖。1970年英国科学家约翰.戈德和同事经过培养的成年青蛙表皮细胞核克隆成功成年青蛙。1978年 7月 25日世界上首例经体外受精—胚胎移植形成的试管婴儿 Louise Brown 诞生。1993年人类胚胎克隆成功。1997年，英国胚胎学家威尔穆特和他的同事用母羊乳腺细胞克隆成功了第一只克隆羊“多利”，开创了成年哺乳动物克隆的先河。2000年6月22日，世界首批体细胞克隆山羊在中国西北农林科技大学诞生。2002年11月25日，美国科学家宣称首次成功克隆出可供医用的人类胚胎。2007年的 12月，韩国宣布成功地克隆了可以发荧光的小鼠，中国宣布克隆成功了兔。 三、克隆的负面影响
克隆技术及其应用与发展 目前克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展，基因概念及其理论的建立，打开了人类了解生命并控制生命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一，成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知，20世纪遗传学的发展举世瞩目，由于遗传学的发展，科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注，从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21世纪是生物技术革命的世纪，克隆技术的应用将促进遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究进展，有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高，对人类的生活将会产生深远的影响。 克隆、克隆技术 以及克隆的基本过程 “克隆”一词源于“Clone”的音译，指的是人工诱导动、植物的无性繁殖过程，这门生物技术就叫克隆技术。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，如：由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后再被植入动物子宫中使动物怀孕便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。 基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。 细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞。 个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞，也可能是一个组织。可以看出，基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作，以原有的基因或细胞或生物个体作为模板，复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料，或用胶片冲洗照片一样，从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎，只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料，然后将植入一个没有核子的卵子细胞内，通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的，多利羊的产生与三只母羊有关，其克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利，出生的“羊多”小绵羊与6岁母羊具有完全相同的外貌。 克隆技术在相关领域的应用 克隆的最终产物，如克隆牛、克隆鼠等都不是最重要的成果，基因克隆技术应是建立转基因动物模板的核心和关键性技术，利用转基因动物的体细胞大量复制出具有相同优良性状的个体。由于动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体，因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上。通常在动物育种中所采用的方法主要是杂交育种，即把两个具有不同优良性状的雌雄个体进行交配，然后在后代中去选择人们所需要的个体。要获得一个优良品种，往往需要几年甚至几十年的时间，而且必须不断地进行育种。如果采用动物个体克隆技术，就可以大量复制出人类所需要的优良个体，还可以大大缩短育种时间和节省大量的人力、物力。克隆技术的完善为转基因动物的繁殖开辟了一条通道，应用克隆技术可以将转基因绵羊
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
动物克隆技术的研究进展 前言 胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。 正文 一、克隆的概念 克隆一词是由clone音译而来，在音译名出现以前曾有一个意译名-无性繁殖系。克隆是指由一个细胞祖先经过分裂、增殖而形成的纯细胞系，这个细胞系中的每一个细胞含的遗传特性都是相同的，亦称为无性繁殖细胞系。单个细胞的无性繁殖细胞系叫克隆。动物体克隆是指将一个体细胞的细胞核转移植入去核卵中在母体子宫或其它环境中发育成新个体。 二、动物克隆的理论基础 在许多人眼里，体细胞克隆羊多莉(Dolly) 的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆(clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902 年德国植物学家
Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958 年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha 和Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。 与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性(nuclear equivalency) 或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30 年代，著名的胚胎学家Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠、牛及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。 克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后（罗斯林研究所克隆羊采用的时间约为6天），再植入动物子宫中使动物怀孕使可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。培育成功三代克隆鼠的“火奴鲁鲁技术”与克隆多利羊技术的主要区别在于克隆过程中的遗传物质不经过培养液的培养，而是直接用物理方法注入卵细胞。这一过程中采用化学刺激法代替电刺激法来重新对卵细胞进行控制。1998年7月5日，日本石川县畜产综合中心与近畿大学畜产学研究室的科学家宣布，他们利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。这两头克隆牛的诞生表明克隆成年动物的技术是可重复的。 三、克隆在医药领域的研究