《分子生物学》实验讲义
实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍
实验二质粒DNA分离纯化
实验三琼脂糖凝胶电泳
实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA
实验五限制酶切鉴定质粒DNA
实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍
一、实验目的
了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。
二、实验内容
1.分子生物学实验知识
⑴严格操作规程
分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。
⑵耐心细致操作
实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。
⑶习惯微量操作
在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。这些观念都是错误的。只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。
⑷防止实验污染
分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。
⑸正确处理试剂
分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。
⑹注意实验安全
分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。
2.分子生物学实验常用仪器介绍
⑴微量取液器
⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）
⑶离心机（低速、高速、超速）
⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）
⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）
⑹超净工作台
⑺PCR仪
⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）
⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）
⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）
3.分子生物学基本实验操作
⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）
⑵真核细胞mRNA的分离与纯化
⑶质粒DNA的提取
⑷PCR基因扩增实验
⑸限制性内切酶酶切实验
⑹DNA重组技术
⑺DNA转移技术
⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法
⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针
⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹
4.微量移液器的使用
可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：
⑴调节数字至所需体积；
⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；
⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；
⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；
⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；
⑹平稳按压打出液体。注意吸嘴一般要贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。
⑺按吸嘴弹射按钮除去吸嘴；
⑻将量程调至最大量程处。
常见的错误操作：
⑴吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。
⑵装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸(无需用力过猛，选择与移液器匹配的吸
头)。
⑶平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。
⑷用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。
⑸直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。
⑹使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器(应该参照正确清洗方法操作)。
三、作业
1. 谈一谈微量移液器的使用方法及注意事项。
实验二碱裂解法制备质粒DNA
一、实验目的
1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理与方法。
2.了解碱裂解法中各种试剂的作用。
二、实验原理
基于染色体DNA与质粒DNA之间变性与复性的差异而达到分离质粒DNA的目的，因为①染色体DNA分子量比质粒DNA大得多；②从细胞中提取到的染色体DNA大多断裂成线状分子,而质粒DNA却是共价闭合环状结构。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性，同时由于受到机械剪切力或核酸酶等的作用,染色体DNA 易被切成大小不同的片段；而闭环质粒DNA链氢键虽也断裂，但因其超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA又恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性而形成不溶性网状结构，与不稳定的大分子RNA、变性的蛋白质-SDS复合物以及细菌碎片等一起形成絮状沉淀而被除去。然后用无水乙醇沉淀质粒DNA，即可得到纯化的质粒DNA。
三、实验材料
1.生物材料
大肠杆菌JM109菌株；pCAGGS重组质粒，本实验所用重组质粒是在pCAGGS质粒的多克隆位点上选择Kpn I和Nhe I酶双切后插入了一个300bp的外源DNA片段。下图(图1)是质粒pCAGGS图谱。
图1. 质粒pCAGGS图谱
2.主要试剂
（1）用于细菌培养：LB固体培养基，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/mL）。（2）用于质粒DNA提取：
溶液P1(BufferP1)：使用前按照TIAN Red:溶液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。
溶液P2(BufferP2)：无色；
溶液P5(BufferP5)：无色；
漂洗液PWT(Buffer PWT)：使用前与无水乙醇混合；
洗脱缓冲液TB(Buffer TB)：可用双蒸水代替；
