竭诚为您提供优质文档/双击可除
病原菌的分离鉴定
篇一：常见病原菌采样分离过程
金黄色葡萄球菌采样分离过程
1、样本采集及初步分离
（1）奶样的采集：
采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。
（2）乳房皮肤拭子
用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
（3）鼻腔拭子
用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有
0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室
处理。
菌种的初步分离
首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。
需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。
2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。
3、菌种的复苏
如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
肠球菌采样分离过程
1、样本采集及初步分离
（1）肛门拭子
以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅
速带回实验室处理。
（2）泄殖腔拭子
以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸
取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
首次分离时，将样品在6.5%nacl营养肉汤中，45℃，18-24小时预增菌进行选择性培养后，将上述培养物以划线方式接种在肠球菌选择性培养基（叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基，beA）上，37℃，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取灰色，半透明，1-2mm大小的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤37℃培养18小时左右。
2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。
3、菌种的复苏
如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在beA琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
需要注意的是由于beA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生，因此，可以将肠球菌疑似菌株在beA琼脂上进行二次筛选，提高分离准确率。
1、样本采集及初步分离
（1）肛门拭子
以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
（2）泄殖腔拭子
以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸
取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉大肠杆菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取蓝色的单菌落，用营养肉汤37℃培养18小时左右。
2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。
3、菌种的复苏
如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
1、样本采集及初步分离
（1）肛门拭子
以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
（2）泄殖腔拭子
以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸
取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
需要注意的是成年动物沙门氏菌携带率非常低，因此对于沙门氏菌的采集应以弱雏为主要分离对象来提高分离率。
首次分离时，将样品在sc肉汤（亚硒酸盐-半胱氨酸肉汤）中，37℃，18-24小时预增菌进行选择性培养后，将上
述培养物以划线方式接种在沙门氏菌选择性培养基上，37℃，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取紫色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤37℃培养18小时左右。
2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。
腐乳中乳酸菌的分离与鉴定 王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1 (1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083) 摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。 关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1 (1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural U niv ersity,Beijing100083,China) Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested. Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n 乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。 腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。 乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 样品 收稿日期:2010-03-27 *通讯作者 基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程; 鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。 98
实验五植物病原物的接种 一、实验目的 人工使病原物与寄主植物感病部位接触，创造条件使病原物侵入并诱致寄主发病叫接种，接种是证病过程的重要步骤，在研究寄生现象发病规律，测定品种抗病性，药剂防病效果时都需要接种。因此，接种是植病工作者必须掌握的基本技术环节。 植物病害人工接种方法，是根据病害的传染方式和侵染途径设计的，植物病害的种类很多、其传染方式和侵染途径各异。因此接种方法也不相同。本次实验以玉米大斑病，小麦根腐病，小麦秆锈病，梨褐腐病等为内容学习常用的接种方法。 二、内容、材料和方法 (一)拌土法(小麦根腐病) 拌土法适于土壤传染的病害，方法是将消毒的土壤分别装入两个小花盆中，其中一盆表层覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培养菌1份加消毒土5份混合而成，另一盆不接种(不覆菌土)作为对照。将经0.1%升汞表面消毒3分钟并用无菌水洗3次的小麦种子，分别播种在两个花盆内，插上标牌，注明接种日期，方法病害名称及接种人姓名，花盆放在室温下，浇水保湿，遮阴管理，待幼苗出土展开叶子后(大约一周)，观察并记载根腐病发生情况。 (二)喷雾法(玉米大斑病) 气流及雨水传播的病害常用此法接种，将培养好的玉米大斑病的斜面
菌种一支，用移植钩刮于装有100毫升无菌水的三角瓶中，用力振荡，待孢子洗下后，以纱布过滤，并于滤液中加入
0.1克中性肥皂，即成孢子菌丝悬液，用卫生喷雾器均匀喷布在麦苗上。同时设一不喷菌液而喷无菌水的作对照，用塑料罩保湿48小时，揭布后正常管理，7天后作发病调查。 (三)涂抹法(小麦秆锈病) 这也是气流传播的病害常用的接种方法，用于禾本科锈病接种。方法是用姆指沾锈菌夏孢子悬液自下向上轻轻涂欲接种的小麦叶片，也可先用手指沾水摩擦叶片，使叶表有一层水膜，然后将夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子悬液或孢子粉的作为对照。塑料罩保湿48小时后揭布，正常管理，7天后作发病调查。 (四)创伤接种法(白菜软腐病及梨褐腐病) 创伤接种法是伤口侵入的弱寄生菌常用的接种方法。 1.白菜软腐病：取切成适当大小的白菜帮两块、经水洗，待水稍干后，以10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在两个灭过菌的上下铺有吸水纸的培养皿中，用酒精擦过的玻璃棒顺着白菜帮打三排不穿透的孔穴。将培养好的白菜软腐病菌斜面菌种的菌苔以无菌水洗下作成菌悬液。然后，先以灭过菌的兽用注射器吸取无菌水滴于菜帮的第一排内孔作为对照，再用该注射器吸菌液滴于第二、三排孔内。注意无论无菌水、还是菌液都不要滴的过多。以免流出孔穴，另一培养皿的菜帮以同法处理作为重复。盖好皿盖，置于26—28℃的温箱中，24小时后检查发病情况。 2.梨褐腐病：取白梨以酒精火焰表面消毒后，用炽热的解剖刀，在其上切成小手指粗的孔穴3
材料与方法 样品 检测用试剂 1、Griess 试剂 溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。 溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。 格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上， 依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有 亚硝酸细菌存在。 2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在） 称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。 由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基 1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母粉 5g 蛋白胨 10g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 水 1000mL 灭菌前pH自然 硝化细菌培养基
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
