流式细胞术在临床检测上的应用
（一）淋巴细胞亚群分析
目前主要开展的项目：
1．T/B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8
2．绝对计数
3．活化淋巴细胞的检测（CD69/HLA-DR/CD71）
4．CD4+Th/i 和CD8+ Ts/c进一步区分
5．Naïve/Memory T细胞亚群检测
6．Th1/Th2亚群的检测
临床意义：
•了解在不同情况下体内免疫功能状态
•辅助临床疾病的诊断
•探索疾病的发病机理、病程、预后
•监测、指导临床治疗方案
•免疫系统疾病，如SLE等
•免疫缺陷病，AIDS
•移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测
•肿瘤病人化疗后免疫力检测
推荐试剂：
T/B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8:
绝对计数
活化淋巴细胞检测
Th1/Th2检测
（二） HLA-B27的检测
HLA-B27与强直性脊椎炎（ankylosin spondylitis，AS）具有高度的疾病相关性，B27的个体的该病的相对危险率达300以上，AS病人中约95%以上的个体是B27。同时，与B27高度相关的疾病还有：莱特儿病（包括腹泻、多发性关节炎、尿道炎、结膜炎等的综合症，Reiter’disease）和急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis）等，最新近研究认为还和心肌炎等心脏病有关联。
BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%
推荐试剂：
（三）血液学上的应用
1．白血病和淋巴瘤免疫分型
用流式来检测对下列情况有重要意义：
•用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。
•形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。
•混合性白血病。
•部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。
•慢性淋巴细胞白血病。
•微小残留白血病。
2．造血干细胞计数
主要应用于
•PBSC采集前CD34阳性细胞动员有效性的检测
•各种造血干细胞移植物的CD34+细胞计量控制
•化疗强弱的掌握
•贫血的鉴别（如再障，缺铁性贫血等）
•基因治疗
推荐试剂：
3．PNH诊断
阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血。利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例
双色：CD55 FITC 555693 CD59 PE 555764
单色：CD55 FITC 555693 CD59 FITC 555763
推荐试剂：
4．血小板分析
•血小板活化的相关检查
血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63
血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1
临床意义：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成
✓心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关
✓预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性
✓缺血性脑血管病与血小板活化有关
✓子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加
✓抗血小板治疗疗效监测
•血小板减少性疾病
网织血小板的检测
✓特发性血小板减少症的诊断和治疗指标
✓鉴别因血小板消耗引起的血小板减少症（如ITP）和因骨髓增生不良引起的血小板减少症（如再障）；
✓肿瘤化疗疗效的监测；
✓自体骨髓移植和外周血干细胞移植疗效监测
推荐试剂：
血小板活化
网织血小板
（五）肿瘤早期诊断
根据DNA在整个细胞周期中有规律的变化这一特点，利用核酸染料来检测。
•DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。
•淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能做出早期诊断之前，FCM可以提供确切的诊断信息。
•DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待。
•形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能。
•DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标。
推荐试剂
DNA倍体检测
（六）细胞因子检测