RNase A(10mg/ml)、TIAN Red：溶液P1在使用前先加入RNase A和TIANRed，置于2-8℃保存。
3.主要仪器
微量移液器，超净工作台，制冰机，高速离心机，冰箱等。
四、实验方法
1.培养细菌：将含有pCAGGS重组质粒的JM109菌株大肠杆菌涂布于加有氨苄青霉素（终
浓度为100μg/mL）的LB平板，37℃下静置培养12-16h；挑取单菌落于10mL含氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB液体培养基（50ml-三角瓶）中，37℃，220rpm培养过夜。
2.取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，12000g离心1min，用微量移液器弃尽上清。
【注意】①本实验中所使用的离心管和移液枪头必须经过灭菌处理。
②如果菌量过少，可再取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，重复操作一次。
【现象】离心管底部有少量白色沉淀，上部为澄清液体。
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细
菌沉淀。
【注意】操作相对剧烈，以彻底打匀沉淀或碎块。
【现象】溶液为均匀浑浊的红色
4.向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
【注意】温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA
【现象】澄清的紫色。若混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色。
5.向离心管中加入350μl溶液P5,立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将
出现絮状沉淀。
【注意】加入溶液P5后应立即混合，应快速上下颠倒混匀，避免产生局部沉淀。
【现象】溶液为澄清的黄色，如果在黄色中混有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。
6.12000 rpm (~13,400xg)离心2 min，将上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入
收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000 rpm离心30 sec, 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放入收集管中。
【注意】尽量不要吸到白色杂质，否则会影响质粒的纯度。
7.向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT (已加入无水乙醇)，12000 rpm离心30 sec,倒掉
收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
8.12000 rpm离心1 min, 倒掉收集管中的废液，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
9.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲
液或灭菌双蒸水，12000 rpm离心30 sec，将质粒溶液收集到离心管中。
五、结果与讨论
1.作为载体，质粒DNA上有哪些元件？
2.本实验中，溶液P1、溶液P2、溶液P5的作用分别是什么？
3.请分析出现下列现象的原因及解决办法：
①加入溶液P2后溶液并不澄清；
②加入溶液P5后溶液中仍然呈现紫色；
③加入溶液P5并离心后，上清中存在大量微小白色沉淀。
实验三琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。
二、实验原理
DNA分子在高于其等电点（pI）pH值的溶液中带负电荷，在直流电场中向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的迁移速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。凝胶中混入适量荧光染料（如溴化乙锭EB，或者GelRed），染料(EB)分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段在凝胶中的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。
琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的大小来确定，一般基因组DNA可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒DNA选择1.2％琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。
三、实验材料
1.材料：实验二所提取的质粒DNA；
2.试剂：0.5×TBE (或1×TAE)，6×上样缓冲液，溴化乙锭(简称EB，配制成10mg/ml, 用
铝箔或黑纸包裹容器,室温储存，有毒！不可徒手接触）或GelRed核酸染料，琼脂糖粉；
3.主要仪器：微量移液器，电泳槽，制胶板，电泳仪，凝胶成像系统。
四、实验方法
1.取制胶槽，洗净、晾干、安装好。
【注意】胶槽水平放置，向下压实，防止漏胶。器具会接触到EB，不可徒手操作！
2.灌胶：将100ml熔化的琼脂糖凝胶（1.2%）冷却至约65℃时，加10ul EB（或GelRed
核酸染料，此类荧光染料的使用说明书上常要求按1:10000比例添加）混匀，小心地将凝胶倒入胶槽上，控制灌胶速度，使胶均匀展开，直到整个制胶槽表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为3~5mm。将梳子插入到胶槽的定位槽中。
【注意】尽量避免凝胶中产生气泡；器具会接触到溴化乙锭，不可徒手操作！！！
3.室温下待凝胶凝固完全后，取出梳子，将胶放在电泳槽中，加入0.5×TBE(或1×TAE)
电泳缓冲液，液面高于凝胶面约1mm。
【注意】点样孔一端靠近负极；器具会接触到溴化乙锭，不可徒手操作！！！
4.加样将实验所得的质粒DNA作为电泳样品。将样品与上样缓冲液6：1混匀，用微
量加样器将样品分别加入胶板的样品小槽内，同时留一孔点入Marker。
【注意】加样时应防止加样器头碰坏或插穿凝胶孔。
5.加样完毕后，盖好电泳槽，接通电源，开始电泳。为防止样品扩散，在样品进胶前可
用略高电压。当样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm 。当染料条带移动到距离凝胶前沿1cm时，停止电泳。
【注意】通电后片刻检查通电情况。
6.观察小心取出凝胶，将凝胶放在凝胶成像系统中进行观察。
【注意】器具会接触到溴化乙锭，不可徒手操作！！！
7.结果分析：凝胶中DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。
五、结果与讨论
电泳检测实验中提取的质粒，绘出电泳图并作说明。
实验四聚合酶链反应(PCR) 技术体外扩增DNA
一、实验目的