病原菌分离方法 一、实验原理： 植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。 二、实验用具： 酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等 三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。 （2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。 （3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。 四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定） （2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸） （4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基 约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培 养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝
硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
第四章植物病原菌分 离与纯化 植物病原菌 一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 ?分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备 培养基的准备 ?分离材料选择 以收获的材料从病健交界处采样 果实腐烂从开始腐烂处分离 根腐和枯萎层可能从离土较远处分离
有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等 发病后分离 ?组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也 可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3 －5min；所需时间因材料不同而异， 消毒后灭菌水3－5次 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒 效果，除气泡抽气、70％酒精浸2 －3秒
⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使 用。 ◆最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 （3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真
学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究 杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立? 华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079） E-mail: deliliu2002@https://www.doczj.com/doc/c315074769.html, 摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究 1. 引言 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N O或N2的过程。传统观点认为：反硝化细菌大 2 都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。 2. 材料与方法 2.1 培养基 富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。 反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。 BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。 基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
硝化细菌相关培养基： 1、富集培养基： 硝化细菌富集培养基： KNO2 0.5g; KH2PO4 0.07g; MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g; 蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0. 亚硝化细菌富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g; KH2PO4 0.07g; MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g; 蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0. 2、分离固体培养基： 硝化细菌平板分离固体培养基： KNO2 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g； MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g； FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g； NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL； 琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0． 亚硝化细菌平板分离固体培养基：(NH4) 2SO4 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g； MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g； FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g； NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL； 琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0． 3杂菌检验培养基： （1）检查异养型细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）：酵母粉：0.5g 胰蛋白胨：1.0g 氯化钠：1.0g 琼脂：1g (2)检查酵母菌： 豆芽汁葡萄糖培养基： 10%豆芽浸汁100ml 葡萄糖5g 琼脂1.5—2.0g 自然PH (3)检查霉菌: 马铃薯葡萄糖培养基: 20%马铃薯浸汁100ml 葡萄糖2g 琼脂1.5—2.0g 自然PH
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
植物病原真菌的分离培 养精选文档 TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-
实验十三植物病原真菌的分离培养 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的： 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2．分离用具（每小组为单位）
酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿 （Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤： （一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定 邵基伦环境工程专业 摘要：当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健康。水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。所以控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。硝化细菌是一类好样化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。它们能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。因为硝化细菌、亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外,碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。 本实验采用人工培养基方法富集培养硝化细菌．研究了富集培养过程中硝化与亚硝化细菌的结构和性质变化。结果表明，在25-28℃，pH7．5～8.5，D0 2-5mg／L，氨氮浓度100—150mg ／L条件下，经过19d和15d的富集培养，可以得到硝化速率为4.18mg(NH3-N)-[g(MLSS)/h]和10.1mg(NH4-N)-[g(MLSS)/h]的硝化细菌培养物．在这种富集培养过程中，硝化细菌培养物的污泥色泽和结构、MLSS、SV30、SVI、硝化强度和硝化速率等均出现规律性变化且随培养方法不同表现出明显差异。
实验十三植物病原真菌的分离培养 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的： 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2．分离用具（每小组为单位） 酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤： （一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材： 1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ； 2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。 以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。 2. 药品配制 2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。 2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。
普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg ／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时