细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能调节方面发挥重要作用。
细胞因子可以调节多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答，研究生理或病理免疫调节因素所致细胞因子合成的应答与改变是研究疾病病因与免疫状态的重要工具。
T细胞的细胞因子分型分为I型和II型
Ⅰ型细胞介导免疫反应
引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调
刺激来源：病毒、某些细菌
Ⅱ型体液介导免疫反应
引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调
刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源
细胞因子相关的主要研究领域
•肿瘤
•肾炎
•感染
•自身免疫病
•超敏反应
•移植排斥反应
•免疫缺陷病
•血液疾病
1．胞内细胞因子检测
推荐试剂
2．血清血浆中可溶性细胞因子定量检测
BD专利的CBA系统则是将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒上，根据夹心法的原理使用流式细胞仪对其进行定量的检测技术。
与传统的ELISA方法相比：
●CBA所需样本体积仅为ELISA分析所必需样本量的1/6
●CBA的灵敏度与ELISA相当，但稳定性更好，符合细胞因子检测的国际标准
（经美国NIBSC的gold标准测试）
●对标准品混合物做一次流式检测，就可得到样本中各种被分析物相应的标准曲
线
●能避免由于酶联放大技术使信号失真导致的假象
CBA实验时间比单次ELISA大大缩短，而且能提供需要做6次ELISA才能得到结果。
推荐试剂：
https://www.doczj.com/doc/c419050201.html, 流式细胞仪在医学检验中的应用 流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。 近年来，FCM的发展日新月异，技术不断有新的突破，新型仪器不断涌现，同时，FCM 在医学及其他科学的应用更加广泛和深入，涵盖了从基础研究到临床诊断的多个方面，涉及免疫学、血液学、肿瘤学等。 图1. 流式细胞术工作原理图 一、流式细胞术的研究进展 1. 流式细胞仪的进展 近年来，随着将多种不同波长的新型激光器与新型荧光染料的新型染色剂相结合，流式细胞仪性能不断提升，体现在分析速度的提高、灵敏度和精密度的提升，以及激光通道和参数的增多。此外，流式细胞仪不断打破传统的界限，实现了多学科的交叉发展，诞生了一些新理念、新技术融合的仪器。例如，微流控芯片流式 细胞仪，是基于微机电技术的一种小型流式细胞仪， 具有结构简单、操作方便、体积小、价格低廉等特点； 声波聚焦流式细胞仪是采用超声波原理将细胞聚焦 于流动室的中轴上，代替传统的流体动力，实现高通 量、高精确度分析；质谱流式细胞仪将传统流式细胞 仪与质谱分析技术相结合，采用同位素标记特异性抗 体，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技 术，可以克服荧光素发光光谱相互干扰导致的波谱重 叠、影响分辨的问题；将传统的流式细胞仪的荧光信 号与荧光显微镜的形态学结合，形成了成像流式细胞仪，检测者可以目睹到每个细胞或颗粒的形态。质谱流式细胞仪和成像流式细胞仪可以被称为二代流式细胞仪。
临床流式细胞术在白血病诊断中的应用 白血病是一种危害人类健康的恶性肿瘤疾病，而临床流式细胞术作 为一种高度敏感和特异的检测手段，在白血病的诊断与疾病监测中发 挥着重要作用。本文将探讨临床流式细胞术在白血病诊断中的应用， 为临床医生提供更准确、更快速的白血病诊断方法。 一、渗透溶解细胞检测 临床流式细胞术在白血病诊断中的首要步骤是对患者样本进行渗透 溶解细胞处理，使得白细胞膜溶解并释放细胞内内容物。这一步骤的 重要性在于有效提取细胞，并将它们分散至测试管中。 二、特异性标记 在渗透溶解细胞处理后，接下来的关键步骤是对白细胞进行特异性 标记。临床医生可以将荧光抗体添加到细胞中，这些荧光抗体能够与 特定蛋白质结合，从而将不同类型的白细胞区分开来。通过这种方式，临床流式细胞术可以提供全面且准确的白血病亚型识别。 三、流式细胞术仪器操作 临床流式细胞术采用了先进的仪器，如流式细胞仪，有助于实现高 通量的细胞检测与数据分析。流式细胞仪通过激光束照射细胞，然后 测量细胞散射和荧光信号。这种技术使得临床医生能够快速、高效地 分析数以万计的细胞，并获得准确的白血病细胞计数。 四、数据分析与结果解读
得益于流式细胞术仪器的高度灵敏性，临床医生可以对获得的数据 进行详细的分析与解读。通过比较患者样本与正常对照品的差异，医 生能够确定是否存在白血病细胞的存在。此外，还可以进一步识别出 不同的白血病亚型，以指导后续治疗决策。 五、临床应用与前景展望 临床流式细胞术在白血病诊断中已取得显著的成果，尤其在慢性淋 巴细胞性白血病 (CLL) 的诊断与监测上应用广泛。同时，该技术在急 性白血病、骨髓瘤等其他白血病亚型的诊断中也表现出了良好的应用 前景。 未来，临床流式细胞术在白血病诊断领域的应用还会得到进一步的 发展。随着技术的不断更新和改进，该检测方法将变得更加高效、更 加精确。此外，流式细胞术与其他检测手段的结合也为白血病诊断提 供了新的思路和方法。 结论 临床流式细胞术作为一种敏感、特异的检测手段，为白血病的诊断 与疾病监测提供了重要的工具。通过渗透溶解细胞检测、特异性标记、流式细胞术仪器操作以及数据分析与结果解读，医生能够准确判断是 否存在白血病细胞，并进一步识别白血病亚型，从而指导个体化的治 疗决策。随着技术的不断发展，临床流式细胞术在白血病诊断中的应 用前景将变得更加广阔。