1.熟悉PCR反应的基本原理；
2.掌握PCR反应的操作方法。
二、实验原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成位于两段已知序列（，引物）之间的DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在短时间之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。
PCR的基本条件：
⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）；
⑵引物；
⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
⑷Taq DNA聚合酶
PCR循环由三个步骤组成：
⑴变性使模板DNA解离成单链；
⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列两端结合；
⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
本实验中模板为pCAGGS重组质粒，以其插入的外源DNA片段（300bp）两端设计特异性引物进行PCR扩增，产物长度为300bp，以此鉴定重组质粒。
三、实验材料
1.材料
pCAGGS重组质粒，作为PCR扩增的模板。
2.试剂
⑴PCR mix试剂（含Taq酶、10×反应缓冲液、25mmol/L MgCl2、dNT。
⑵引物P1、P2（P1为上游引物F-PC01，P2为下游引物R-PC02）。
⑶GelRed核酸染料：此类荧光染料的使用说明书上常要求按1:10000比例添加；或溴化乙
啶染色液(EB)：10mg/ml（EB具致癌作用，使用时务必小心）。
⑷上样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
3.主要仪器
PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、凝胶成像系统等。
四、实验方法
1.PCR扩增
⑴20ul反应体系，按下表(表1)加入试剂，并小心混匀。另加入石蜡油20ul(根据实验需要
和个人操作习惯决定是否加入石蜡油)。
【注意】务必使DNA模板加入下层水相混匀，点离！！！
表1. PCR反应体系配制表(20uL)
试剂体积
ddH2O 8.4 ul
2×PCR mix 10ul
P1（10μM）0.3 ul
P2（10μM）0.3ul
DNA模板 1 ul
⑵设置PCR程序：
94℃，3min；
94℃（30s）→55℃（30s）→72℃（30s），30循环；
72℃，5min；
⑶运行PCR程序
2.PCR产物鉴定
反应结束后，取5ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
【注意】从下层水相取样。
五、结果与讨论
绘制PCR产物电泳示意图，标明各条带的分子量并对所测样品进行结果判定。
实验五DNA的限制性酶切反应
一、实验目的
1．掌握限制性核酸内切酶的特点。
2．掌握重组质粒的酶切鉴定原理，及酶切结果的分析方法。
二、实验原理
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基序列并在该序列内部或附近切割DNA的一类核酸水解酶。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。限制性内切酶在分子生物学研究中得到了广泛应用，是重组DNA的基础，DNA经限制酶切后产生的酶切图谱是常用的鉴定DNA序列的方法。本实验根据重组质粒的克隆位点，选用Kpn I和Nhe I 双酶切鉴定提取的质粒DNA，电泳后应该获得4.7kb和0.3kb 两个条带。
限制性内切酶消化中常见的问题和原因。
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘性末端退火。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。
三、实验材料
1.材料
实验一所提取的重组质粒pCAGGS。
2.试剂
限制酶Kpn I和Nhe I，无菌水，琼脂糖，电泳缓冲液。
3.主要仪器
微量移液器，恒温水浴锅，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统。
四、实验方法
1. 反应体系的建立：在无菌Eppendorf管中按如下表(表2)加入试剂，轻轻混匀，加入10ul石蜡油，点离。【注意】务必使DNA模板加入下层水相混匀，点离！！！
表2. 限制性酶切反应体系配制表(10uL)
试剂体积
无菌双蒸水 3.6 μl
10×酶切缓冲液1μl
Kpn I 0.2 μl
Nhe I 0.2 μl
质粒DNA 3 μl
总体积10 μl
2. 37℃水浴2h。
3. 将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。
4. 12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。
5. 取10μl消化产物，与2μl 6×上样缓冲液混匀，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，
电泳条件：约100V30～60min。
【注意】电泳从下层水相取样。
6．结果观察。
【操作注意事项】
1.吸样量一定要准确，并充分混匀
2.为了不使酶失活而导致浪费，最后才加酶
3.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。
4.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。
五、结果与讨论
绘制酶切产物电泳示意图，标明各条带分子量。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。 C6H i2O6（葡萄糖）T 2 C2H5OH（酒精）+2 CO2 f 在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。 目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混 合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。 【实验一】 一、酵母菌的分离与培养 一、【实验目的】 学习用选择性培养基分离酵母菌。 二、【实验原理】 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH值为4.5?6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜 地土及果皮等植物表面。 酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基 上用划线法分离纯化出酵母菌。 三、【实验仪器和材料】 1、实验材料：成熟葡萄 试剂：0.1%吕氏（Loeffier）美蓝染液 配制方法：A 液：美蓝（methylene blue, 又名甲烯蓝）0.3 g, 95%乙醇30 ml； B 液：0.0l% KOH l00ml 。 混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。 2、培养基：
