RNA干扰
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程
1.作用机制
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，
其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。
怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。
研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。
RNA干扰现象的机理[8]
RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA 复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解[9][10]。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分
子是引起RNA干扰现象的直接原因[11][12]。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。
在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片段，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应[13]。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。
迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2（AGO2）的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶（RNA helicase）也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1]，这是一种RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase），植物中也存在该蛋白同系物。RNAi 中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA（或siRNA）作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。
2.特点
（1）RNAi具有的特征
①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；
②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；
③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；
④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；
⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp 左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；
⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。（2）特点详述
1.高效性：Elbashir等在研究中发现分别为25 nmol/L与100 nmol/L的起始双链RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低到1.5 nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05 nmol/L 时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1～100 nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。需要ATP：Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双
链RNA被 Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。
⒉特异性：Elbashir等和Brummel kamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。
⒊位置效应：Holen等根据人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和 hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA 被沉默效果较好。
⒋竞争效应：Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L
的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。
⒌可传播性：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA 转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。
3.制备方法
（1）化学合成
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。
（2）体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
用RNase Ⅲ消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”
就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗
（3）体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可
以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
siRNA表达框架
siRNA表达框架（siRNA expression cassettes，SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol Ⅲ启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol Ⅲ终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR 两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
4.RNA干扰主体实验
siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。
RNA干扰主体实验的重点在于：
（1）成功将siRNA表达载体导入目的细胞
如果目的细胞的质粒转染效率较低（低于70%），则应采用腺病毒或慢病毒载体，利用病毒载体的高感染率、高表达特性，更好地开展RNA干扰主体实验。
（2）设置好分组和对照
按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：
⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
⒉nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
⒊positive siRNA对照（监控假阴性）；
⒋技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
⒌rescue 对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；6.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。
实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，1,2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。4,5两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选5，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”，
（3）RNA干扰效率的检测（体外）
一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR；蛋白质水平：Western-blot、ELISA、免疫组化；细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证（体内）动物模型实验可以采取“体内法”和“体外法”。
体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测RNA干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。