流式细胞术在临床检验中的应用 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种可对单细胞悬液进行快速定性、定量分析和分选的技术。它不仅可以对细胞表面抗原进行检测，也能对细胞内部的生物大分子进行检测，能够在细胞水平上对相关疾病进行诊断和病程监测。因此在临床医学及科学研究中发挥着非常重要的作用。随着技术水平的不断提高及完善，FCM得到了更为广泛的应用。目前，FCM在临床检验方面主要应用于血液学、免疫学、肿瘤、等临床医学和基础医学研究领域，具有检测样品快速、准确以及灵敏度性高等特点，为临床检验提供了一种强有力的手段和全新的医学视角，是临床检验工作中重要的一种研究工具。 FCM主要由液流系统、光学系统、电子系统组成。其主要基本原
理是将待测样本染色后制成单细胞悬液放入样品管中，通过气体的压力使样品进入鞘液，鞘液与样品之间会形成一定的压力，当压力达到一定程度后，在鞘液的带动下，单细胞悬浮样品会形成单细胞柱状经过激光聚焦区，样品柱与激光束垂直，由于样品经特异性染料处理，因此在激光激发下会产生特定波长的荧光。流式细胞仪中的光学系统收集到荧光信号后进行信号处理，再经过计算机系统对这些数字信号收集、储存，以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来，然后做出统计分析从而获得所需要的检测结果。 1．FCM在血液学中的应用 FCM主要通过对外周血细胞和骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析对各种血液病如白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的分型、诊断、治疗及预后判断均有重要作用。血细胞在白细胞系、红细胞系、巨核细胞系、血小板及非造血细胞均有不同的分化抗原表达，分布在细胞质、细胞膜中。血液肿瘤细胞的特征是丧失了正常细胞的系类专一性和分化阶段的规律性，运用FCM将具有系列特异性并涵盖不同分化阶段的单克隆体作为分子探针来检测血液肿瘤细胞的内外抗原，可以反映其本质上与正常造血细胞的差异。由于不同的血细胞系统都有其特有的表面抗原，FCM通过采用各种血细胞表面分化抗原特异的单克隆抗体，借助于各种不同的荧光染料（FITC、PE）可同时检测一个单细胞的不同参数，根据所测的参数结果来判断出该血细胞的属性。在各种急性白血病的诊断和鉴别中，一般形态学检查很难区分，而FCM对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有着重要的价值。FCM还可以通过噻唑橙、丫啶橙等荧光染料与红细胞中的RNA结合定量地测定网织红细胞中的RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比，从而准确地反映骨髓造血功能。此外FCM还可以测出网织红细胞的成熟度，对红细胞增值能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放化疗对骨髓的抑制状况等提供依据。FCM 在血小板相关疾病的诊断中也有许多
流式细胞术的医学应用现状与前景 流式细胞术是一种通过流式细胞仪对细胞进行快速而精确的分析的技术。它通过激光 扫描细胞表面的荧光标记物，可以对细胞的大小、形状、表面标记物的分布、细胞器的含 量等进行分析。流式细胞术在医学研究、临床诊断以及药物研发等领域有着广泛的应用和 发展前景。 流式细胞术在医学领域的应用非常广泛，主要包括以下几个方面： 1. 白血病的诊断与监测 流式细胞术可以通过对血液样本中的白血细胞进行分析，帮助医生诊断出白血病的类型，判断疾病的进展情况和病情的稳定性，以及选择针对性的治疗方案。通过流式细胞术，医生可以对白血细胞中的各类标记物进行检测，从而更准确地判断病情。 3. 肿瘤的诊断与治疗 4. 其他临床诊断应用 除了以上几个方面，在临床诊断中还可以利用流式细胞术对感染病原体的检测、血液 中的细胞数量和比例的分析、器官移植中的免疫抑制剂效果的监测等方面进行分析。 随着科学技术的不断发展和进步，流式细胞术在医学领域的应用前景也越来越广阔。 1. 高通量技术的应用 近年来，随着高通量技术在生物医学领域的发展，流式细胞术也开始应用这些技术， 将其从单细胞水平扩展到多细胞水平，可以同时对数百种标记物进行分析，从而更全面地 了解细胞的状态和功能。这对于癌症、自身免疫性疾病等疾病的诊断和治疗具有重要意 义。 2. 精准医学的发展 随着精准医学的发展，流式细胞术的应用也将更加个性化和精准化。通过对患者个体 细胞的分析，可以更准确地了解其病情、预测其治疗效果和预后情况。