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学课程教学讲义朱玉贤 第一讲序论 二、现代分子生物学中的主要里程碑 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。 从1847年Schleiden和Schwann提出\细胞学说\，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将\性状\与\基因\相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X 射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。 1910年，德国科学家Kossel第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。 1959年，美国科学家Uchoa第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过RNA 翻译成蛋白质的过程。同年，Kornberg实现了试管内细菌细胞中DNA的复制。 1962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型而与 Wilkins共获Noble生理医学奖，后者通过X射线衍射证实了Watson-Crick模型。1965年，法国科学家Jacob和Monod提出并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细胞代 谢的分子机制。此外，他们还首次推测存在一种与DNA序列相互补、能将它所编码的遗传信息带到蛋白质合成场所（细胞质）并翻译产生蛋白质的mRNA（信使核糖核酸）。1972年，Paul Berg（美）第一次进行了DNA重组。 1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次进行了DNA序列分析。 1988年，McClintock由于在50年代提出并发现了可移动遗传因子（jumping gene或称mobile 1
现代生物学实验（六）—遗传与分子生物学实验教案 课程名称: 遗传与分子生物学实验 英文名称: Experiment Genetic & Molecular Biology 课程编号:学科类通修课程 课程学时：108学时 课程学分：3学分 教师姓名:章军周涵韬杨玉荣…… 前导课程：遗传学、分子生物学、动物生物学、植物生物学、微生物学、生物化学教学方式:实验及技术理论讲授 考试方式:平时考核＋笔试＋实验操作考试 教学目标和要求： 本课程性质是一门研究生物遗传规律和分子生物学的实践课程，是生命科学相关专业的主干课。 本课程的学习目的与任务在于通过遗传学和分子生物学实验的学习和实践，使学生加深遗传学和分子生物学理论的认识，掌握基本实验方法和技术，了解分子生物学技术前沿和研究方法，初步具备运用所学知识分析问题和解决问题的能力。 通过本实验的学习和实践，学生掌握遗传学和分子生物学的基本原理和实验方法，加强解决生物学问题的能力训练，达到本科教育水平，为继续深造打好基础。 主要内容： 要求学生掌握遗传学与分子生物学实验的基本原理和基本知识，认识现代遗传学的发展历史，掌握遗传学与分子生物学的基本研究技术的方法和原理。在教学中安排了2个综合性和设计性的开放实验，还充分利用录象、课件或多媒体做一些模拟实验。目的是培养学生的独立操作和综合分析实验能力，以提高学生科研素质。 本课程分三个模块化实验教学，主要知识点包括： 模块一：经典遗传学研究方法，包含3次实验课和一个果蝇诱变开放性实验 1.果蝇的饲养和观察 2.果蝇的诱变方法及遗传分析 3.细菌转导 4.转座子引起的插入突变 模块二：真核生物分子生物学研究方法，包含3次实验课和一个植物RAPD鉴定开放性实验 1.真核细胞基因组提取 2.DNA纯化及鉴定 3.PCR技术 4.植物染色体提取及RAPD鉴定
课程教学大纲 课程名称（中文）：分子生物学课程名称（英文）：Molecular Biology 课程编码：0102122 开课学期：5（生物技术和生物科学专业）、6（动物科学专业） 学时数、学分数：64，3.5 适用专业：生物技术、生物科学和动物科学 先修课程:植（动）物学、微生物学、遗传学和生物化学、植（动）物生理学、细胞生物学 后续课程：发酵工程、细胞工程原理、基因工程原理与应用、发育生物学、生物统计与试验设计、生物技术综合实习、生物技术大实验、基因组学、 生物信息学 一、教学目的与任务 分子生物学是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。近年来，分子生物学成为现代生物学领域里最具活力和发展最为迅速的科学，也是当代生物学研究的三大主题之一。因此是生物类本科生必修的专业基础课程。该课程将重点介绍DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的基本结构和功能，分子生物学的基本研究方法、基因的表达与调控，转基因植物等方面的内容，并结合在分子生物学领域的最新研究成果，讲述分子生物学的发展对生命科学领域的影响。通过本课程的学习，使学生了解和掌握分子生物学的基本理论和实验操作，使他们从分子水平上认识生命的本质。
本课程把发展学生“独立学习、独立思考、独立判断和独立工作”的能力放在首位，努力调动学生的兴趣和积极性，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习打下坚实的基础，为毕业后参与科学研究或知识传播积累财富。 通过分子生物学课程的学习，达到如下目标： 1、掌握分子生物学的基础知识和基本理论。 2、掌握分子生物学的基本研究手段和实验方法。 3、了解分子生物学的最新研究进展和动态。 4、能够灵活运用分子生物学的基本理论知识和实验方法，综合其他学科的相关知识，对整个生命科学有一个更新的认识，并能应用于实践。 本课程总学时64，其中理论课48学时，实验课16学时。 二、教学内容与基本要求 通过本课程的学习，要求学生掌握分子生物学的基本理论，熟悉分子生物学的研究方法、原理与仪器设备，同时要求学生利用图书馆现有的期刊杂志，了解本学科的发展和研究动态。 第一章绪论 主要介绍分子生物学定义、研究内容和发展简史及未来发展方向等（了解）。 第二章染色体与DNA核酸（DNA和RNA） 概述；真核细胞染色体的组成；染色体特征；真核生物基因组的结构特点；原核生物基因组的特点 (了解) DNA的一级结构；DNA的二级结构；DNA的三级结构 (掌握) DNA的半保留复制机理；复制的起点、方向和速度；复制的几种主要方式(掌握)
硕士研究生分子生物学实验讲义
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分子生物学实验讲义 (硕士研究生试用) 山西医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学实验室 2010.6