体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测RNA干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低，所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。
5.RNA干扰回复实验
RNA干扰回复实验，主要是为了说明Off-target效应。
（1）Off-target效应
Off-target effects（脱靶效应）最早由Dharmacon科学家Jackson和他的同事们提出（Fedorov,Y.,et al. "Off-targeting By siRNA Can Induce Toxic Phenotype." RNA Accepted (2006).）他们给细胞转染特定基因的单条siRNA
后运用全基因组芯片检测技术鉴定表达上调/下调1.5到3倍的靶基因数量。研究人员发现在这种情况下有大量的基因被非特异性的调控着。siRNA正义链和反义链与脱靶基因的互补水平有高有低，并且每条siRNA所引发的脱靶基因表达谱也不尽相同，反映了序列依靠性的脱靶效应。
简单来说，Off-target效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径，通过microRNA途径，其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用，而如果进入microRNA途径，只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果，这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶。
（2）原理
如果脱靶干扰的部分基因，正好与目的基因位于同一信号通路中，或者与目的基因的生物学功能相似，那么，如果因脱靶而干扰了其它基因，亦会造成和目的基因受到干扰后相同的细胞表型改变。而实际上，可能选择的这条shRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰，或者虽然干扰了目的基因，但是并不会引起预期的细胞表型改变。
基于以上原因，自从Off-target效应被发现并被研究者们广泛认同后，越来越多的杂志要求研究者们在投稿时需要有相应的对照来说明Off-target效应。即您需要有相关对照或者实验来说明，您所获得的实验结果，不是由于Off-target 效应而产生的。
6.应用
RNAi在探索基因功能中的应用
人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA 表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。
RNAi在基因治疗领域中的应用
RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HⅣ-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
RNAi在整形外科领域的应用前景
已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的
BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。
研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。
瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βⅡ型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和Ⅲ型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。
病毒性疾病的治疗
加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HⅣ-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞，而不影响另一种HⅣ-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HⅣ-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA 已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS）的防治研究中，RNAi 也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。
遗传性疾病的治疗
美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi
同脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。
肿瘤病的治疗
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA 分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞，却不能有效的靶向肿瘤细胞，因此，在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡，实现靶向肿瘤细胞同样也是以 RNA 干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。已有很多针对不同基因的RNA干扰在体内和体外有效的抑制了肿瘤细胞的生长，这些目的基因包括：B c l-2 、survivin、EGFR、VEGF 等。RNA 干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，R NA 干扰技术设计
更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。[2]
在植物学中的应用
Napoli等将1个查尔酮合成酶基因（chs）置于1个强启动子后导人矮牵牛（Petunia hybrida），试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制
（co-suppression）。类似的结果同样在真菌脉胞菌(Neurospora crassa）中和其它转基因植物中存在。对于部分转基因植物来说，基因沉默可能是因为特异基因的甲基化而导致，这被称为转录水平基因沉默。但确实部分植物中的基因沉默是在转录后发生的，这被称为转录后基因沉默。实验表明在发生PTGS的个体中同源转录确实存在，但是很快在胞浆中被降解，没有积聚。Palauqui等进一步证实，在植物中将出现转基因沉默的植株嫁接到另一没有基因沉默的转基因植株中同样可以导致PTGS，但对非转基因植株却无效。Cogoni等证实PTGS由一种可扩散的反式作用分子所介导。
7.相关知识
Argonaute (AGO）：一类庞大的蛋白质家族，是组成RISCs复合物的
主要成员。AGO蛋白质主要包含两个结构域：PAZ和PIWI两个结构域，但具体功能尚不清楚。的研究表明，PAZ结构
域结合到siRNA 的3’的二核苷酸突出端；一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。PAZ和PIWI两个结构域，对于siRNA和目标mRNA相互作用，从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程，是必不可少的。同时，不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。例如，在人当中，AGO2“筹划”了RISCs 对于目标mRNA的切割过程；而AGO1 和AGO3则不具备这个功能。
Core RISC：是介导目标mRNA切割过程或者翻译抑制的最小的RNA-蛋白质复合物。在人和果蝇身上发现的分子量少于200kDa的RISCs可能就是core RISC的重要代表。AGO蛋白质和Core RISC密切相关。
Dicer (DCR）：是RNAase Ⅲ家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs 和miRNA。Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。
Holo RISC：是在果蝇中发现的有着RISC活性的最大的RNA-蛋白质复合物（80S）。Holo RISC的生物学活性牵涉到几乎所有的RISC的成员，RLC成员，和一些其他通路上的蛋白质分子。Holo RISC的存在，表明了RISC组装不是孤立的，同时还是一个有序的过程。以RISC为中心的RNAi和miRNA通路与一些其他的通路密切联系，很可能借此调控生物体的生长发育过程。Microprocessor：一种核内的复合物，主要由Drosha和Pasha两者组成，在miRNA 的生物合成中促使原始的miRNA成为miRNA前体。
MicroRNA (miRNA）：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。RISC loading complex (RLC）：是一种促使RISC形成的复合物。RLC有方向性地调节小RNA双螺旋，为以后的RISC组装作好铺垫。siRISC loading complexes
