乳酸菌的分离、纯化与鉴定
第一部分：乳酸菌的分离、纯化
一、实验器材：
1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ；
2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。
二、实验步骤：
1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）：
（A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。
以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。
2. 药品配制
2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。
2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。
2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。
2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。
2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。
3. 菌悬液的配制
取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌20Min,得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐
水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为10-1的样品
稀释液；
将7只装9ml生理盐水的无菌试管，依次标记10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中，稀释混匀便得到10-2稀释液，如此重复依次制得10-3?10-7的稀释液。
4. 倒平板
取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50E左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。
5. 分离方法
A. 平板划线
接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有” 10-1”的3个平板进行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在 40C恒温培养箱中培养48小时。
B. 平板涂布
用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.1ml ;尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20 Min ;然后倒置于40C恒温箱中培养48小时。
6. 脱脂乳试管的配制与灭菌
直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1: 10的范围内）的比例配制，装量以试管的 1/3为宜，115C灭菌15min。
7. 菌落观察
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm 园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaC03勺溶解圈。40C培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初
乳酸菌的分离与发酵实验 生命科学学院2009级四班2组 傅盛晟 摘要：本文对乳酸菌的分离与发酵实验进行阐述，从市售酸乳中分离保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并进行分离与鉴定，最后进行酸乳的发酵实验！实验主要是分离与纯化，鉴定与发酵，最后用分离的菌进行酸乳发酵在与市售酸乳混合菌种进行比较。 关键词：酸奶，乳酸菌，分离鉴定，发酵 微生物在厌氧条件下，分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要能利用可发酵糖生产乳酸的细菌，即乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobaterium)和明串珠菌属(Leuconostoc)等。乳酸细菌多是耐氧菌，只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸茵或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。 酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发醇而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发醇制品，是具有一定保健作用的食品。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽．由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，因此，达到了稳定状态的彻合发酵。酸乳发酵的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪
蛋白(在全乳中的质量分数为2．9％，在乳蛋白中的质量分数为85％)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其PH降至酪蛋白等电点(4.6)附近(4.0~4.6)从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酷蛋内降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二酮等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。按凝固状态可将酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似，本实验主要是凝固型酸奶的制作方法。 一，材料与方法 1.材料和用具 1）菌种，嗜热乳酸链球菌，保加利亚乳酸杆菌，这两类菌种可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。 2）培养基参照相关文献和老师的建议以及乳酸菌生长需要复杂营养物质和多种生长因子，我们选用如下培养基： 分离纯化培养基：脱脂乳平板培养基 鉴定培养基：脱脂乳试管 其他：脱脂乳粉或脱脂牛奶，蔗糖等 3）仪器及用具恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，试管，三角瓶若干 2.培养条件 培养温度：40℃ 厌氧条件：由于乳酸菌的发酵与分离纯化都需要厌氧条件，而实验室没有专门的厌氧培养箱，所以我们采用在培养皿和发酵杯上套上保鲜膜制造无氧环境。 培养时间：在培养基上分离培养的时间为2天左右，酸乳发酵为12个小时左右 方法和步骤 1）乳酸菌的分离纯化 101-~105-，取其中的 (1)分离。取市售新鲜酸乳或泡菜的酸液稀释 104-、105-2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别接入脱脂乳琼脂培养基上，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或者直接用接种环沾取原液，平板划线分离，置40℃下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (2)鉴别。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞呈杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色阳性，则可将其接种到试管斜面上连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 2）乳酸菌饮料—酸乳的发酵
腐乳中乳酸菌的分离与鉴定 王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1 (1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083) 摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。 关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1 (1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural U niv ersity,Beijing100083,China) Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested. Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n 乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。 腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。 乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 样品 收稿日期:2010-03-27 *通讯作者 基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程; 鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。 98