实验一动物组织蛋白质的提取 【目的要求】 1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。 2.了解动物组织蛋白质提取的原理。 【实验原理】 由于蛋白质种类很多,性质上的差异很大，即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。?【试剂器材】 1．实验小鼠 2．0．9%NaCｌ 3．动物组织蛋白裂解缓冲液 Trｉs 5０mＭ ＮaCl 15０mＭ EＤTA 0.５mM DTT1mM Triｔｏn X－100 1% 去氧胆酸钠0.5% SDS０.1% 4．ＰMSF/异丙醇储备液10０ｍM（１74mg/１0ml)于-20℃储存 5．-2０℃储存的冰块 【操作步骤】 1.颈椎脱臼处死小鼠,75%酒精擦拭皮肤,剪开腹部,剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含 预冷0.9%NaＣl(6ｍL）的平皿中。 2.在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。 3.在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液(20μL/2mL)。 4.迅速将2mＬ预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。 5.将组织研磨液转移到１.5mL的离心管中，于4℃离心（1 4000rpm，１0mｉn）。 6.离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ｍｌ离心管中,即为组织蛋白粗提取液。
（生物科技行业）分子生物 学实验指导
分子生物学实验指导 动植物检疫专业 2012，2 分子生物学实验注意事项 1．课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。 2．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，壹定要做好统筹安排。3．实验课中的所有单项实验都属于壹个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，壹切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。 4．实验的每壹步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！ 5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。 6．写作实验报告或实验论文壹定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。7．在实验室内不能大声喧哗。 8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面壹角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。 9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐且清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。 10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。 11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。 实验壹质粒DNA的提取 1．目的 学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。 2．原理 根据共价闭合环状质粒DNA和线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0 12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但俩条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在壹起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA壹起沉淀下去。 3．器材 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
研究生分子生物学实验讲义 分子生物学实验讲义 硕士研究生试用教材(第三版) 南方医科大学生物化学与分子生物学教研室 二OO六年五月 分 子 生 物 学 实验讲义 硕士研究生试用教材（第三版） 编写人员 (按姓氏笔画排列) 冯春琼朱利娜吴清华宋艳斌张兴梅李凌肖应庆肖维威姜立胡子有郭秋野彭翼飞 南方医科大学生物化学与分子生物学教研室
二OO六年五月 1 前言 分子生物学是二十世纪末发展最快的生命科学，其理论与技术的进步，不仅加速了自 身体系的更新，同时也带动了医学科学的变革。随着科技的日新月异，分子生物学的研究 手段也得到相应发展，PCR技术、克隆技术、基因芯片技术等的涌现，使得分子生物学溶 入到生命科学的各个领域，并发挥着巨大作用。分子生物学是实践性非常强的一门课程， 众多的理论知识必须在实验中进行验证，才能深刻地理解与应用。 开设分子生物学实验选修课程，是医学院校研究生层次人才培养的必要组成。为适应 新形式下研究生教学的需要，我们在完善实验室仪器配置标准化的同时，安排了以基因重 组体的构建为主线的一系列实验内容，旨在让研究生掌握分子生物学基本技术操作的同时，并能有严谨的实验思路，具备一定的分子生物学科研思维，避免在课题设计上出现不必要 的误差。 此次编写的讲义，必然会有欠缺与不足，我们会在今后的工作中不断修正与补充。希 望大家对本门课程提出宝贵意见，以帮助我们更好的开展分子生物学实验的教学工作。 生物化学与分子生物学教研室 二OO六年五月 2 目录 第一章 基因克隆载体的制备 (1) 实验一：质粒DNA的抽提与纯化……………………………… 1 实验二：质粒DNA的 鉴定 (6) 第二章 目的基因的获取 (8) 实验三：基因的PCR技术…………………………………………8 实验四：DNA限制性 酶切技术……………………………………10 实验五：酶切产物的鉴
（生物科技行业）分子生物学试题及答案(整理版)
分子生物学试题及答案 壹、名词解释 1．cDNA和cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋和β－折叠通过各种连接多肽能够组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都能够用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP和CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein） 4．回文序列：DNA片段上的壹段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，和mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。9．弱化子：在操纵区和结构基因之间的壹段能够终止转录作用的核苷酸序列。 10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生壹个应急反应，停止全部基因的表达。产生这壹应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp和pppGpp的作用不只是壹个或几个操纵子，而是影响壹大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到壹种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA及增强子，弱化子等。 12．DNA探针：是带有标记的壹段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。