（siRLCs）在果蝇中研究最多。有研究者认为在果蝇中的siRLCs包含DCR2-R2D2异型二聚体和siRNA双螺旋；R2D2部分是非对称性的感受器，为RISC组装调整好siRNA的方向。miRISC loading complexes （miRISCs）的研究尚未报导，因为它的过程更为复杂，而且体外研究miRLCs的方法还没有建立。
RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing (RITS）：是一种组织染色质变型的复合物。RITS复合物也包含Dicer加工形成的siRNA 和AGO蛋白质，通过结合到异染色质的基因池上来促使异染色质上基因的沉默。RNA-induced silencing complex (RISC）：一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SiRNA组装siRISC，miRNA组装miRISC。RISCs（无论siRISC还是miRISC）包括两种类型：切割型和不切割型。研究表明，RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。
Slicer：在切割型RISC中的内切酶的另外一种表述方法。
Small interfering RNA (siRNA）：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC 的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。
8.c-elegans几种RNA干扰的方法
RNAi是一种基因knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA 通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，他们就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。RNAi 引起的表型在秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans) 中只能遗传2~3 代。
注入线虫细胞中的dsRNA 大部分能够在细胞间进行传递, 使得dsRNA 能够传给下一代并表现出RNAi 性状。
dsRNA导入线虫体内引起基因沉默的方式有：（1）微注射dsRNA入成虫的生殖腺、体腔；（2）线虫喜食大肠杆菌，喂食其质粒含dsRNA的大肠杆菌；（3）将虫卵浸泡于dsRNA溶液中等
（1）微注射法
最初的RNA干扰试验都是使用微注射法，通过注射dsRNA到生长状况较好的成体双性线虫的生殖器官然后检查它后代的表型，有些表型也可以再这个被注射的线虫身上表现出来。微注射法也可以注射到其他器官如假体腔或肠中。
优缺点：微注射法对研究胚胎的功能基因十分有效，但对于随后发展的浸泡法和饲喂法来说，在基因表达方面效率较差。并且，微注射法不适合需要大量动物的实验；对高通量的RNA干扰分析也不适合，因为也需要大量的动物进行注射。
（tedious）同时因为对幼虫进行微注射比较困难，这些研究用微注射法也很难进行。
（2）浸泡法
为了更有效进行RNA干扰，可以把线虫浸泡在dsRNA溶液中，这适合线虫发育的任何阶段，更有利于研究不同生长阶段的基因功能。
优缺点：相对于微注射法，浸泡法减少了劳动的强度，也不需要一些进行注射所需要的特殊的仪器设备。同时，若干组实验可以同时进行，dsRNA合成以及线虫的浸泡都可以在96孔平板中进行。
（3）饲喂法
线虫的实验室培养常用NGM培养基，其上层均匀的生长一层E.coli菌苔，作为线虫的食物。利用E.coli表达产生的dsRNA产生RNA干扰的饲喂法，可以应用于线虫发育的任何一个阶段，并且效应可以达到几代以后。此法比较容易进行，并且可以使成千上万的线虫同时进行实验，可以对多种基因进行高通量形式的检测。
优缺点：相对于其他两种方法，虽然饲喂法获得的产生遗传表型的线虫数量相近，
但由于在饲喂法中，亲代和子代都持续的接受dsRNA的影响，而在其他两种方法中，只有亲代受到dsRNA，所以饲喂法获得的表型形式更加多样化。
RNA干扰作用原理及其应用 【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III 启动子 【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded
RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug. 【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced silencing complex(RISC) Argonaute pol III 1 背景 20 多年前，在对矮牵牛进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这
RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法 RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi 具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)[2,3]。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。 1.RNAi的作用机制 目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。 1.1起始阶段 外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)，在细胞内特异性与RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt 长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。 1.2效应阶段 双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在A TP供能情况下，激活的RISC 将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默[1]。 1.3 倍增阶段 siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果[4]。2.RNAi的设计及合成
RNA干扰实验 一、磷酸钙转染法 【实验原理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。【仪器、材料和试剂】 （一）仪器、用具 CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。 （二）材料 呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3 CsCl纯化的表达质粒DNA （三）试剂 1．完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用 3．2×HEBS (g/500ml) NaCl 8.0 KCl 0.38
Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖1.0 用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。 【方法与步骤】 1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞 第二天进行转染 2．准备CaPO4沉淀 2.1 准备两组试管 在A管中加入：15μg质粒DNA 69μl 2M CaCl2 460μl重蒸水 在B管中加入：550μl 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。 2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。 4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。 5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。 6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。 【注意事项】 1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。显然，在理论上，通过siRNA几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而RNAi受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，RNAi技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。可见，RNAi的应用非常广泛，具有巨大的市场发展空间。但是，由于RNAi现象刚被发现不久，仅仅才14年的时间，无论国外还是国内，目前都缺乏有效的siRNA载体，这大大制约了RNAi的应用，包括实验研究和药物开发。目前市场上主流的siRNA转染试剂是脂质体类的转染试剂，它能将siRNA转染入多种体外培养的细胞株，但原代细胞、悬浮细胞的转染效果不是很好。由于它是脂质体类的转染试剂，因而对培养细胞有一定毒性。而英格恩生物独辟蹊径，转染载体的材料不是用传统的脂质体，而是纳米聚合物材料。这种材料对细胞几乎没有毒性，转染效率在多数细胞株都可达到90%以上，在很多原代细胞中，转染效果也比较好。更为难得的是，该公司的体内RNA转染试剂Entranster-in vivo，和核酸混合后，便可注射进动物体内，完成动物体内RNA干扰实验，十分便捷，是动物体内RNA干扰实验的新创举。