在未来，流式细胞 术将在精准医学中发挥更加重要的作用。 3. 多学科交叉应用 流式细胞术不仅在医学领域有着广泛的应用，还可以与其他学科进行交叉应用，如生 物学、化学、生物工程学等领域。这将为流式细胞术的发展带来更多的创新思路和技术手段，推动其在医学领域的应用和发展。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/c419050201.html, 流式细胞技术在临床医学检验中的应用 作者：胡小红 来源：《健康必读·下旬刊》2018年第01期 【摘要】目的：流式细胞技术是一种用于实现对单细胞开展定量分析、迅速定性的新型 技术，在临床及相关研究方面均具备重要作用及价值。近年来，随着相关研究及技术的不断发展，流式细胞技术的应用范围呈现逐年扩张趋势。本次研究将流式细胞技术的工作原理及发展状况作为研究基础，对流式细胞技术在免疫学、肿瘤学、血液学等方面的相关应用展开探究。现将流式细胞技术在临床医学检验中的应用综述如下。 【关键词】流式细胞技术；临床医学；检验；应用 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2018）01-03-0-01 流式细胞技术是一项涉及众多学科的综合性技术，其涉及到的技术主要为计算机技术、细胞生物学技术、物理学技术、激光技术、免疫学技术等，流式细胞技术开展的基础在于细胞处于快速流动状态，随后对处于流动状态的细胞展开分析处理[1]。流式细胞技术逐渐被应用于 诸多领域，如细胞生物学、肿瘤学、免疫学、细胞遗传学、生物化学、临床医学、临床检验等。 1 流式细胞技术的工作原理 流式细胞技术的实现过程需借助于流式细胞仪，流式细胞仪的结构以信号处理及分析系统、光学系统、激光及光学系统、液体流动系统、细胞分裂帅选系统等五部分为主，借助于激光技术实现对细胞标记物的荧光宽度及强度、侧向及前向散射光宽度与强度等参数的有效测量，采取荧光标记处理的单克隆抗体在种类上具备差异性，借此可以实现对细胞上不同抗原物质的定量检测处理，实现对细胞的有效区分及成分分析处理[2]。 2 流式细胞技术在免疫学中的相关应用 在对机体患病情形实施诊断处理时，通常需要借助于免疫学相关指标。目前临床检验过程中已经将流式细胞技术作为机体免疫状况的主要检测技术，检验指标以T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤淋巴细胞的水平为主。检测处理过程需借助于表面标志物质，以便对各细胞及细胞内不同细胞因子在体内的水平有所了解与掌握，通过对患者淋巴细胞亚群数量的测定实现对患者免疫状况的有效检测处理，并为临床后续诊断及相关治疗处理提供可靠、有效的指导作用。相较于传统免疫学检测处理措施，流式细胞技术与单克隆抗体技术相结合，实现准确、定量检测的目标。 3 流式细胞技术在肿瘤学中的相关应用
流式细胞的原理及临床应用 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的技术。它通过将单个细胞与特异性抗体结合，实现对细胞表面和内部抗原的定量和定性分析。流式细胞术可以同时分析多个细胞参数，具有速度快、精度高、可量化等优点。 样品准备：将待检测的细胞样品进行洗涤、固定、荧光染色等处理，以便于后续的检测。 液流形成：将处理后的细胞样品放入流式细胞仪中，通过高压液流系统形成稳定的液流。 细胞检测：在液流中，细胞与特异性抗体结合，产生荧光信号。这些信号被光电倍增管（PMT）收集并转换为电信号。 数据处理：收集到的电信号经过计算机处理，转换为可分析的数据，如细胞计数、抗原表达量等。 流式细胞术在临床上有广泛的应用，主要包括以下几个方面： 免疫学研究：流式细胞术可用于分析免疫细胞的种类、数量和功能状态，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等。通过对免疫细胞功能的
评估，可以研究免疫系统在疾病发生和发展中的作用。 肿瘤诊断与分期：流式细胞术可以检测肿瘤细胞表面的抗原表达，有助于肿瘤的诊断和分类。同时，通过分析肿瘤细胞的增殖能力、细胞周期等参数，可以为肿瘤的预后评估和个性化治疗提供依据。 感染性疾病诊断：流式细胞术可以快速检测病原体特异性抗原或抗体，有助于感染性疾病的诊断和分型。例如，流式细胞术可以用于区分病毒、细菌和其他微生物等感染。 遗传病诊断：流式细胞术可以分析染色体的数量和结构异常，用于遗传病的诊断和产前筛查。例如，唐氏综合征、威廉姆斯综合征等遗传病的诊断。 血液病诊断：流式细胞术在血液病的诊断中也发挥着重要作用。它可以分析血液中的各种细胞类型和功能状态，为贫血、血小板减少、白血病等血液病的诊断提供依据。 药效评估：流式细胞术可以用于评估药物的疗效和安全性。例如，在免疫治疗中，可以通过流式细胞术监测免疫细胞的活化和功能变化，以评估治疗的有效性。 移植监测：在器官移植中，流式细胞术可用于监测供体和受体之间的
