肿瘤微环境响应型药物/基因纳米递送系统构建及其抗肿瘤药效
学研究
纳米递送系统(Nano-delivery systems,NDS)相比于传统的化疗药物具有独特的优势,近年来取得重要进展。为实现肿瘤的高效靶向递送,NDS需要跨越多重生理障碍,但每个过程对NDS的物理化学性质有不同的要求。
利用肿瘤组织的微环境特征,设计物理化学性质灵活可变的NDS用于肿瘤药物/基因靶向递送,可达到增效减毒的目的。本研究构建了三种肿瘤微环境响应性NDS,采用化疗或化疗/基因治疗联用的策略,旨在探讨该类微环境敏感NDS在肿瘤治疗中的优势。
第一章:简要介绍了近年来肿瘤靶向NDS的发展及肿瘤微环境响应型NDS在肿瘤靶向治疗中的应用,阐述了siRNA/药物联合治疗肿瘤的优势,以此为背景确立了本文的立题依据和设计思路。第二章:以壳聚糖(Chitosan)CS为主体,先后修饰可响应肿瘤细胞内pH(Intracellular pH,pHi)的尿刊酸(Urocanic acid,UA)与响应肿瘤细胞外pH(Extracellular pH,pHe)的2,3-二甲基马来酸酐(DMMA),合成聚合物DA-CS-UA,通过自组装形成逐步pH响应型纳米粒DA-NPs。
pH响应性考察发现DA-NPs在pHe刺激下发生电荷翻转,同时可响应pHi使粒径显著增大。DA-NPs对化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)具有较高的包封率和载药量,制得的DOX/DA具有适宜的粒径,释药行为呈现明显的pH响应性。
细胞摄取实验发现DOX/DA在pHe条件下相比于生理条件具有更高的细胞摄取。进入细胞后,NPs的UA段响应pHi刺激,使DOX从NPs释放扩散入核发挥作用。
体内试验表明DA-NPs对肿瘤具有较好的靶向性,能显著抑制实体瘤的增长,
同时降低了DOX在正常组织的蓄积,减少DOX带来的系统毒性。以上实验结果表明,逐步pH响应型的DOX/DA具有较好的肿瘤靶向性和抑瘤效果,对DOX具有增效减毒的作用。
第三章:在第二章的基础上,为进一步提高NPs肿瘤靶向性,构建了一种程序性pH/还原响应NPs用于抗肿瘤药物的体内递送。该NPs由pHe响应可电荷翻转的PEG层(PEG-CS-DA,sPEG)和主动靶向配体乳糖酸(Lactobionic acid,Lac)修饰的还原敏感内核乳糖酸-壳聚糖-硫辛酸(Lactobionic acid-chitosan-lipoic acid,LCL)组成,其中DOX包载在疏水内核LCL中(DOX/LCL)。
在生理条件下,负电荷的sPEG通过电荷吸引包覆在正电荷的DOX/LCL上,得到sPEG-DOX/LCL。通过响应pHe,sPEG可发生电荷翻转,从DOX/LCL表面脱落,以暴露其正电荷内核与Lac配体。
在10 mM GSH刺激下,LA的二硫键断裂,DOX/LCL结构发生形变,快速释放所包载的DOX。细胞摄取实验与肿瘤球穿透性实验表明,sPEG-DOX/LCL在pHe刺激下具有更高的细胞摄取与肿瘤组织穿透性。
进入细胞后,sPEG-DOX/LCL可响应胞内GSH促进药物释放,增强细胞毒性。体内实验表明sPEG-DOX/LCL具有较长的体内半衰期并可将DOX靶向于肿瘤组织。
与对照组相比,sPEG-DOX/LCL呈现更好的体内抗肿瘤效果并减轻DOX的系统毒性。综上所述,这种含有pHe响应可脱落的PEG层和主动靶向修饰还原响应特征的NPs具有良好的肿瘤靶向性与抑瘤效果,为DOX的增效减毒提供了一种方案。
第四章:在第三章的基础上,为进一步增强抗肿瘤效果,我们通过模拟LDL的组成,构建了一种仿生型的LDL NPs,包载VEGF siRNA(siVEGF)与DOX,并在其表面修饰sPEG,制备sPEG-siVEGF/DOX-NPs,以屏蔽其正电荷与Apo B蛋白。通过响
应pHe,sPEG可发生电荷翻转,从siVEGF/DOX-NPs表面脱落,以暴露其正电荷与主动靶向配体Apo B蛋白,促进细胞摄取与内含体逃逸。
RT-PCR和Westen blot实验发现,siVEGF-NPs可在m RNA与蛋白水平下调VEGF表达,并减弱VEGF对HUVEC细胞增殖和迁移的促进效果;另一方面,DOX则逐步扩散至细胞核,引起细胞毒性。体内靶向性实验表明,该NPs具有较强的肿瘤组织靶向性,可将siRNA和DOX共递送至肿瘤组织。
体内药效学评价表明,共载siVEGF与DOX的sPEG-siRNA/DOX-NPs可在DOX 给药量较小时显著抑制肿瘤增长与肿瘤血管生成,相比于单载siVEGF的
sPEG-siRNA-NPs或单载DOX的sPEG-DOX-NPs具有更强的抗肿瘤效果。上述试验结果表明,通过这种肿瘤微环境敏感性的NPs靶向共递送siVEGF与化疗药物DOX 为体内高效抑瘤提供了一种较好的方案。
抗肿瘤药物药效学指导原则 (讨论稿) 1 基本原则 抗肿瘤药物可分为：(1)细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等；(2)生物反应调节剂(biological response modifier)；(3)肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)；(4)肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)；(5)肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)；(6)分化诱导剂(differentiation inducing agent)；(7)生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)；(8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)等。