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
乳酸菌的分离纯化
乳酸菌的分离与纯化 1.实验目的 2.实验材料 2.1试验设备 天平、牛角匙、电炉、 pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、 500mL 锥形瓶两个、 250mL锥形瓶两个、试管20只、 500mL烧杯两个、 250mL 烧杯两个、 100mL烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。 2.2实验仪器 50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、 75%酒精棉、冰箱。 2.3实验药品 新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、诗坛酸复红染液。 3.试验方法及操作过程 3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌 （A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。 按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，
加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布） 再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。 3.2倒BCG培养基平板的方法 将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌） 3.3脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。 3.4乳酸菌的分离纯化 取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 3.5乳酸发酵及检查
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
酸奶中乳酸菌的筛选试验 一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法 二、实验原理： 市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。 .筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离 三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。 仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接
种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机 四培养基类型 ①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min ②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。 配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4； 2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液； 3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌； 4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。 五、实验流程 1、吸取酸奶1ml 2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium） 3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落 4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征 5、Improved MC Medium 划线分离纯化 6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色 7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态
乳酸菌的分离培养 保加利亚乳杆菌 组长： 组员： 实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察； 2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术； 3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。 4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。 5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。 6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。 实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中 用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 实验器材： 样品：含乳酸菌的酸奶 ①培养基：改良MRS固体培养基 蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL 乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL 琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。 仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个 250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只 15ml试管7只高压灭菌锅天平
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材： 1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ； 2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。 以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。 2. 药品配制 2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。 2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。
LUOYANG NORMAL UNIVERSITY 2015届毕业论文 乳酸菌的分离纯化及抑菌实验 院（系）名称生命科学学院 专业名称生物技术 学生姓名勾倩倩 学号111344045 指导老师易力副教授 完成时间2015年5月7日
乳酸菌的分离纯化及抑菌实验 勾倩倩 生命科学学院生物技术专业学号：111344045 指导教师：易立副教授 摘要：本文对乳酸菌的分离纯化，革兰氏染色以及抑菌实验进行阐述，从市售酸菜中分离纯化得到乳酸菌，革兰氏染色进行鉴定，最后进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌实验！实验主要是分离纯化，革兰氏染色，最后用抑菌实验比较单菌株的抑菌能力。 关键词：乳酸菌：分离纯化；革兰氏染色；抑菌 乳酸菌 (LA B ，Lactic acid bacteria)是指能使碳水化合物(主要为葡萄糖)发酵产生大量乳酸的细菌的通称，这类细菌生长在矿物质和有机营养丰富的微酸性环境中[1,2]。在自然界中比较常见，用途广泛，它可以改善食物的风味，并延长食品的货架期，作为保健食品和药品，可以改善和提高人的健康水平，延年益寿，还可以作为微生物学和微生态学领域研究的模式生物[3]。酸菜是世界性大众化蔬菜腌制品,在我国历史悠久[4]，其自然发酵的主要菌群是乳酸菌[5]。人体在摄人发酵酸菜时，也同时摄入了大量的乳酸菌体及其代谢产物[6]。乳酸菌是酸菜发酵过程中的有益菌，在发酵速度以及发酵产品品质等方面都起到至关重要的作用。因此在微生物学和食品科学的研究中，对酸菜中乳酸菌进行鉴定是必要的[7]。 本实验从酸菜中分离纯化得到6株乳酸菌（1,2,3,4,5,6），进行革兰氏染色，为紫色杆状，最后进行抑菌实验，比较6株乳酸菌的抑菌能力。 1 材料与仪器 1.1 菌种 乳酸菌 1.2 样品来源 市售新鲜酸菜
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。