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞术最新进展及临床应用 流式细胞术( F l o w cy t o m e t r y, F C M), 临床上也被称为流式细胞分析,是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/ 定量( 相对/ 绝对) 分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本,在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域,是未来临床检 验不可替代的检测方法之一。传统流式细胞术,也被称为荧光流式细胞术,是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术,定量方式多为定性分析,检测参数类型单一、数目有限,数据分析复杂且缺乏标准化分析流程,不同检测中心间数据重现性差,这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。近年来,为克服以上问题,流式细胞术不断突破与创新,从定性检测发展为定量检测;从单参数分析、双参数分析发展成为多参数分析;从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原;从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等;从一维定量检测发展为二维定量定位分析,从体外检测发展为体内检测等;这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等,因此将更为广泛应用于临床检测。 1定量流式细胞术 定量流式细胞术( Q u a n tit a ti ve fl o w cy t o m e t r y, QFCM),即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧光素的中值荧光强度 ( M e d i a n fl u o r e s ce n t i n t e n s it y, M F I ) 或每个细胞结合的抗体单位( A n ti b o d i e s b o und t o p e r ce ll,A BC) 来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术,但由于M F I缺乏标准化度量方法,容易引起不同检测中心检测结果重现性差,导致诊断和治疗决策的不确定性及不可靠性, 限制了其在临床的推广应用, 因此,标准化M F I测量为流式细胞术实现精确定量分析,在临床广泛应用的必经之路。目前,在临床应用过程中,为提高检测结果的准确性及重现性,定量流式细胞术必须做到以下几点:淤样本及试剂处理严格按照标准操作规程,每一次检测必须设置质控管; 于流式细胞仪维护及校准。每一次检测前进行仪器校准;盂检测流程标准化及规范化;榆数据分析自动化。流式检测数据量庞大,分析难度大,经验性强, 人工分析存在主观性和低保真度等特点。实现机器操控及数据分析的标准化、自动化将会大大提高检测数据的再现性及可靠性。 2多色流式细胞术 多色流式细胞术 ( M u lti co l o r fl o w cy t o m e t r y, MFC) 是指利用超过三种的荧光素实现多个参数同时检测的流式细胞技术。近年来,随着流式细胞仪硬件( 激光管、滤光片等)、软件( 数据分析等) 的不断改进,荧光素的不断开发及应用,临床诊断领域的不断发展及需求,MFC 应运而生。大部分临床检验中心的流式细胞仪具备 2 ~ 3 个激光器,可以同时检测9 ~ 10 色荧光,甚至出现了 5 激光20 参数同时检测的流式细胞仪。多色流式细胞术可以快速准确高灵敏的检测细胞内多个指标,实现从复杂样本中识别罕见细胞群,为疾病诊断、药物开发等提供了强大的工具,是流式细胞术未来发展的主要趋势,也是流式细胞术在临床应用的主要方向。但由于结果分析的复杂性,MFC 目前在临床应用中还主要是作为探索或辅助手段。例如,吴江等[1] 利用多色流式细胞术分析急性 HIV 感染者外周血酌啄T 细胞的表型,探索哪一种酌啄T 细胞在急性 HIV 感染及疾病进展中发挥重要作用。流式细胞术评分系统经常被整合到疾病诊断和预后评分系统中,辅助精细评分。例如, 基于CD79b( 或 CD22 )、CD23、CD5、FMC7 及 SmIg检测的流式细胞术免疫分型评分参与辅助诊断慢性淋巴细胞白血病[2] ;利用 MFC 检测骨髓祖细胞侧向角散射光、CD117 表达以及单核细胞 CD13 表达等参数建立的流式检测积分系统可以补充目前的骨髓增生异常综合征国际预后评分系统( IPSS鄄R),实现更为精确的预后评估[3] ;利用 MFC 检测分析来自骨髓的造血细胞的免疫分型可以辅助慢性髓细胞白血病的诊断、预后和治疗[4] ;利用MFC 检测白血病细胞表面分化抗原可以辅助白血病分型诊断及白血病微小残留物诊断[5] ;基于G P I锚连蛋白缺失检测的MFC 可以辅助阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断;基于多种分子标记物[ 血小板特异性膜糖蛋白( GP域b / 芋a、GP玉b鄄御鄄吁、GP玉a / 域a 等)、血小板颗粒膜糖蛋白( CD62P、CD63、CD107a、CD107b 等)]、Ca2+ 流及RNA 含量等检测的 MFC 可以辅助血小板功能分析等