抗肿瘤药物的药效学包括体内外抗肿瘤试验，评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。 2 体外抗肿瘤活性试验 2.1 试验目的(1)对候选化合物进行初步筛选；(2)了解候选化合物的抗瘤谱； (3)为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。 2.2 试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的和所选用的方法选择相应的细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT]还原法、XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphonyl)-5-[carboxanilide]-2H-tetrazolium hydroxide}还原法、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养的时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。 2.3 评价标准以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。 3 体内抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验结果是评价候选抗肿瘤化合物有效性的最重要指标。体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植瘤模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。鼓励使用人癌裸小鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型，以较正确和全面地评价候选化合物的抗瘤活性和抗瘤谱。鼓
1．项目名称：新型抗肿瘤分子靶向递送系统研究 2．推荐单位：教育部 3．项目简介： 科学问题 化疗在肿瘤治疗中应具有重要作用，但实际疗效相当不理想。重要原因之一是化疗药在体内分布上对肿瘤组织缺乏选择性（包括小分子靶向药物）；当前各种被动和主动靶向策略的细胞内靶向效率仍不理想。因此，如何提高活性成分（治疗或诊断药物）对肿瘤细胞的选择性，真正实现胞内高效药物递送，获得肿瘤细胞内较高的药物浓度，长期以来都是科学家们面临的重大科学问题。 主要研究内容 1）以肿瘤生物标志物作为药物载体递送的靶，开展新一代受体介导的抗肿瘤分子靶向载体系统研究； 2）同时以2种肿瘤生物标志物作为药物载体递送的靶，开展新型抗肿瘤双分子靶向递送系统研究； 3）用于分子靶向递送的新型药物载体系统的创制； 4）用于分子靶向递送的新配体分子的发现与应用。 成果及意义 1）提出了一系列抗肿瘤分子靶向递送的新策略和新思路。特别是通过新一代受体介导靶向递送明显提高了细胞内递送效率，证明把肿瘤生物标志物作为药物载体递送的靶是可行的，证实被动与主动靶向相结合的优势，阐明肿瘤细胞和新生血管双重靶向、双分子靶向递送、新载体系统结合受体介导等的可行性和重要性，为肿瘤诊治提供了新途径和新方案； 2）阐明了一系列相关科学问题和科学规律，发表了一系列代表性学术论文，获得了第三方的高度评价与关注； 3）研究产生了积极的引导作用，对学科交叉和相关学科的发展产生了重要的推动作用。相关研究思路和方法已被国际学术界广泛接受认同，有的成为当前靶向递送研究的主流方向之一； 4）研究具有重要的临床应用价值。1种双分子靶向成像系统已进入开发阶段，一种新的配体分子GE11也成功实现技术转让并进入临床前研究。
新型抗肿瘤药物临床应用指导原则（2018年 版） 新型抗肿瘤药物临床应用指导原则（xx年版） 目录 第一部分新型抗肿瘤药物临床应用指导原则抗肿瘤药物临床应用的基本原则 一.病理组织学确诊后方可使用 (01) 二.基因检测后方可使用 (02) 三.严格遵循适应证用药 (04) 四.体现患者治疗价值……………………………………………………………………… 04 五.特殊情况下的药物合理使用…………………………………………………………… 六.重视药物相关性不良反应……………………………………………………………… 抗肿瘤药物临床应用管理 05 05
一.医疗机构建立抗肿瘤药物临床应用管理体系 (06) 二.抗肿瘤药物临床应用实行分级管理 (09) 三.细胞或组织病理学诊断 (10) 四.培训.评估和督查 (1) 0第二部分各系统肿瘤的药物临床应用指导原则呼吸系统肿瘤用药 一.吉非替尼 (12) 二.厄洛替尼 (14) 三.埃克替尼 (15) 四.马来酸阿法替尼 (16)
五.奥希替尼…………………………………………………………………………………17 六.克唑替尼…………………………………………………………………………………18 七.贝伐珠单抗………………………………………………………………………………20 八.重组人血管内皮抑制素…………………………………………………………………21 九.盐酸安罗替尼……………………………………………………………………………21 .塞瑞替尼………………………………………………………………………………… 一.纳武利尤单抗…………………………………………………………………………2224 消化系统肿瘤用药 一.瑞戈非尼 (26) 二.甲苯磺酸索拉非尼 (2) 8
