枯草杆菌1和枯草杆菌2的
原生质体融合育种
一、细菌原生质体融合育种总述：
原生质体融合是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍——细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。Fodor和Schaeffer于1976年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质体融合现象得到证实，并建立了相应的实验体系。从此，原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现跨界融合。
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，革兰氏阳性菌细胞壁组成是肽聚糖、磷壁酸和一些多糖蛋白质。肽聚糖的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键交替连接而成。溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁都有一定的降解作用，溶菌酶是作用于细菌细胞壁肽聚糖主链的β-1,4糖苷键上；而青霉素的作用机制是竞争性地与转肽酶结合，阻碍了侧链的交联，作用在代谢时发生，因此必须在细菌生长分裂时期才有效。
细菌原生质体融合育种程序一般是：
1、菌株选择和遗传标记
2、原生质体制备和再生
3、原生质体融合
4、融合体再生与检出
5、重组子分离和遗传分析
二、枯草芽孢杆菌融合育种的重要意义
枯草芽孢杆菌是一种常见的有益菌，它可以净化水质，分解许多种有机质，通过融合育种可以将枯草芽孢杆菌1、2两个亲本的优良性状集中体现在融合细胞中，具有重要的遗传学意义。
通过筛选成功融合并能稳定遗传的工程菌投入生产，将产生巨大
的经济效益和社会效益。
三、枯草芽孢杆菌原生质体融合育种具体步骤
（一）培养基和溶液
1、常用培养基
（1）CM培养基（%）：牛肉膏0.5，蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母膏
0.5，NaCl 0.5,pH 7.2。
(2) DM3培养基：1mol/L琥珀酸钠500ml, 5%水解酪蛋白100ml， 10%
酵母膏50ml，3.5% K2HPO4和1.5% KH2PO4100ml, 20%葡萄糖25ml，
1mol/LMgSO420ml，2%牛血清蛋白5ml，4%琼脂200ml。
（3完全再生培养基：CM培养基中加入高渗溶液。
2、高渗溶液
DF溶液（mol/L）：蔗糖0.25，琥珀酸钠0.25，EDTA 0.001，K2HPO4 0.02，KH2PO4 0.11，MgCl2〃6H2O 0.01，pH 7.0。
SSM溶液(mol/L): 蔗糖0.5，顺丁烯二酸0.02，MgCl2〃6H2O 0.02，
pH 6.5。
HM溶液（%）：NH4Cl 0.1, Tris 1.2, KCl 0.0035, NaCl 0.0058,
Na2SO4〃10H2O 0.03, MgCl2〃5H2O 0.01, pH7.0。
（二）枯草芽孢杆菌原生质体的制备
1、培养枯草芽孢杆菌
取亲本菌株枯草芽孢杆菌1、2新鲜斜面分别接一环到装有液体
完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接
入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3
h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度
为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。
2、收集细胞
各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体
悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM
中，每mL 约含108～109 活菌为宜。
3、总菌数测定
各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。
4、脱壁