临床流式细胞术在免疫学中的应用免疫学作为一门研究机体免疫系统的学科，在医学领域中具有重要 的地位。而临床流式细胞术作为一种用于分析和鉴定细胞的工具，已 经广泛应用于免疫学研究中。本文将重点探讨临床流式细胞术在免疫 学中的应用。 一、流式细胞术的基本原理 流式细胞术是一种基于流式细胞仪的细胞分析方法，利用荧光标记 的抗体与细胞表面和胞内分子相互作用，通过光散射和荧光信号来鉴 定和分析细胞。它广泛应用于免疫表型分析、免疫功能检测、细胞分 选和细胞生物学研究中。 二、流式细胞术在免疫表型分析中的应用 免疫表型分析是通过检测细胞表面和胞内标志物的表达水平来研究 细胞类型和状态的方法。流式细胞术通过标记不同的抗体来检测细胞 表面和内部蛋白的表达，进而可以快速、准确地确定细胞的免疫表型。 三、流式细胞术在免疫功能检测中的应用 免疫功能检测是通过评估细胞的功能状态来研究免疫系统功能。流 式细胞术可以通过检测细胞的分泌物、细胞因子的表达和细胞内信号 通路活性等指标，来评估细胞的功能状态，从而帮助医生诊断疾病和 制定治疗方案。 四、流式细胞术在细胞分选中的应用
细胞分选是将混合细胞群中的特定亚群细胞分离出来的方法。流式 细胞术通过标记特定蛋白或标志物的抗体，结合流式细胞仪和细胞排 序设备，可以实现快速、高效地分离出目标细胞，用于进一步的实验 研究。 五、流式细胞术在细胞免疫学研究中的应用 细胞免疫学研究主要研究细胞的免疫应答和免疫调节机制。流式细 胞术可以用于研究细胞的增殖、凋亡、细胞周期和细胞死亡等生物学 过程，帮助深入了解免疫系统的功能和调控机制。 六、流式细胞术的发展和应用前景 随着科技的不断进步，流式细胞术在免疫学中的应用也在不断扩展。高维度流式分析、多参数细胞分选和新一代流式仪器的发展，有望为 免疫学研究提供更为精细和全面的数据，加速疾病的诊断和治疗进展。 总结：临床流式细胞术作为一种流行于免疫学中的细胞分析方法， 广泛应用于免疫表型分析、免疫功能检测、细胞分选和细胞免疫学研 究中。随着科技和仪器的不断进步，流式细胞术的应用前景仍然广阔，将有助于深入了解免疫反应机制、疾病的发生发展以及个体化治疗的 实现。
流式细胞术在临床检测上的应用 （一）淋巴细胞亚群分析 目前主要开展的项目： 1．T/B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8 2．绝对计数 3．活化淋巴细胞的检测（CD69/HLA-DR/CD71） 4．CD4+Th/i 和CD8+ Ts/c进一步区分 5．Naïve/Memory T细胞亚群检测 6．Th1/Th2亚群的检测 临床意义： •了解在不同情况下体内免疫功能状态 •辅助临床疾病的诊断 •探索疾病的发病机理、病程、预后 •监测、指导临床治疗方案 •免疫系统疾病，如SLE等 •免疫缺陷病，AIDS •移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 •肿瘤病人化疗后免疫力检测 推荐试剂： T/B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8: 绝对计数 活化淋巴细胞检测
Th1/Th2检测 （二） HLA-B27的检测 HLA-B27与强直性脊椎炎（ankylosin spondylitis，AS）具有高度的疾病相关性，B27的个体的该病的相对危险率达300以上，AS病人中约95%以上的个体是B27。同时，与B27高度相关的疾病还有：莱特儿病（包括腹泻、多发性关节炎、尿道炎、结膜炎等的综合症，Reiter’disease）和急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis）等，最新近研究认为还和心肌炎等心脏病有关联。 BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5% 推荐试剂： （三）血液学上的应用 1．白血病和淋巴瘤免疫分型 用流式来检测对下列情况有重要意义： •用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。 •形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。 •混合性白血病。 •部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。 •慢性淋巴细胞白血病。