专业进展——药物基因组学 一、药物基因组学 药物基因组学：是研究人类基因变异和药物反应的关系，利用基因组学信息解答不同个体对同一药物反应存在差异的原因。 基因组（genome）：是指生物体单倍细胞中一套完整的遗传物质，包括所有的基因和基因间区域（即编码区和非编码区）。 人类基因组计划是由序列（结构）基因组学向功能基因组学的转移。开启了人类的“后基因组时代”。 后基因组时代研究的重要方向： 功能基因组学 比较基因组学 结构基因组学 蛋白质组学 药物基因组学 …… 二、基因多态性 基因多态性是指在一个生物群体中，呈不连续多峰曲线分布的一个或多个等位基因发生突变而产生的遗传变异。 CYP450酶超大家族 共涉及1000种药物的代谢（拓展） 12种亚型：CYP1、CYP2、CYP3…… 15个亚家族：A～Q 如：CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A5等 药物转运蛋白－MDR1（多药耐药基因）（拓展） 调控许多药物吸收、分布和排泄过程 与胆红素、抗癌化疗药物、强心苷、免疫抑制剂、糖皮质激素、HIVⅠ型蛋白抑制剂有关 药物靶蛋白－ADRB2 编码人β2肾上腺受体 人类白血球抗原－HLA－B HLA－B变异，将引起某些药物的严重皮肤反应 内容： 1.药物代谢酶的多态性 同一基因位点上具有多个等位基因引起，其多态性决定表型多态性和药物代谢酶的活性，造成不同个体间药物代谢反应的差异。是产生药物毒副作用、降低或丧失药效的主要原因之一。 细胞色素P450酶（CYP）是药物代谢的主要酶系。在细胞色素P450的亚群中，CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19对许多药物的效应非常重要。（拓展） 例： 奥美拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑等质子泵抑制剂由P450酶代谢，主要由CYP2C19，部分由CYP3A4代谢。 因此，CYP2C19的基因多态性会影响质子泵抑制剂的药动学，从而影响后者治疗相关疾病的临床效果。 埃索美拉唑仅经CYP3A4代谢。 2.药物转运蛋白 在药物的吸收、排泄、分布、转运等方面起重要作用，其变异对药物吸收和消除具有重要意义。 药物进入体内方式除被动扩散外，细胞的主动转运发挥着非常重要的作用。 例：
附件5 药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 简称ADME）的过程和特征。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要 作用。在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据。在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。在临床试验中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 本指导原则是供中药、天然药物和化学药物新药的非临床药代动力学研究的参考。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行药物非临床药代动力学研究的 基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的测定方法、研究项目（血
药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性及转运体的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中其他一些需要关注的问题进行了分析。附录中描述了生物样品分析和放射性同位素标记技术的相关方法和要求，供研究者参考。 二、基本原则 进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则： （一）试验目的明确； （二）试验设计合理； （三）分析方法可靠； （四）所得参数全面，满足评价要求； （五）对试验结果进行综合分析与评价； （六）具体问题具体分析。 三、试验设计 （一）总体要求 1. 受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较
目录 摘要................................................................................................................................................I ABSTRACT................................................................................................................................III 符号说明....................................................................................................................................VII 第一章绪论 (1) 1.1引言 (1) 1.2恶性肿瘤的特点与治疗 (1) 1.2.1恶性肿瘤的特点 (2) 1.2.2恶性肿瘤的治疗 (3) 1.3溶酶体 (3) 1.3.1溶酶体膜通透性与完整性 (4) 1.3.2溶酶体与细胞凋亡 (4) 1.3.3溶酶体与肿瘤关系 (5) 1.4纳米载药递送系统概述 (5) 1.4.1纳米技术与医学应用 (6) 1.4.2纳米药物递送系统 (7) 1.4.3纳米技术在肿瘤药物递送系统中的应用 (8) 1.5二氧化硅纳米粒子研究进展 (10) 1.5.1介孔二氧化硅纳米材料 (10) 1.5.2介孔二氧化硅纳米材料在生物医学上的应用 (12) 1.5.3空心介孔二氧化硅纳米材料 (13) 1.5.4基于空心介孔二氧化硅载药系统在肿瘤治疗的应用 (14) 1.6论文的选题依据和主要研究内容 (17) 1.6.1选题依据 (17) 1.6.2主要研究内容 (18) 第二章基于介孔二氧化硅纳米载药系统的构建及可控释放研究 (19) 2.1引言 (19) 2.2实验部分 (19)