两株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。
5、剩余菌数测定
取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。
计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。
（三）枯草芽孢杆菌原生质体再生
上述原生质体悬浮液适当稀释后，取0.1ml接种于DM3再生培养基上，迅速加入0.8%琼脂的相同成分培养基4ml，轻轻摇匀，双层平板30℃培养3～4d，计算再生菌落数，为原生质体和少量未酶解细胞数之和;原生质体悬液用无菌水破坏原生质体后也涂布、培养，生长出的菌落，为未酶解的细菌细胞。并可计算制备率和再生率。
（四）枯草芽孢杆菌原生质体融合
原生质体融合方法是取等量的两种不同菌株的原生质体悬浮液，加入新制备或在HM中保存的原生质体溶液混匀，4000r/min离心10min，沉淀物转入新鲜的HM原生质体保存溶液中，加入40%聚乙二醇4000,40℃下静置1～3min。然后加入10倍左右的HM液，离心弃上清，用再生培养基适当稀释，分别接种在完全再生培养基和选择性基本培养基上培养、再生。基本培养基上生长的菌落可初步判定为融合子。同时另取单一亲本及不加PEG的双亲本原生质体混合液分别作为对照，以计算融合率。
（五）融合体的再生和检出
融合原生质体与非融合原生质体一样对外界条件异常敏感，必须悬浮于一定的高渗溶液中。再生培养基要加入某些物质作为渗透压的稳定剂，这与制备原生质体时是相同的。再生培养基可以采用添加Ca2+、Mg2+的完全培养基，或者是高渗基本培养基。含有融合原生质体的悬浮液分离在完全培养基上，不管已融合的还是非融合的原生质体都有可能再生而长出菌落。在基本培养基上则只有那些营养得到互补的融合体才能得到再生而长出菌落，但营养贫乏，再生速度慢，频率低。枯草杆菌融合体再生方法与原生质体再生方法相同，即使用DM3再生培养基双层平板培养。
融合体的检出方法有很多，如利用营养缺陷型标记选择、利用抗药性选择、用灭活原生质体检出融合体、利用荧光染色法选择等等。在本实验中，因不知枯草杆菌1、2亲本有无营养缺陷和抗药基因且如果添加营养缺陷型标记或抗药标记可能会使亲本优良性状丧失或降低，故我们采用荧光染色法选择融合体。
荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑选同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。常见的荧光染色剂有EGFP（增强绿色荧光蛋白）、CFSE(即CFDA-SE，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)、Calcein-AM（钙黄绿素-AM）等。具体方法是：制备原生质体时在酶解液中加入荧光色素，使双亲原生质体分别携带不同的荧光色素标记。它对原生质体活力无影响，携带色素的原生质体能正常进行融合并具有再生能力。融合处理时在荧光显微镜下能观察到融合过程并通过显微操作仪，直接挑选出已发生融合而带有两种荧光色素的融合体。使用这种方法时，要注意染料的浓度和处理时间，同时染料不能对原生质体形成、再生有影响，用于双亲染色的荧光物质颜色分辨要明显，色素有效处理时间不能超过24小时。
（六）重组子分离与遗传分析
具有两种优良性状的亲本枯草杆菌融合后，融合子将集两种性状于一身，所以重组子分离我们可以将融合产物直接分离在基本培养基上或选择性培养基平板上，期中融合体由于营养互补或具有双重抗药性等等，经过再生，长出的菌落为融合菌落，同时
还涂布于完全培养基上，以作对照，则可直接检出融合细胞。最后在基本培养基上检出原养型的融合重组子，注意进行两亲株互养试验，以排除因交叉互养或转化而形成原养型菌落的可能。
为了确证所筛选的重组体，还需要对其进行传代稳定性试验和进一步鉴定。主要包括形态学、生理生化特性和遗传特性研究，如菌落颜色与形态、细胞电镜比较、DNA含量、代谢产物产量以及同工酶谱测定等。
四、参考文献与网站
施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学.第二版.北京:科学出版社,2003,296~329.
岑沛霖,蔡谨.工业微生物学.第二版.北京:化学工业出版社,2008,240~243.