《分子生物学》实验讲义 实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍 实验二质粒DNA分离纯化 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA 实验五限制酶切鉴定质粒DNA 实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍 一、实验目的 了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。 二、实验内容 1.分子生物学实验知识 ⑴严格操作规程 分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。 ⑵耐心细致操作 实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。 ⑶习惯微量操作 在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。这些观念都是错误的。只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。 ⑷防止实验污染 分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。 ⑸正确处理试剂 分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。 ⑹注意实验安全 分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。 2.分子生物学实验常用仪器介绍 ⑴微量取液器 ⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置） ⑶离心机（低速、高速、超速） ⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽） ⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）
分子生物学名词解释 63349
精品资料 Z-DNA：左手螺旋的双螺旋DNA，其糖-磷酸骨架呈Z字形，可能与基因转录调控有关。 超螺旋：DNA双螺旋自身盘绕而成的空间结构。功能：超螺旋DNA具有更为致密的结构，可以将很长的DNA分子压缩到染色体中，对DNA的稳定性具有十分重要的意义。 拓扑异构酶：能够改变DNA连接数从而改变DNA分子超螺旋水平的酶具有限制性内切酶和连接酶的作用。分为I型拓扑异构酶和II型拓扑异构酶。 卫星DNA：真核生物基因组中由许多短的基本重复单位构成的连续重复的一种高度重复序列。 核小体：由2000bp的DNA和组蛋白组成的染色体的基本结构单位。 端粒（Telomere）：是真核生物染色体末端的起保护作用的一种特殊结构。具有保持染色体稳定性的功能。 功能性的异染色质（兼性异染色质）：是指在某些特定的细胞中或在一定的发育时期和生理条件下凝聚，由常染色质转变而来的异染色质，如X染色体，巴氏小体，是真核生物基因表达调控的一种途径。 基因：产生一条多肽链或功能性RNA所必须的全部核苷酸序列。 UTR：非翻译区，指位于mRNA5’端或3’端的编码区以外的序列。 断裂基因：指基因内部被一个或更多不编码顺序所隔裂。 基因组：是指细胞或生物体单倍体染色体上的所有遗传物质的总称（包括所有遗传物质）。 重叠基因：一个基因的部分序列位于另一个基因的序列内（同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息）。 表观遗传：是指DNA序列没有发生变化的情况下，基因表达的可遗传的改变。 Klenow片段：DNA聚合酶I可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为68000，有聚合酶活性，并有3’→5’核酸外切酶活性。 端粒酶：是自身携带RNA模版的逆转录酶。 引物：指的是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起点，存在于自然中生物的DNA复制（RNA引物）和聚合酶链式反应（PCR）中人工合成的引物（通常为DNA引物）。 反转座子:通过RNA为中介，反转录为DNA后进行转座的可移动元件（DNA-RNA-DNA-插入新位点）。 C值矛盾:生物基因组的大小同生物在进化上所处地位的高低无关，与真核生物基因组的特点有关。 退火:指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模版互补区域结合形成杂交链。 DNA变性:是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。 前导链:以5’-3’方向连续合成的DNA链。 滞后链:总体上沿3’-5’方向延伸，但以小片断形式（5’-3’）不连续合成，最后共价连接起来。 复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使复制进行的部位。 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
分子生物学实验技术教学大纲 课程名称：分子生物学实验技术课程编码： 04310107 英文名称：Molecular biology experiment 学时：36 学分：1.5 适用专业：生物技术、生物工程课程类别：必修 课程性质：专业基础课 先修课程：《无机及分析化学》、《普通生物学》、《细胞生物学》、《生物化学》等 教材：分子生物学实验技术自编讲义 一、制定本大纲的依据 本实验课程是专为食品科学与生物工程学院生物技术专业开设的一门专业实验技术课，本实验课在本专业人才培养中起着及其重要的地位和作用，它是培养学生今后从事教学科研及技术开发工作最重要的教学实验环节之一，本课程具有知识面宽、实验性强、精密仪器使用多之特点，其目的是使本科生在参加工作和进入攻读硕士之前，对已学课程尤其是现代实验技术手段从理论上有更深的理解，对染色体DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测DNA、质粒DNA的提取和酶切、PCR基因扩增、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化和DNA重组等方面以及大型精密仪器的操作使用有进一步了解和掌握，提高学生的动手能力，为其今后从事教学、科研工作打下坚实的理论基础和实际操作能力。 针对学生的培养方向，本课程以培养学生掌握生物技术与分子生物学研究的基础实验技能为主要目标，力图最大限度地利用我校现有的实验条件，使学生通过本课程的学习和实践，接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段。通过有限的实验室实践，涵盖分子生物学各个方面的实验内容，以点带面，突出重点，促进学生对分子生物学课程学习内容的理解和掌握。 二、本实验课程的具体安排 实验项目的设置及学时分配