什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——
关于RNA 干扰的综述 一、相关概念 基因沉默：通过人工手段使基因的最终产物无法表达。分为转录前水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默（TGS 和PTGS ）。 TGS 是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默，例如转基因植物体内特定基因的甲基化，导致 无法转录。 PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。 反义RNA ：反义RNA 是指与mRNA 互补的RNA 分子，也包括与其它RNA 互补的RNA 分子。由于核糖体不能翻 译双链的RNA ，所以反义RNA 与mRNA 特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA 的翻译。该技术属于 上述的PTGS 。 二、发现简史 上个世纪末，反义RNA 作为一项基因治疗 的新技术引起不少研究人员的兴趣，然而在一 些实验中发生了一些有趣的现象：向细胞中导 入与目的mRNA 序列相同的正义RNA 和与之 互补的反义RNA 一样，可以产生阻断mRNA 翻译的效果。这与传统的反义RNA 技术相悖。 之后人们发现，将双链RNA （dsRNA ，由 正义RNA 和反义RNA 结合而成）注入，诱发了 比单独注入二者之一都要强得多的基因沉默。之 后也证实纯化的正义RNA 没有诱导作用，而反义 RNA 的诱导作用也很小，而之前正义RNA 引发 基因沉默的实验结果也被证实是由于其中受到了 微量dsRNA 的污染。（如右图T1、T2所示） T1（上）T2（下）
三、原理与应用 概述：细胞由于进化的机理，有一套降解双链RNA的酶系统（抗病毒感染）。RNAi就是利用这一系统，人工引入一段和目标RNA互补的序列，这样，在细胞内形成双链RNA，诱发降解机制。使目标RNA降解，无法被进一步翻译了。 具体过程： 第一步（起始阶段）：是较长ds RNA在ATP参与下被 RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义 链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA 的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3 个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋 酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合 体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在ATP酶的作用 下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。（RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。） 此外，siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA 作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合 成新的dsRNA ，它在Dicer酶的作用下也被裂解，生成大量的次级siRNA。 形成一种链式反应，使特定的基因表达被阻止。这解释了上述实验中表现 出的dsRNA的微量性和高效性。 RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但 又不影响正常的等位基因。同时，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调 控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转
RNA干扰（RNAi）实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RN A(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为R NA干扰（RNAi）。一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个A TP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer 的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： https://www.doczj.com/doc/c3964512.html,/business/products/order2.htm https://www.doczj.com/doc/c3964512.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html https://www.doczj.com/doc/c3964512.html,/Stu/shilin/rnai.html https://www.doczj.com/doc/c3964512.html,/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3
RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现
象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作
一、磷酸钙转染法 【实验原理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器、用具 CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。 （二）材料 呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3 CsCl纯化的表达质粒DNA （三）试剂 1．完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用 3．2×HEBS (g/500ml)
NaCl 8.0 KCl 0.38 Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖 1.0 用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。【方法与步骤】 1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞 第二天进行转染 2．准备CaPO4沉淀 2.1 准备两组试管 在A管中加入：15μg质粒DNA 69μl 2M CaCl2 460μl重蒸水 在B管中加入：550μl 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。 2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。 4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
RNA干扰技术的原理与应用 RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。 1 RNAi现象的发现及发展 1995年, Guo等用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫的part 1基因的实验中发现, 正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。1998年2月卡耐基研究院的F i re 等将双链RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。 随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功