指导原则编号：Array化学药物一般药理学研究 技术指导原则
二OO四年十一月 目录 一、概述????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????2 二、基本原则????????????????????????????????????????????????????????????????????????????2 三、试验设计的基本要求???????????????????????????????????????????????4 四、主要研究内容????????????????????????????????????????????????????????????????6 五、数据处理与结果评价????????????????????????????????????????????????????????????????8 六、参考文献????????????????????????????????????????????????????????????????8 七、附录????????????????????????????????????????????????????????????????9 八、着者????????????????????????????????????????????????????????????????9 化学药物一般药理学研究技术指导原则起草说明??????????????????????????????10
纳米介孔硅及聚合物胶束智能药物递送系统制备与抗肿瘤效应 研究 恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。传统临床手术、放疗及化疗治疗手段仍存在诸多缺陷,如易复发、无靶向特异性、多药耐药性及严重毒副作用等,因而较难彻底根治肿瘤,尤其对晚期肿瘤疗效甚微。 纳米颗粒药物载体由于其独特的增强渗透性和滞留性(EPR)效应,在提高抗肿瘤药物生物利用率、增强疗效以及减少毒副作用方面发挥着重要作用,有广阔的临床应用前景。目前,已开发出基于脂质体、无机纳米颗粒和聚合物胶束的多种抗肿瘤纳米医药制剂。 智能药物递送系统就是其中的佼佼者,该体系可以选择性的将治疗药物靶向递送到肿瘤病灶,原位响应生物信号刺激释放化疗药物/光敏剂/siRNA。兼顾生物相容性的前提下,智能药物递送系统能够对肿瘤高效地杀伤且毒副作用小,在临床上有巨大的应用前景。 智能药物递送系统一般是以纳米颗粒为药物载体,通过多功能修饰手段整合诸如刺激响应性释放机制以及靶向分子等策略来构建。介孔硅纳米颗粒以及聚合物胶束作为其中的典型代表,受到了研究人员的广泛关注。 介孔硅纳米颗粒具有合成简单、高比表面积、粒径可调和易修饰等特点,作为纳米储存器被广泛开发及应用到药物递送和生物成像等医学领域。聚合物胶束由于其良好的生物相容性、低免疫原性、高药物装载量以及可降解等优点,在靶向递送药物/基因治疗肿瘤等方面有巨大的应用前景。 但仍存在一些亟待解决的问题:1.如何构建有高载药量和良好生物相容性的生物信号响应性介孔硅靶向药物递送系统,使其特异性的靶向肿瘤病灶,在肿瘤
微环境特有生物信号的刺激下,原位递送化疗药物特异性地杀伤肿瘤,在提高药物利用率的同时减少对正常组织的副作用;2.如何设计构建有良好生物相容性和刺激响应性的可降解聚合物胶束靶向药物递送系统,实现对肿瘤的特异性靶向及提高肿瘤细胞对载体的摄取效率,使其被摄取后能够有效地从溶酶体逃逸到胞浆,并且响应性的触发载体降解和化疗药物/功能性治疗分子的释放机制,对肿瘤组织高效杀伤。基于以上问题,本文设计合成了三种纳米介孔硅及三种可降解聚合物胶束,通过多功能化修饰手段整合生物信号刺激响应性释放/降解机制以及引入肿瘤靶向基元,共构建了六种硅纳米颗粒/聚合物胶束药物递送系统,较系统地研究了各体系体内外刺激响应性药物释放特性、细胞靶向、生物成像、免疫响应、肿瘤抑制及相关分子机制,为研发靶向药物递送系统提供科学依据。 本文的主要研究内容和结论如下:一、基于纳米介孔硅颗粒响应性药物递送系统的构建及抗肿瘤研究1.还原响应性介孔硅/肝素药物递送系统构建及抗肝 肿瘤评价本章构建了以MSN为纳米储存器,二硫键为分子开关、肝素作为纳米塞、乳糖酸作为靶向基元的还原响应性靶向药物递送系统(MSNs-S-S-HP-LA)。透射电镜、热重、Zeta电位、红外光谱和比表面及孔隙度表征证实已成功构建 MSNs-S-S-HP-LA靶向药物递送系统。 药物控释实验证实该体系有还原敏感的控释特性。细胞毒性实验表明该体系有良好的生物相容性。 激光共聚焦、流式细胞仪、细胞透射及凝胶电泳DNA片段测定实验表明该靶向药物递送系统可以被肝肿瘤细胞HepG2特异性识别并摄取。在肿瘤细胞内高浓度GSH的刺激下,释放装载的抗肿瘤药物阿霉素DOX,有效地杀伤肿瘤细胞。 体内实验证实该体系可以有效抑制肿瘤生长并减少化疗药物的毒副作用。