三、本实验课在该课程体系中的地位与作用 《分子生物学》是新兴的学科，无论对基础理论研究，还是生产实践都将产生巨大的影响。《分子生物学实验技术》是这门学科的重要基础，是一门实践性很强的实验课程。掌握和应用分子生物学实验技能，是学好这一课程的必要条件。 该课程不仅是《分子生物学》教学重要的组成部分，而且在培养学生分析和解决问题的能力，严谨的科学态度和独立工作的能力方面，有着不可替代的作用。 四、学生应达到的实验能力与标准 《分子生物学实验技术》课程的设立为系统培养学生在分子生物学领域基本技术和技能，通过学生的独立实验设计和实践，培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。 本课程实验技术原理采取以学生自习为主，课堂进行提要式的提示讲解和必要的答疑的方式，使学生掌握实验方法的基本原理和应用范围。本课程强调实验技能训练的重要性，主要课时安排学生实验，以便尽量提高学时利用率。为了节省基础设施投资，提高仪器利用率，本课程采取开放式集中实验的方式，要求学生在实施实验之前，必须做好预习准备，拟好实验方案，经任课教师认可后，方可进入实验室做实验。课堂讲授与实验课的比例为１：10。 在课程成绩评定上，强调平时和考试并重，基础理论和实验技能相结合的综合评定方式。 五、讲授实验的基本理论与实验技术知识： 实验一：植物染色体DNA的提取和纯度鉴定 基本内容：采用SDS裂解细胞膜，使脱氧核糖核蛋白复合物（DNP）解聚，并用苯酚抽提法去除蛋白，从而提取染色体DNA。并对其纯度进行鉴定 基本要求：掌握提取真核细胞染色体DNA的一种基本方法，学习使用紫外线分光法评估DNA的
第1章绪论 1. 1 分子生物学的含义 分子生物学是研究核酸，蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征以及重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础科学。 当人们认识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然界的一部分，而以生物大分子为研究对象的分子生物学就迅速地成为现代生物学领域里最具活力的科学。从广义上讲，蛋白质、核酸等生物大分子结构和功能研究都属于分子生物学的范畴。例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白的结构、功能和跨膜运输等都属于分子生物学的研究内容。不过目前人们通常采用狭义的概念，将分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因的复制、表达和调节控制的过程。当然，其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶结构和功能的研究。 1.2 分子生物学发展简史 早在1871年Miescher就从脓细胞中分离出了脱氧核糖核酸（DNA），但当时并不认为它是生物体的遗传物质。直到1944年，Avery等人才通过肺炎链球菌的转化实验证实了DNA是生物体的遗传及变异的物质。在1949年查盖夫（Chargaff）测定出了DNA的碱基组成，并确定了DNA 的碱基配对规律，与此同时威尔金斯（Wilkins）及弗兰金（Frankin，1950—1952）用X—射线衍射技术测定了DNA纤维结构，指出DNA是一种螺旋结构。在此基础上Watson和Crick于1953年提出了DNA的双螺旋结构模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。为此他们和Wilkins于1962年共同获得了诺贝尔生理医学奖。DNA双螺旋结构模型理论奠定了分子生物学发展的基础。 DNA双螺旋模型已经预示出了DNA的复制规则。科恩伯格（Kornberg）在1956年首先在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了DNA的合成，并从大肠杆菌中分离出了DNA聚合酶Ⅰ，并证明DNA的合成需要一个模板DNA。奥乔尔（Uchoa）发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功的合成了RNA，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg 共享1959年的诺贝尔生理医学奖 1965年，法国科学家Jacob和Monod由于提出并证实了“操纵子学说”而获得了诺贝尔生理医学奖。Jacob和Monod还首次提出存在一种与染色体DNA序列相互补，能将染色体DNA上的遗传信息带到蛋白质合成场所并翻译成蛋白质的核糖核酸，即mRNA分子。他们这一学说对分子生物学的发展起了极其重要的指导作用。 Crick在1954年就提出了遗传信息的传递规律，称为“中心法则”，但RNA如何翻译成蛋白质的问题没有解决。直到1961年Yanofsky和Brener提出了三联密码的设想，后来经过尼伦伯格（Nirenberg）和马夏（Matthai）的努力，终于于1963年破译了遗传密码。霍利（Holly）阐明了
《分子生物学》教学大纲 总学时：90学时，讲授：72学时，实习：18学时 适用专业：生物技术及应用专业 一、课程的性质及任务 《分子生物学》是我院应用生物技术专业一门重要的专业必修课。分子生物学是一门近年来发展迅速并且在生命科学领域里应用越来越广泛、影响越来越深远的一个学科。从学科角度来讲，分子生物学函盖面非常广，与生物化学和细胞生物学等生命科学主干课程有一些交叉。为了避免重复，本课程主要从生物大分子的水平来阐述遗传信息的传递（DNA复制和突变修复等），及基因表达（DNA到RNA到蛋白质）这两个重要的生命过程；将突出生物大分子结构与功能的关系及其如何操作这两个重要的生命过程。通过与实践教学相结合，系统地介绍与基因克隆相关的DNA技术，使学生们掌握一些基本的分子生物学技术。 二、课程的基本要求 设置本课程目的是让学生比较全面、系统地学习分子生物学基本理论、基础知识和基本操作技术，了解和认识分子生物学研究及发展方向，为今后进一步学习和从事本专业相关工作奠定基础。教学上要求：1.授课内容逻辑清晰、主次分明；2.语言简明、易懂、生动；3.幻灯等多媒体制作精细；4.讲课态度认真、负责，让学生听明白，领会。教学方法：多媒体教学，多途径考核（平时小考、作业、课堂讨论和期末考试等结合）。 三、教学内容 第一章绪论 目的要求：了解和学习分子生物学概况，为进一步学习本课程后续内容做铺垫。 重点、难点：分子生物学的研究内容、分子生物学发展前景。 教学内容：分子生物学发展简史、人类基因组计划简介、分子生物学的研究内容、分子生物学发展前景。