乳酸菌得分离培养 保加利亚乳杆菌 组长： 组员： 实验目得：1、学习并掌握普通光学显微镜油镜得使用技术及微生物形态观察； 2、学习微生物制片、染色得基本技术，掌握乳酸菌得简单染色法及无菌操作接种技术； 3、通过对培养基得配制，了解配制培养基得一般步骤与方法，掌握微生物实验常用得器皿得清洗与包扎、培养基得制备、消毒灭菌。 4、了解各种灭菌得基本原理与应用范围，以及实验室中常用得灭菌方法。 5、了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌得基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目得测定得方法。 6、了解稀释平板计数得原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数得原理并学习使用血球计数板进行微生物计数得方法。 7．初步学会乳酸菌培养得基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应得原理与方法，掌握进行微生物大分子水解试验得原理与方法。 8、了解并掌握微生物菌种保藏得常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同得生物大分子得分解利用情况，认识微生物代谢类型得多样性。 实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸得一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌得总称，本实验中 用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法就是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+与G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌与乳球菌得混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售得酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物得大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基就是按照微生物生长发育得需要，用不同组份得营养物质调制而成得营养基质；灭菌就是用物理或化学得方法来杀死或除去物品上或环境中得所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往就是不同种类微生物得混合体，为了研究某种微生物得特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂得微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养得方法称为微生物得分离与纯化。用生化试验得方法检测细菌对各种基质得代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌得种属，称之为细菌得生化反应。 实验器材： 样品：含乳酸菌得酸奶 ①培养基：改良MRS固体培养基 蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物2、5g 柠檬酸二铵1g 水500mL 乙酸钠2、5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0、125 吐温80 0、5mL 琼脂12、5g MgSO4·7H2O 0、29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。 仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个 250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只 15ml试管7只高压灭菌锅天平
乳酸菌的分离和初步鉴定 刘海音张超 (长春师范学院生物系，长春，130032) 摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。 关键词：乳酸菌分离鉴定 乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌 1.材料和方法 1.1材料 1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶 1.1.2 培养基 BCG牛乳培养基 A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml, 80 摄氏度灭菌20 min. B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min 以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。 乳酸菌培养基 牛肉膏5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 6.8 121摄氏度湿热灭菌20 min 蛋白胨水培养基
酸奶中乳酸菌的分离与纯化 一、实验目的 1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术； 2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。 二、实验设备及材料 培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。 实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。 三、实验原理 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。 在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。
四、实验步骤 1.乳酸菌培养基的制作 配方 牛肉膏 2.0g 蛋白胨 2.0g 酵母膏 2.0g 番茄汁40g 葡萄糖 2.0g 吐温0.10mL 碳酸钙 3.4g 溴甲酚绿0.02g 琼脂2～4g 水200mL ①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。 ②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。依次加 入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。 ③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。 ④加棉塞、包扎 ⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭 菌20min。 ⑥无菌检查
2.倒平板 将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 3.制备稀释液 量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10?3、10?4、10?5各种稀释度的酸奶稀释液。 4.涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10?3、10?4、10?5三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10?3、10?4、10?5三管酸奶稀释液中吸取0.2mL对号放入写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布棒轻轻地涂布均匀。 5.培养 将接种后的平板后倒置于37℃培养3～5 d。 6.纯化 待菌落长出后，选中目标菌落。用接种钩或无菌牙签挑取菌落边缘，并移植于新的乳酸菌培养基。注意每一个平皿只能用于纯化1个菌。将重新接种后的平皿置于37℃环境下培养3～5d。然后，用显微
分子生物学实验作业 ——用分子生物学方法鉴定菌株 专业：生物化工 姓名：王晓娜 学号：1043111039
鉴定一株乳酸菌菌株 一、实验目的和方法 采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株 二、实验材料 2.1 菌株 实验给定的菌株 2.2 试剂 Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA
2.3 仪器 台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统 三、实验步骤 3.1 制备细菌DNA样品 收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。然后，将DNA浓度稀释至48ng/μl作为模板备用。 3.2 PCR反应 扩增体积为25μl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP 2μl，引物lμl，模板DNA 1μl)。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。取12μl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察
乳酸菌的鉴定 吲哚试验 1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。 3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 糖发酵试验 1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。 3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。 1.2.3 乳酸的检测 选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。 1.结果和分析 2.1 乳酸菌的分离提纯 在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下 观察到了链球状和杆状两种形状（如图一 2.2乳酸菌的鉴定 该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。 说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证