抗肿瘤药物药效学指导原则?一、基本原则 1。抗肿瘤药物分类?(1)细胞毒类药物(cytｏｔoxiｃaｇent):包括干扰核酸与蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统得药物等;?(2) 生物反应调节剂(biologiｃａl rｅspｏｎｓe mｏdiｆｉer); (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reveｒsal agent); (4)肿瘤治疗增敏剂(oncotｈerａpy sｅnsitizer);?(5) 肿瘤血管生成抑制剂(tｕmor angioｇe ｎesｉs inhｉｂiｔor); (6)分化诱导剂(ｄifｆeｒentｉation ｉndｕciｎg agent);?(7) 生长因子抑制剂(growth factor iｎhｉbitor);?(8) 反义寡核苷酸(ａnｔiｓｅnｓe olｉgonucleotide)。 ２。抗肿瘤药物药效学需研究内容?２.1 包括体外抗肿瘤试验,体内抗肿瘤试验。 ２、2 评价药物得抗癌活性时,以体内试验结果为主,同时参考体外试验结果以做出正确得结论。?2.３I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究、?二、体外抗肿瘤活性试验 １、试验目得?1。１对候选化合物进行初步筛选;?1、2 了解候选化合物得抗瘤谱; 1。3为随后进行得体内抗肿瘤试验提供参考,如剂量范围、肿瘤类别等。?2。试验方法 选用10—15株人癌细胞株,根据试验目得选择相应细胞系及适量得细胞接种浓度,按常规细胞培养法进行培养;推荐使用四氮唑盐ＭTＴ还原法、XTＴ还原法、磺酰罗丹明Ｂ染色法、或51Cr 释放试验、集落形成法等测定药物得抗癌作用。药物与细胞共培养时间一般为４８-72 小时,贴壁细胞需先贴壁２4 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组,阳性对照用一定浓度得标准抗肿瘤药,阴性对照为溶媒对照。 ３、评价标准 以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线,然后采用Logiｔ法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)、体外试验至少重复一次、?附注:评价药物抗癌活性得方法:? 1.1基本原理:?四氮唑［MTT,３-(４,5—dimｅｔhylｉbiａzol—2-ｙl)-2,5１。 MTT还原法? －diphenyl－tetrazoliuｍｂｒomiｄe]就是一种能接受氢原子得染料、活细胞线粒体中与NADP相关得脱氢酶在细胞内可将黄色得MTＴ转化成不溶性得蓝紫色得甲［月替］(forｍazan),而死得细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后,在一定波长下用酶标仪测定光密度值,即可定量测出细胞得存活率。? 1.2操作步骤: １。2。１选用对数生长期得贴壁肿瘤细胞,用胰酶消化后,用含10％小牛血清得RPMＩl640培养基配成5０00个／ml得细胞悬液,接种在９６孔培养板中,每孔接种２０0μｌ,37℃,5%CO
有关药物基因组学的看法 药物基因组学是以药物效应和安全性为主要目标 ,研究药物体内过程差异 的基因特性，以及基因变异所致的不同病人对药物的不同反应 ,从而研究开发新的药物和合理用药方法的一门新学科。它是基于功能基因组学与分子药理学，从基因水平研究人类个体对药物效应不同的分子机理的学科。药物基因组学的创立,为研究高效、特效药物开辟了新的途径,为患者或特定人群寻找合适的药物及适宜的用药方法。随着1997法国成立了世界第一家独特基因与制药公司和2003 完成了人类历史上每个人的基因都是来自于父母，除了少部分的变异，大部分是一成不变的，由于很多人都会存在某些地方的基因缺陷，所以患上某些疾病的几率会比正常人大很多。而药物基因组学就是针对某个人或某类人专门设计出的药物，从而治疗这些人得上的特有的疾病。王老师曾在课堂上说过有关于东亚人种和欧美人种对于消化牛奶上的区别，并认为东亚人缺少充分消化牛奶的基因，并且以自身举例说喝了牛奶以后特别不舒服。我认为这就是关于基因组差异的一个具体体现。第一个人类基因组序列的测定和图谱的绘制。药物基因组学也走上了快速发展之路。 下面，我想说两点，一是药物基因组学其他科学的关系。二是药物基因组学和新药开发的关系。 一、药物基因组学其他科学的关系 药物基因组学与药物遗传学。药物基因组学虽然起源于药物遗传学,但两者在诸多方面有所不同,要表现在:1研究范畴:尽管两者都是研究基因的遗传学变异与药物反应关系的学科, 但药物遗传学主要集中于研究单基因变异, 特别是药物代谢酶基因变异对药物作用的影响。而药物基因组学除了覆盖药物遗传学研究范畴外,还包括与药物反应有关的所有遗传学标志,药物代谢靶受体或疾病发生链上诸多环节。2应用领域:一般来说,药物基因组学可应用于从药物发现、开发到临床应用的各个领域,较药物遗传学更广。 药物基因组学与基因组学相关学科。人类基因组学研究包括系统地测定和鉴别所有人类基因及基因产品,分析人类基因遗传学变异及不同基因在不同健康或疾病状态下的表达等。药物基因组学利用基因组学研究技术和方法,研究具有不同基因特征人群对药物治疗的反应,它是基因组学在药物开发和药物治疗学领域
药效学实验报告 一、材料 1、药物：辽宁省灯塔市李学军先生提供的天然药口服液，其组成及制备过程由送药人掌握。 2、动物：系体重18~22克纯系昆明白小鼠，周龄为8~10周，雌雄各半，由中国医科大学动物部提供。 3、瘤株：肝癌H22，肺癌Lewis、S180均由辽宁省肿瘤医院中心实验室提供。 二、方法： 取生长良好的小鼠可移植肿瘤、肝癌H22、肺癌lewis和S180，按抗肿瘤药药效学实验技术要求常规接种小鼠。接种24小时后分组给药，荷每一种癌瘤的小鼠随机分为三组：组1为空白（阴性）对照组（以下称对照组）；组2为化疗药（阳性）对照组（以下简称化疗组）。组3为实验药物组（以下简称实验组）。每组15只小鼠。 对照组给药每日用生理盐水灌胃二次，每次0.5ml。化疗组依据实验瘤株对化疗药物的敏感性选择环磷酰胺或5—Fμ。环磷酰胺按60mg/kg的计量腹腔注射一次，5—Fu25mg/kg的剂量灌胃给药连续9天。实验组每天每只鼠灌胃用天然药口服液二次，每次0.5ml，连用9天。停药后48小时每组处死8只动物，断头采血，取脾并称瘤重，待检测各项指标。继续观察其余动物的存活天数。 三、观察指标 1、实体瘤的重量和抑瘤率：