第二章分子生物学技术 目的要求：介绍核酸的提取和纯化、凝胶电泳技术、PCR技术、核酸分子杂交技术等。 重点、难点：核酸的提取和纯化、凝胶电泳技术、PCR技术、核酸分子杂交技术、蛋白质分析技术。 教学内容：核酸的提取和纯化、凝胶电泳技术、DNA序列测定、PCR技术、核酸分子杂交技术、蛋白质分析技术、基因克隆技术。 第三章 DNA的结构与性质 目的要求：介绍核酸的一些基本性质，为了解遗传信息遗传、基因表达与调 控和掌握DNA技术做铺垫。 重点、难点：DNA结构、DNA的光谱和热性质、RNA结构、基因组的复杂性、DNA 超螺旋。 教学内容：DNA结构、DNA的化学和物理性质、DNA的光谱和热性质、染色体、RNA结构、DNA 超螺旋。 第四章 DNA复制 目的要求：使学生掌握DNA复制的基本概念和机制，为学生理解和掌握DNA技术打下基础 重点、难点：DNA聚合酶、细菌DNA复制、真核DNA复制、DNA复制的调控。 教学内容：DNA复制概览、细菌DNA复制、真核DNA复制、DNA复制的调控。第五章 DNA损伤与修复 目的要求：使学生了解和掌握DNA损伤的原因、类型和修复机制。 重点、难点：DNA损伤、DNA修复。 教学内容：DNA突变、DNA损伤、DNA修复、基因重组 第六章 RNA的转录与加工 目的要求：使学生掌握转录的基本概念、真核转录的三种主要RNA聚合酶和 原核转录的主要参与者（RNA聚合酶和启动子）以及原核转录的过程（起始、延伸和终止），使学生了解不同前体RNA的加工机制。 重点、难点：真核转录的三种RNA聚合酶基本特征和功能、大肠杆菌RNA聚合酶、大肠杆菌s70启动子，原核转录的起始、延伸和终止、真核转录后的加工 机制、选择性剪切。
肿瘤分子生物学 第一节概述 一、肿瘤与肿瘤分子生物学概念 肿瘤（tumor）是一类疾病总称，它们基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。 良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大体积，但仍保留正常细胞某些特性，通常在瘤体外有完整包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害，不引起或很少引起宿主损伤。不过有极少数良性肿瘤因其靠近生命中枢或能合成大量生物活性物质也可能杀伤宿主。例如，脑膜上生长缓慢良性肿瘤通过压迫使得生命中枢萎缩破坏，最终导致宿主死亡；胰岛细胞良性肿瘤可以分泌大量胰岛素而引起体内胰岛素过量，导致低血糖和死亡。 恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤最重要特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。由于技术水平限制，目前临床诊断癌症患者多处于中晚期。加上不良生活方式如吸烟、过度饮酒、不合理饮食习惯，以与环境污染增加等因素，在刚过去20世纪，世界各国许多常见癌症发病率在总体上呈上升趋势，或维持在高水平，在我国情况亦大致如此。目前除几种较少见癌症如妇科宫颈癌、绒癌等死亡率有明显下降外，多数常见恶性肿瘤死亡率还处于令人忧心高位态势
下。有研究者预测，在21世纪癌症仍将是危害人类健康主要疾病之一，故应引起预防、临床和基础研究者高度关注。 恶性肿瘤几乎在所有类型细胞中均可发生。根据组织学来源，癌症起源可分为三种：癌（carcinoma）起源于上皮细胞，大部分成人癌症属此类；淋巴瘤起源于脾和淋巴结等淋巴细胞；肉瘤（sarcoma）起源于间叶组织如结缔组织、骨和肌肉等。以上在各种实质性组织、脏器中发生癌症属实体肿瘤（solid tumor）。白血病起源于骨髓造血细胞，恶性细胞存在于流动血液中，属液体肿瘤（liquid tumor）。 肿瘤分子生物学，就是用分子生物学理论和技术来研究肿瘤一门科学，是医学和生物学一门交叉学科 二、肿瘤生物学特征 1、癌症是体细胞遗传病 就本质而论，癌症是一种遗传学疾病或体细胞遗传学疾病，可简称为遗传病。在癌细胞中发生遗传学变异有：基因内碱基替代、缺失、插入和基因扩增等，以与染色体数量和结构改变，如非整倍体、易位等；表遗传学改变有：DNA甲基化型式改变、组蛋白修饰和染色质改型等。这些改变引起了肿瘤抑制基因灭活和原癌基因活化，它们所产生恶性表型通过有丝分裂能在细胞世代间传递。上述过程均发生在体细胞，这是占全部癌症中绝大多数、散发性癌症发生模式。遗传性癌综合征不同于其他一些遗传病，它遗传仅是癌易感性，还需要体细胞多次击中才能产生恶性表型。 基因组内存在两类癌相关基因：一类基因直接调控细胞增殖与凋亡、
分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。
2020年（生物科技行业）第八章分子生物学常用技术的原理 及其应用及人类基因组学 （生物科技行业）第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学 第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学 测试题 壹、名词解释 1．分子杂交 2．Southernblotting 3．Northernblotting 4．Westernblotting 5．dotblotting 6．DNA芯片技术 7．PCR 8．功能性克隆 9．转基因技术 二、填空题 1．Southernblotting用于研究、Northernblotting用于研究，Westernblotting用于研究。 2．PCR的基本反应步骤包括、和三步。 3.在PCR反应体系中，除了DNA模板外，仍需加入、、和。 4．Sange法测序的基本步骤包括、、和。 5．目前克隆致病相关基因的主要策略有、、。 6．血友病第Ⅷ因子基因的首次克隆成功所采用的克隆策略是，而DMD致病基因的克隆所采用的克隆策略是。 三、选择题 A型题 1.经电泳分离后将RNA转移到硝酸纤维素(NC)膜上的技术是： A．SouthernblottingB．Northernblotting
C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 2.不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Dotblotting E．insituhybridization 3.经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB.Northernblotting C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 4.经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Easternblotting E．insituhybridization 5.PCR的特点不包括 A．时间短，只需数小时B．扩增产物量大 C.只需微量模板D．用途非常广泛 E.底物必须标记 6．用于PCR的DNA聚合酶必须 A．耐热B．耐高压C.耐酸D．耐碱E.耐低温 7．PCR反应过程中，模板DNA变性所需温度壹般是A．95?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 8．PCR反应过程中，退火温度壹般是 A．72?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 9.PCR反应过程中，引物延伸所需温度壹般是 A．95?CB.82?CC．72?CD．62?CE．55?C 10．PCR反应体系不包括 A.模板DNAB．TaqDNA聚合酶 C.上、下游特异性引物A、BD．ddNTP E．含Mg2+的缓冲液