https://www.doczj.com/doc/c111170425.html,/view/6057619.html
https://www.doczj.com/doc/c111170425.html,/view/8988a725a5e9856a561260bf.html
https://www.doczj.com/doc/c111170425.html,/p-40628787843.html
https://www.doczj.com/doc/c111170425.html,/Read/Read.aspx?id=9902250#
灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体诱变育种实 验研究 （作者： _________ 单位： ___________ 邮编：___________ ） 【摘要】目的：建立采用紫外线和氯化锂诱导灭蚊真菌发生突变的方法，为培育理想菌株开辟新的途径。方法：对出发菌株贵阳腐霉的原生质体进行诱变处理，通过正突变率与紫外、化学诱变剂量的相互关系，确定最佳诱变条件，经过酪蛋白平板透明圈和菌粉得率粗筛突变株，连续8代传代培养及摇瓶实验检测突变株的遗传稳定性。结果：当用0.6%氯化锂处理90 min时，突变株的致死率和正突变率分别为86.9%和26.9% ;用20 W紫外灯30 cm照射180 s，突变株致死率为81.3%、正突变率为78.5% ;筛选了7株突变株，其中U22经传代实验证明其遗传性状稳定。结论：本研究所建立的对贵阳腐霉原生质体诱变系统基本成功，为该菌的细胞工程育种创造了条件。 【关键词】贵阳腐霉；原生质体；紫外线；氯化锂；诱变；育种 [Abstract ] Objective： To establish a mutation induction system for mutati on breed ing of Pythium guiya ngense Su, a fungal pathogen of mosquitoes. Methods: Protoplasts of original strain were treated with UV or LiCl for mutatio n in ducti on. Case in plate tran spare
nt loop method and mycelial weight determ ine were used to scree n muta nt col on ies. Pert inent in ducti on con diti on comb in ati on were summarized based on the an alysis of the relationship between the positive mutation rates and treatment dosages and periods of UV or LiCl. One of the mutational colonies was continu ously cultivated for 8 gen erati ons on KPYG2 plates for the observation of genetic stability. Results: A lethal rate of 86.9% and a positive mutation rate of 26.9% were achieved when the protoplasts were treated by 0.6% of LiCl for 90mins, and a lethal rate of 81.3% and a positive mutati on rate of 78.5% were obta ined when the protoplasts were irradiated by a UV lamp of 20W in a dista nee of 30cm for 180s. Seve n muta nts were obta in ed, and one of them, U22, was proved genetically stable. Conclusions: The mutation induction system of P. guiyangense by UV and LiCl is successful, and can provide basis for the mutati on breedi ng of P. guiya ngense in the future. [Key words ] Pythium guiyangense Su; protoplasts; ultraviolet rays; lithium chloride; mutation breeding 丝状真菌贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su )具有灭蚊 能力强，繁殖速度快，易于人工培养以及对其它非靶生物相对安全等优点［1］，在蚊虫生物防治中具有潜在的应用前景。但是，与大多数 微生物一样，贵阳腐霉在人工培养基经过多次传代后其毒力和产孢量会有所下降；同时，与大多数丝状真菌一样，其有效贮藏期不够长。 为将贵阳腐霉真正用于灭蚊，提高其灭蚊能力和延长有效贮藏期，对贵阳腐霉进行了改良。微生物改良育种方法较多，原生质体诱变技术是一种行之有效的方法［2，3］。杜海英［4］等通过原生质体诱变选育乳糖酶高产菌株。目前有关利用原生质体紫外诱变和氯化锂诱变提高丝状真菌遗传稳定性方法报道较少。贵阳腐霉是发现的新种，其诱变研
XXXX学校XXXXXX学院毕业设计（论文）文献综述 学生姓名：学号： 专业：生物工程 班级： 设计（论文）题目： 指导教师： 二级学院： 2010年月日
题目 学生：学号：班级： 导师： 摘要：原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛.文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用,并展望了原生质体融合技术的发展前景。 关键词： 引言：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生[5]。 1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽
微生物原生质体融合育种技术及其应用 摘要： 工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。 关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组 引言： 微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。 1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。 1 资料和方法： 1.1 资料来源 由第一作者在CNKI进行检索。网址：https://www.doczj.com/doc/c111170425.html,/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。 1.2 入选标准 纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。
原生质体融合技术的局限性 植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。 植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。 原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。 1.技术局限性 植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。 1.1诱导原生质体融合 诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。 而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。 1.2杂种细胞的选择 为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法： 1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来； 互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。 1.2.2机械选择法 利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异
酵母原生质体融合 ××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。 原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。 两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。 本实验将通过酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70的融合，以期获得具有更高发酵效率的酿酒酵母新品种并应用于制酒工业，在节省酿酒粮食的投入量前提下提高发酵产量。以期获得更好的经济价值。 1.材料与方法 1.1 材料