应用RNAi技术抑制基因表达, 开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分RNA。 2 RNAi的作用机制 细胞中ds RNA 的存在是RNAi形成的先决条件。ds RNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、效应阶段和级联放大阶段。起始阶段:由RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的ds RNA分子在细胞内被一双链RNA酶!型内切酶也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物剪成21~ 23 nt siRNA, 3’ 端带有2个碱基突出的黏性末端, 5’ 为磷酸基团,此结构对于siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处, 具特异性。效应阶段: RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合成RNA诱导沉默复合体R I SC ( RNA inducing silence complex , R I SC)识别靶mRNA,其中的反义
RNA干扰机制主要分为两个阶段： 1：RNA干扰的启动阶段，即RNA核酸酶与双链RNA结合，并把它酶切成为多段大小为21~25个碱基对的小RNA片段（siRNA）。 2：RNA干扰的效应阶段，即siRNA与一种多聚核酸酶复合物，RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，并通过驾驭RISC到相应的mRNA位点，随即RISC执行RNA干扰的效应功能，酶切降解mRNA，使转录的基因表达终止。 第一步：双链RNA加工成为siRNA 参与该反应的酶是Dicer蛋白复合物，具有结合和酶切双链RNA的活性，与双链RNA结合的区域位于Dicer的羧基末端 第二步：siRNA的扩增 siRNA能通过细胞内的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用，以RNA干扰起源的双链RNA分子，或者以目标mRNA分子作为模板，合成出新的双链RNA分子，再通过Dicer的加工作用，产生出大量的siRNA，补充细胞内消耗和降解的siRNA分子。这种现象称为siRNA的扩增。 第三步：降解目标mRNA 在这一阶段，从双链RNA切割下来的siRNA与一种RNA干扰的特异蛋白复合物结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）。该复合物在A TP存在的条件下被激活，siRNA解链，留下反义链导向RISC与目标RNA互补结合，并酶切目标RNA分子，完成RNA干扰的过程。酶切位置常常在siRNA双链的中间部位，故，若siRNA链中间的碱基与目标不符，则会影响siRNA的沉默效应。 siRNA与RISC复合形成一种小干扰核糖蛋白粒子（siRNP） RISC与Dicer的异同点 两者都具有RNA酶活性，但是它们的作用底物不同，前者常常针对单链RNA分子，而后者则是针对双链RNA分子；另一方面，它们的酶切方式和产物也不同，前者属于RNA 的外切酶，而后者则是RNA的内切酶 另外，一些RNA干扰效应阶段的mRNA降解物，反过来可以作为RdRP的模板，合成双链RNA分子，加入到RNA干扰的启动阶段，从而放大RNA干扰的作用。
RNA干扰 科技名词定义 中文名称：RNA干扰 英文名称：RNA interference;RNAi 定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA干扰模式图 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 目录
简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 展开 编辑本段简介 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 编辑本段发现 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 RNAi实验图片 中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。
RNA干扰 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 1.作用机制 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。 RNA干扰现象的机理[8] RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA 复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解[9][10]。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分
文章编号： 06-（2004）063002101-10 中图分类号：Q344 中国生命科学论坛分子生物学版精华 RNA干扰(RNAi)实验技术相关探讨 马志杰 (maziwise) 编写小瘪修改 (中国生命科学论坛分子生物学版第1版主 ) [责任编辑：TILS007] 摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。 关键词：RNAi；siRNA；转染 小RNA作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国Science杂志评为年度10大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA对细胞行为的调控、如何利用RNAi进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。 1、RNAi的作用机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶，是RNase III家族 中特 图1、RNAi的作用机制 异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）： 2、RNAi基本试验程序及注意事项 2.1、siRNA的设计 2.1.1、目标序列的筛选
RNA干扰iRNA技术及其应用 摘要：RNA干扰(interference RNA，iRNA)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA具有特异性和有效性。iRNA技术作为功能基因组学强有力的研究工具，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。随着对现代分子生物学研究的发展，该技术的应用领域逐步扩展到医学，农业，林业，渔业，畜牧等多个领域，具有巨大的科研，经济和社会价值，本文主要论述RNA干扰技术在医学领域方面的应用。 关键字：RNA干扰转录后基因沉默RNA 诱导的沉默复合物 正文：今年来，对RNA干扰技术的研究已经成为热点，预测未来10年间最后可能出重要成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNA干扰技术之所以有如此重要的地位，与其运用到的领域有关。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开神秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。 1.RNA干扰的发现:首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。这个奇怪的现象直到3年后才被解开。1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，该小组将这一现象称为RNA干扰。现在RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞，这种情况揭示了iRNA现象很可能出现于生命进化的早期阶段。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭
反义技术——RNA干扰（RNA interference，RNAi） 2010-04-18 22:20:17 来源：易生物实验浏览次数：210 网友评论0 条 最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。 关键词：反义技术RNA干扰RNAinterferenceRNAisiRNAsRISCsnRNA 最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer e nzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3’末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering R NAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA- induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。 这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。