化疗组（实验组）瘤重—对照组瘤重 抑瘤率% = ————————————*100% 对照组瘤重 2、生存天数和生命延长率，记录停药后到动物死亡的天数，计算生命延长率： 治疗组平均存活天数—对照组平均存活天数 生命延长率% = ———————————————* 100% 对照组平均存活天数 3、NK细胞杀伤活性：用LDH释放法检测NK细胞杀伤活性，效应细胞为鼠脾细胞，靶细胞为YAC—1细胞（辽宁省肿瘤医院中心实验室提供）效耙比为50 ：1 实验孔OD值—自然释放孔OD值 NK细胞活性=————————————* 100% 最大释放孔OD值—自然释放孔OD值 四、结果：见表 1—5 表1 ：荷肺癌lewis的各组小鼠实体瘤瘤重比较（x + S） 体重（g）瘤重（g） P值抑瘤率对照组 20.2 3.62+0.87 ┄┅ 5 — F u 20.4 1.34+0.65 〈0.001 63.0 实验组 20.4 1.25+0.51 〈 0.01 65.5 表2：荷肝癌H22各组小鼠实体瘤的比较（x + s） 体重（g）瘤重（g） P值抑瘤率对照组 20.6 4.28+0.74 ┄┅ 环磷酰胺 20.7 1.95+0.56 〈0.001 54.4 实验组 20.2 2.11+0.1 〈0.001 48.4
九、化学制剂临床前药效学与安全性研究技术指导原则 根据《医疗机构制剂注册管理办法》（试行）的有关要求，参照国家食品药品监督管理局颁布的化学药物研究技术指导原则，结合化学制剂的特点，制订本技术指导原则。其目的是指导医疗机构进行化学制剂的临床前药效学与安全性研究，明确免报该项研究资料的条件及范围，为化学制剂临床前有效性、安全性评价提供明确统一的研究技术要求。 （一）一般要求 1.实验管理 根据《中华人民共和国药品管理法》、《药品注册管理办法》，药物临床前安全性评价研究应遵循《药物非临床研究质量管理规范》（GLP)。 2.研究机构条件 研究机构必须是已在国内外相关机构注册（或备案）、从事药品安全性、有效性评价的具有法人资格的机构。应具有相关研究领域的设施设备及相关资质。 3.实验环境 应与实验动物级别相应的实验环境。实验动物使用单位必须是已经取得相应实验动物使用许可证的单位。 4.研究人员资质 所有参加研究的人员必须接受过相关领域的正规训练，其项目负责人必须是相关专业领域的副高职称及以上的人员。 5.试验样品/对照药物要求 临床前药效学与安全性研究试验所用样品，应当采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。应提供所用溶媒和/或辅料的批号、规格、生产厂家。对照药物原则上应采用已上市的、适应症相同或类似且疗效公认的药物。 6.试验设计 试验设计应符合随机、对照、重复的原则。 7.具体问题具体分析 化学制剂情况复杂，本指导原则不可能涵盖化学制剂临床前安全性与有效性研究
抗肿瘤多级纳米药物递送系统的研究 基于聚合物的纳米药物递送系统用于增强化疗药物抗肿瘤治疗具有重要的研究与应用价值。然而,纳米药物进入体内后会面临血液、肿瘤等形成的多重生理障碍。 因此,如何通过改变纳米药物载体纳米特性,克服体内多重生物屏障,实现靶部位有效药物输送仍旧面临多种挑战。本论文主要集中于设计整合多种纳米特性药物递送系统,针对性克服纳米药物体内输送多重障碍,增强药物抗肿瘤作用。 本论文的研究内容主要分为两个部分:1、发展了一种基于肿瘤组织微酸性环境刺激响应性集束化纳米药物载体以协同克服多重药物递送障碍。该纳米载体通过肿瘤组织微酸环境响应化学键桥连的聚己内酯-树枝状大分子聚酰胺胺(PCL-CDM-PAMAM)和聚乙二醇-聚己内酯(PEG-b-PCL)以及聚己内酯(PCL)共组装而成,同时将铂类抗肿瘤药物键合于树枝状大分子PAMAM上。 PEG-b-PCL在纳米载体表面形成PEG层以避免其在血液中快速清除,PCL用于调控颗粒的尺度以及稳定性。集束化纳米药物载体可以在体内药物输送中的血液环境,肿瘤微环境以及肿瘤细胞内环境中各自发挥其功能。 在生理环境下,集束化纳米载体保持约100 nm的尺度,具有良好的血液长循环效应,从而通过肿瘤组织不完整的血管溢出,增强药物在肿瘤部位的富集;当集束化纳米药物进入肿瘤组织后,在微酸性肿瘤环境下(pHe,～6.5-7.2)触发小尺寸颗粒(PAMAM)的释放,携载药物进一步穿透整个肿瘤组织,与更多的肿瘤细胞接触,进而促进肿瘤细胞对药物的摄取。当进入到肿瘤细胞内部,键合的顺铂前药在细胞内部的还原环境下转变为顺铂并杀伤肿瘤细胞。 研究结果表明这种多级的纳米药物输送策略能够有效增强抗肿瘤药物在肿
抗肿瘤药物临床试验技术指导原则 一、概述 恶性肿瘤是严重威胁人类生命的一类疾病，尽管现有治疗手段取得了一定疗效，但多数肿瘤患者生存时间有限，缺乏有效的可以治愈的药物，亟需开发新的药物来满足需要。在抗肿瘤药物的风险效益评估中，医护人员和患者可能愿意承受相对较大的安全性风险，所以抗肿瘤药物的临床研究除遵循一般药物临床研究原则外，还应考虑其特殊性。由于肿瘤生物学研究的进展，一些新的作用机制、作用靶点的抗肿瘤药物不断涌现，呈现出不同于以往传统细胞毒类药物的安全性和有效性特点；肿瘤疾病的药物治疗也从以往的单纯追求肿瘤缩小向延长患者的生存期、提高生存质量转变，这些改变使抗肿瘤药物临床疗效评价终点指标也出现较大改变。因此，传统的抗肿瘤药物开发模式已经变得不适宜，需要更多地探索能加快和促进开发进程的临床研究策略。 本指导原则将对抗肿瘤药物临床研究一般考虑进行阐述，重点阐述在不同临床研究阶段中需要重点考虑的问题，旨在为抗肿瘤药物临床研究的设计、实施和评价提供方法学指导。申请人在进行临床研究时，还应当参照国家食品药品监督管理局（以下简称SFDA）既往发布的相关指导原则和《药物临床试验质量管理规范》（GCP）要求进行，对于一般药物临床研究需要遵从的原则以及与其他指导原则重复内容在本文中不再赘述。 本指导原则主要适用于抗肿瘤新化合物的临床研究，抗肿瘤生物制品也可参考部分内容，不适用于中药制剂。药物类别上主要针对细胞毒