大型真菌原生质体融合技术研究进展 1 发展史 由于原生质体技术的形成，去除了细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代，而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融合，其融合率低于10-6。之后，人们又利用一些化学试剂，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等进行融合，效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融 合中来，使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功，推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。 日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中，人们已从54种食用菌中分离到原生质体；已进行了种内10种、种间19种，属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大，有残留毒性。1979年森达(Senda)，1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术，电融合技术操作简单、无化学毒性，对细胞损伤小，融合率高。以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。 2 原生质体融合中亲本的选择标记 原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。
细菌原生质体融合实验步骤 一、实验目的 了解原生质体融合技术的原理。 学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。 二、实验原理 原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。 (一)、原生质体融合的优点 (1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2)、基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 (二)、原生质体融合步骤 (1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。 (2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。 (3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。 (4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。 (5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。 (6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。 (三)、原生质体再生率和融合率计算 三、实验材料 (一)、菌种： 枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro- (二)、培养基(配制方法见下一页附录)： (1)、完全培养基(CM，液体)； (2)、完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂； (3)、基本培养基(MM)； (4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min； (5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。 (6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。 (三)、缓冲液：
枯草杆菌1和枯草杆菌2的 原生质体融合育种 一、细菌原生质体融合育种总述： 原生质体融合是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍——细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。Fodor和Schaeffer于1976年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质体融合现象得到证实，并建立了相应的实验体系。从此，原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现跨界融合。 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，革兰氏阳性菌细胞壁组成是肽聚糖、磷壁酸和一些多糖蛋白质。肽聚糖的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键交替连接而成。溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁都有一定的降解作用，溶菌酶是作用于细菌细胞壁肽聚糖主链的β-1,4糖苷键上；而青霉素的作用机制是竞争性地与转肽酶结合，阻碍了侧链的交联，作用在代谢时发生，因此必须在细菌生长分裂时期才有效。 细菌原生质体融合育种程序一般是： 1、菌株选择和遗传标记 2、原生质体制备和再生 3、原生质体融合 4、融合体再生与检出 5、重组子分离和遗传分析 二、枯草芽孢杆菌融合育种的重要意义 枯草芽孢杆菌是一种常见的有益菌，它可以净化水质，分解许多种有机质，通过融合育种可以将枯草芽孢杆菌1、2两个亲本的优良性状集中体现在融合细胞中，具有重要的遗传学意义。
原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用 摘要原生质体融合技术是微生物遗传育种中的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。文章从原生质体融合的特点以及融合技术应用等方面进行了综述。 关键词原生质体；原生质体融合；遗传育种’ 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。 两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。 一、原生质体融合的特点 1.杂交频率较高 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。 2.受接合型或致育性的限制较小 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制就比较小。 3.重组体种类较多 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触.有机会发生多次交换，可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体 二、原生质体融合技术的应用 在微生物育种中，常根据不同需求通过原生质体融合技术培育出优质、高产、抗逆性强等优点的微生物菌种。 1.标记菌株的筛选
原生质体的分离、融合与培养 一、实验目的 1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。 2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。 3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。 二、实验原理 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 三、实验材料、试剂与仪器
1．材料 新鲜的菠菜叶片 2．试剂 （1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。 （2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。 （3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。 （4）W5溶液：154mmol/LNaCl、125 mmol/LCaCl2、5 mmol/LKCl、和2 mmol/LMES （pH5.7） （5）MS母液：依次加入，大量元素mg/L、微量元素mg/L、铁盐mg/L、有机物质mg/L。 （6）0.2mol/LCaCL2，pH6.8磷酸缓冲液，植物激素，13％CPW洗液、20％蔗糖溶液、无菌蒸馏水0.1% HgCl2 3.试剂 三角瓶、离心管、离心机、烧杯、解剖刀、镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、