流式细胞术应用于医学检验的研究进展 随着科技的发展和医学人员对诊断和治疗需求的不断提高，流式细胞术逐渐成为了医学检验中的重要技术。流式细胞术是一种基于细胞表型学和细胞功能学的高科技方法，具有快速、准确和灵敏度高的特点。它可以用于检测和分析目标细胞在生理状态下的表型和功能，对各种疾病的诊断和治疗提供有力的支持。本文将重点介绍流式细胞术的原理、技术特点和在医学检验中的应用进展。 一、流式细胞术的原理 流式细胞术是一种基于悬液细胞的物理活动特点和光学检测原理的细胞分析技术。其基本原理是利用流式细胞术仪器将悬浮细胞按照大小、电荷、荧光等物理性质进行识别和分选，通过光散射和荧光检测技术确定细胞数量和特定分子在细胞表面或内部的表达情况，从而分析细胞的表型和功能。 具体而言，流式细胞术的流程包括细胞处理、细胞染色、细胞检测和数据分析等四个步骤。首先，要将样品中的细胞处理成单细胞悬浮液，并加入适量的细胞染色剂，使目标细胞表面或内部的特定分子产生荧光信号。然后，将悬浮细胞通过一条狭窄的流式细胞术仪器鉴别通道，利用激光束对细胞进行检测，同时对细胞进行分类和分选，将目标细胞单独收集。最后，通过计算机软件进行数据分析，得到细胞数量、分子表达和分子数量等信息。 二、流式细胞术的技术特点 流式细胞术作为一种高科技的细胞分析技术，具有以下几个显著的技术特点： 1. 高速度 流式细胞术中的细胞检测和分选速度非常快，每秒钟可检测和分选数千个甚至数万个细胞，数量级比传统细胞分析技术高几百倍，因此适用于大样本的细胞分析。 2. 高准确度
流式细胞术能够在单细胞水平对细胞表型和功能进行检测和分析，具有高准确度的特点。同时，流式细胞术能够检测多个分子的表达情况，从而减少了固定和染色的过程，降低了操作的误差和不确定性。 3. 多功能 流式细胞术可以检测和分析不同类型的细胞，包括悬浮细胞和贴 壁细胞等，同时可以检测多种荧光颜色和多个标志，能够同时分析多 种细胞表型和功能的变化。 4. 高灵敏度 流式细胞术的灵敏度非常高，灵敏度可达到单细胞水平。同时， 流式细胞术中的荧光染色可用于检测生物样品中极低浓度的物质，如 细胞因子、蛋白质等，从而可以用于医学检验的高敏感性分析。 三、流式细胞术在医学检验中的应用 流式细胞术的广泛应用，表明它在医学检验领域的实用性和重要性，是一项重要的辅助诊断技术。下面将重点介绍流式细胞术在医学 检验中的应用进展。 1. 免疫学检测 流式细胞术可以用于免疫学检测，如T细胞、B细胞、自然杀伤 细胞等免疫细胞的鉴别和分类。在T细胞亚群的鉴别中，可利用CD4 或CD8作为鉴别标志进行特异性检测，这个方法也可用于对艾滋病病 毒感染者的CD4细胞计数。同时，流式细胞术还可以针对不同类型的 疾病进行细胞免疫学分析，对诊断和预后评估具有重要作用。 2. 血液学检测 流式细胞术可以应用于血液学检测中，例如对白细胞亚群的检测、骨髓细胞的分类，以及淋巴瘤等恶性肿瘤的诊断和分类。在白细胞亚 群的检测分析中，可利用CD45、CD14、CD3等标志进行不同细胞亚群 的鉴别，常用于临床上对感染、炎症、肿瘤等疾病的诊断和疗效评估。 3. 微生物学检测 应用流式细胞术可以对微生物或寄生虫进行快速定量检测和分析。流式细胞术可以检测到重要的靶标分子，如细胞蛋白、寄生虫/细菌结 构蛋白、毒素等，常用于临床上对感染和传染病的快速检测和监测， 如流感、HIV、乙肝等。
流式细胞术的基本原理及其应用 流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个 经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记 物进行定量和定性分析。流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包 括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分 析软件等。 应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有 广泛的应用。以下是几个流式细胞术的应用举例： 1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体 标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。这种技 术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫 疾病的诊断。 2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周 期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。通过分析细胞周期，可以 确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发 展过程中的细胞生长和增殖。 3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋 亡（程序性细胞死亡）的过程。凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性 变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。 4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复 杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。这种细胞分选技术在基因表达、
单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。 5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。 总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。