类抗肿瘤药物临床研究，由于非细胞毒类药物（如信号传导抑制剂，生物反应调节剂，激素类等）是目前新药开发的主要方向，本指导原则也将尽可能对此类别药物临床研究的不同之处进行阐述。 本指导原则中的观点仅代表SFDA当前对抗肿瘤药物临床研究的一般性认识，不能涵盖在新药研发中遇到的所有情况，申请人在研究中应始终坚持具体问题具体分析的原则。尤其应注意的是，抗肿瘤药物研究理论和技术的快速发展，很可能对将来抗肿瘤药物开发模式产生影响，因此申请人可以积极探索更为科学合理的研究方法，并及时寻求SFDA 药品注册部门的建议。 二、临床研究的总体考虑 抗肿瘤药物的临床研究过程通常分为Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验。Ⅰ期临床试验主要目的是对药物的耐受性、药代动力学进行初步研究，为后期研究给药方案的设计提供数据支持；Ⅱ期临床试验主要是探索性的研究，如给药剂量探索、给药方案探索、瘤肿有效性探索等，同时也观察安全性；Ⅲ期临床试验则在Ⅱ期基础上进一步确证肿瘤患者临床获益情况，为获得上市许可提供足够证据。 需要指出，这种临床研究的分期并不是固定的开发顺序。在本指导原则中，尽管对Ⅰ、Ⅱ期探索性试验和Ⅲ期确证性试验区别对待，但统计假设的建立和检验也可以成为Ⅱ期临床试验的一部分，同样，部分探索性研究也可能成为Ⅲ期临床试验的一部分。 由于Ⅲ期临床试验需要提供生存获益的疗效数据，试验周期较长，因此可以采用探索的开发模式，按照预定的中期分析计划，依据不断积累的信息，对临床试验方案进行调整。
抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则 一、基本原则 1. 抗肿瘤药物分类 (1) 细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等； (2) 生物反应调节剂(biological response modifier)； (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)； (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)； (5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)； （6）分化诱导剂(differentiation inducing agent)； (7) 生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)； （8）反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 。 2. 抗肿瘤药物药效学需研究内容 2.1 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。 2.2 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 2.3 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。 二、体外抗肿瘤活性试验 1. 试验目的 1.1 对候选化合物进行初步筛选； 1.2 了解候选化合物的抗瘤谱； 1.3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。 2. 试验方法 选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。
智能抗肿瘤药物递送系统的设计及体外评估近年来,基于肿瘤微环境与正常组织微环境之间的差异来设计抗肿瘤药物递送系统,在肿瘤治疗过程中占据着越来越重要的地位。由于纳米抗肿瘤药物递送系统能改善目前所用化疗药物的安全性及提高治疗效果,因此纳米抗肿瘤药物递送系统的研究和应用引起了广泛的关注。 此外,为了进一步增强治疗效果,这些纳米抗肿瘤药物递送系统被设计为基于内部刺激的纳米药物递送系统,即pH敏感药物递送系统,还原敏感纳米药物递送系统,及基于外部刺激的纳米药物递送系统,例如光辐射纳米药物递送系统。基于此,为了改善化疗药物的安全性及提高治疗效果,本论文基于不同的材料(譬如天然聚电解质、可控合成的嵌段共聚物及氧化石墨烯)构建具有不同结构的抗肿瘤药物递送系统,而且不同的相互作用(譬如静电相互作用、疏水相互作用及π-π相互作用)被用来有效地负载抗肿瘤药物阿霉素。 此外,这些抗肿瘤药物递送系统具有如pH、还原及光响应特性,而且集靶向性、低细胞毒性、可降解性及分子成像特性与一身。本论文主要包括以下几个部分。 首先,我们通过层层自组装方法将FITC功能化壳聚糖及透明质酸钠(分别作为聚阳离子及聚阴离子)包覆在磺化聚苯乙烯微球模板上,最后一层控制为乳糖酸功能化壳聚糖,再刻蚀去除磺化聚苯乙烯模板从而制备了该具有pH敏感荧光肝靶向功能的聚电解质空心微球(CSFITC/HA)4/GC。其粒径约为260 nm,且动态光散射分析表明其具有pH及离子强度双重响应特性。 经实验表明,该聚电解质空心微球具有pH敏感荧光、肝靶向功能及低细胞毒性。在此基础上,为了简化实验步骤,缩短实验周期,通过聚电解质共沉淀法将乳
药物基因组学 PART 01 药物基因组学 一、药物基因组学 药物基因组学：是研究人类基因变异和药物反应的关系，利用基因组学信息解答不同个体对同一药物反应存在差异的原因。 基因组（genome）：是指生物体单倍细胞中一套完整的遗传物质，包括所有的基因和基因间区域（即编码区和非编码区）。 人类基因组计划是由序列（结构）基因组学向功能基因组学的转移。开启了人类的“后基因组时代”。 后基因组时代研究的重要方向： 功能基因组学 比较基因组学 结构基因组学 蛋白质组学 药物基因组学 …… PART 02 基因多态性 二、基因多态性 基因多态性是指在一个生物群体中，呈不连续多峰曲线分布的一个或多个等位基因发生突变而产生的遗传变异。 CYP450酶超大家族 共涉及1000种药物的代谢（拓展） 12种亚型：CYP1、CYP2、CYP3…… 15个亚家族：A～Q 如：CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A5等 药物转运蛋白－MDR1（多药耐药基因）（拓展） 调控许多药物吸收、分布和排泄过程 与胆红素、抗癌化疗药物、强心苷、免疫抑制剂、糖皮质激素、HIVⅠ型蛋白抑制剂有关 药物靶蛋白－ADRB2 编码人β2肾上腺受体 人类白血球抗原－HLA－B HLA－B变异，将引起某些药物的严重皮肤反应 内容： 1.药物代谢酶的多态性 同一基因位点上具有多个等位基因引起，其多态性决定表型多态性和药物代谢酶的活性，造成不同个体间药物代谢反应的差异。是产生药物毒副作用、降低或丧失药效的主要原因之一。 细胞色素P450酶（CYP）是药物代谢的主要酶系。在细胞色素P450的亚群中，CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19对许多药物的效应非常重要。（拓展） 例： 奥美拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑等质子泵抑制剂由P450酶代谢，主要由CYP2C19，部分由CYP3A4代谢。 因此，CYP2C19的基因多态性会影响质子泵抑制剂的药动学，从而影响后者治疗相关疾病的临床效果。 艾司奥美拉唑仅经CYP3A4代谢。 2.药物转运蛋白 在药物的吸收、排泄、分布、转运等方面起重要作用，其变异对药物吸收和消除具有重要意义。
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。 研究计划： (a)小鼠急性毒性测试
按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 (b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 (c)专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 （d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g）动物体内药物代谢动力学实验
宠物用抗蠕虫药物药效评价试验指导原则 一、概述 （一）定义与目的 宠物（犬、猫等）用抗蠕虫药物是指用于预防和治疗宠物蠕虫感染的各种化学药品及制剂。宠物用抗蠕虫药物药效评价试验是评价宠物用抗蠕虫药物的剂量确定试验，也称Ⅱ期临床试验，目的是了解不同剂量的受试药物对靶动物的抗蠕虫效果，确定受试药物的治疗作用及剂量。 （二）适用范围 本指导原则适用于申报防治宠物蠕虫感染的所有抗蠕虫药物，包括我国未批准在宠物用的抗蠕虫药物及各种制剂，或者改变已批准药物在其他宠物使用，均应进行药效评价试验。按每种适应症进行试验，一般采用人工诱发感染，条件不允许时也可选择自然感染病例。人工诱发感染可以选择少量最新野外分离的蠕虫株进行诱导感染；对于稀有蠕虫种类可以使用实验室保存的蠕虫株进行诱导感染。对于幼虫阶段的蠕虫应当使用诱导感染；选择自然感染病例，研究受试药物对蠕虫成虫的药效；对于定居阶段的蠕虫只能使用自然感染病例。不能选用对药物有耐药性的蠕虫种进行本试验。 二、试验设计 （一）试验动物 1.品种：应与药物申报应用的动物相同，品种不限，注明动物品种、体型、体重、性别和年龄。避免使用可能过敏或中毒的动物。以成年动物为主，若药物拟用于幼年动物，则需要选择幼年动物。 2.来源：选用人工诱发感染，动物应健康，从有试验动物资质证明的饲养单位购买。如果
没有资质证明，动物应来源清楚，并经检疫合格后才能用于试验；选用符合受试药物目标适应症的自然感染病例，每组试验动物的年龄、体型大小、体重范围、性别等应尽量一致，应来源清楚，饲养规范，动物主人能较好执行临床兽医医嘱。 3.数量：选用人工诱发感染，每组不少于（含）6只；选用自然感染病例，每组不少于（含）10只。 4.自然感染病例动物选择标准：试验前制定试验动物的选择标准，注明其品种、体型、体重、性别和年龄。试验前用过药物的动物、患过传染病或患过敏症的动物，均不应入选。动物一般需要7天左右的时间适应实验环境和驯服。 自然感染病例的选择是根据粪便中蠕虫虫卵的排出或者节片的排出。对于犬恶丝虫而言，应根据寄生虫学或者免疫学方法进行选择。每个试验组的动物应当加以标记，用适当的方法进行重复，并在最终的报告中标明。 5.人工诱发感染病例 （1）人工诱发感染推荐使用的寄生虫种类与数量 ①可以人工诱发感染犬的寄生虫种群数量应根据分离的种群数量而定，最终报告中应记录犬感染的幼虫或虫卵数量。 犬常用蠕虫感染种类及其推荐数量范围 感染部位寄生虫数量范围 小肠犬弓首蛔虫100～500* 狮弓首蛔虫200～300 犬钩虫100～300 巴西钩口线虫100～300 窄头钩虫1000～5000 粪类圆线虫1000～5000 细粒棘球绦虫20000～40000 绦虫属5～15