流式细胞术及其临床应用 ABSTRACT Key words: Flowcytometry; Immunophenotyping; Leukemia; Activated platelets; Tumor; Apoptosis. 流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。包绕细胞的液流称为鞘液。所用仪器称为流式细胞仪（flowcytometer FCM）。流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。 一、流式细胞仪(flowcytometer FCM) 1．流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的结构一般可分四部分，见图1。 （1）流动系统 流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。细胞悬液和鞘液分别（是分别还是同时）进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 （2）激光系统 多采用氩离子激光器。使发射光在可见光谱范围内488nm激发。目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。激光的单色性好，功率高，稳定。 （3）光学和电子系统 激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(360?)发射。有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)主要用于检测细胞体积的大小。另一为侧向散射(SSC)用于检测细胞膜，胞质，核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。 荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。荧光波长与激光波长不同，而且强度较弱，因此要使用光学滤片滤除非荧光信号并使用灵敏的检测器。荧光测量时通常使用线性放大器（即放大器的输出与输入是线性关系），适用于较小范围内变化的信号，如前向角散射和DNA测量。但有时需要对数放大器（即输出与输入是对数关系）。如果原来输出为1，当输入增加到原来的10倍时，输出是2。在免疫学检测中常使用对数放大器，因为在免疫学的样品中，可能有的细胞未被染色而仅有自发荧光，为阴性群体；被染上色的细胞特异性荧光可能比自发荧光强数倍到数十倍，为阳性群体。使用对数放大器可以同时分辨出亮度差异大的多个细胞亚群，容易选定不同亚群间的分界点，有利于流式细胞仪的分析和分选。 荧光信号的补偿：当用一种激光束同时激发两种染料发射出两种不同波长的荧光时，两种荧光发射光谱有一定的重迭，可用电补偿减去不适合荧光通道测定的重迭信号。 （4）数据贮存和计算机控制系统 数据贮存采用列表排队(List Mode)方式。利用计算机用多种图形来表明各参数间的相互关系，以单参数直方图，双参数二维点图，等高图等方式显示。数据分析一般设定正确的分析范围，划分计算区域和计算结果。
流式细胞术在临床医学中的应用进展流式细胞术在临床医学中的应用进展 流式细胞术在临床医学中的应用进展【1】 【摘要】流式细胞术(FCM)是一种对单细胞快速定量分析的新技术,能够快速分析单个细胞的多种特性，其既可以定性也可以定量，适于大量样品的检测。 随着流式细胞分析技术与方法的日臻完善和临床应用范围不断拓宽，几乎临床医学各学科都涉及到流式细胞分析技术的应用，已逐渐成为推动临床医学发展的重要手段,本文就流式细胞术在临床上的应用进展作一综述。 【关键词】流式细胞术;临床;进展 流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。 它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段[1]。 目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,发挥着重要作用。 本文就其在临床上的应用综述如下。 1 流式细胞术在免疫学中的应用� FCM可以进行淋巴细胞亚群分析,可同时检测出一种或几种淋巴细胞表面亚群分析,将不同的淋巴细胞亚群区分开来,并计算出它们相互间的比例。 通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定了解淋巴细胞的分化功能,鉴别新的淋巴细胞亚群。 更重要的是通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群或某些细胞表面标志的存在、缺乏、过度表达等,对一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植监测等有重要的临床意义。 如HIV主要侵袭CD4+T细胞而导致CD4淋巴细胞减少,CD4/CD8淋巴细胞比值下降,为艾滋病的诊断和治疗提供依据[2]。