多肽类药物
多肽类药物
多肽和蛋白质类生物药物按药物的结构分类可分为：氨基酸及其衍生物类药物、多肽和蛋白质类药物、酶和辅酶类药物、核酸及其降解物和衍生物类药物、糖类药物、脂类药物、细胞生长因子和生物制品类药物。
结构分析
多肽的定性至少应包括氨基酸分析、序列分析及质谱分析。纯肽的氨基酸分析可提供该多肽的氨基酸组成和数量。序列分析则提供氨基酸残基的精确排列顺序。基于多种技术的质谱, 如快原子轰击、电喷雾、激光解吸, 经常用于提供多肽的相对分子量及其序列信息。肽谱是蛋白质或
多肽通过酶解得到的肽片段经分离和分析所得到的“指纹图谱”。当多肽含有20 个以上的氨基酸残基时, 肽谱分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。
2. 1 氨基酸分析
用于氨基酸分析的水解方法主要是酸水解, 同时辅以碱水解。酸水解中使用最广泛的是盐酸(一般浓度为6mo l?L )。多肽于110 ℃真空或充氮的安瓿瓶内水解10～24 h, 然后除去盐酸。水解过程中氨基酸遭破坏的程度与保温时间有线性关系, 因此该氨基酸在多肽中的真实含量可通过以不同的保温时间对相应时间的样品中该氨基酸的含量作图, 用外推法求出。高氨基酸分析仪的使用使氨基酸的分析越来越准确, 如W aters 公司的氨基酸分析系统的检出限已
达100 fmo l。
2. 2 序列分析
氨基酸测序主要为化学法, 酶法也有一定的意义。化学法以Edman 降解法最为经典, 它对所有氨基酸残基具有普适性和近乎定量的高产率, 是近50年N 2端顺序分析技术的基础。Edman 机理的液相(旋转杯) 自动蛋白顺序分析仪在1967 年推出。近年来不断对其改进, 其灵敏度已达到可以对0. 1pmo l 的样品进行常规分析。
2. 3 质谱(mass spect romet ry,M S)
质谱以质量分析为基础, 可提供化合物的分子量以及一些结构信息。1980 年代以后发展了许多新的“软电离”技术, 使其在蛋白质多肽分析中的应用越来越广。目前应用较多的有原子轰击、电喷雾和基质辅助激光解吸质谱。质谱测序
是对Edman 降解的一个很好补充, 它可对N 2端封闭的多肽进行测序; 并可以通过碰撞诱导断裂(C ID ) 得到部分至完全的序列信息后, 作出M S2肽谱, 这可对修饰的氨基酸残基定性, 并确证其位置。而且质谱技术与分离技术如HPLC、HPCE 直接相连可相互验证, 同时还可对混合肽进行测序。
2. 3. 1 快原子轰击质谱(fast atom bombardmen t2mass spect romet ry, FAB2M S)FAB2M S 克服了传统质谱中样品必须加热气化的限制, 可对热不稳定、难挥发的蛋白质多肽进行分析。与其他质谱技术相比, FAB2M S 更适合于小分子多肽的检测[6 ]。FAB2M S 测定肽的氨基酸序列具有用量少、方便和快速的优点。一些寡肽, 特别是人工合成的
有保护基的寡肽在遇到N 2端封闭不宜用氨基酸序列仪测定其结构的情况下, 有可能用少量样品采用FAB2M S 直接获得寡肽的分子量和氨基酸序列。俞振培等[7 ]用FAB2M S 对7 个带有不同保护基的3～5 肽成功地进行了氨基酸序列研究。串联FAB2M S 将第一次轰击得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击, 使肽链在不同部位断裂, 从而得到一组片段的质谱信息, 使多肽测序得以实现
2. 3. 2 电喷雾质谱(elect ro sp ray ion izat ion2massspect romet ry, ES I2M S)
ES I2M S 由于可以产生多电荷峰, 与传统质谱相比扩大了检测的分子质量范围, 提高了灵敏度, 可以得到准确的分子量。ES I2M S 可分为正离子和负离子, 一般多肽和蛋白质的ES I2M
S 分析总是以正离子方式进行。ES I2M S 的最大优势是可直接与HPLC、HPCE 联用, 能在多肽酶解后得到HPLC 或HPCE 肽谱的同时得到一张精确的质量肽谱(肽谱和质谱的结合称为质量肽谱)。ES I2M S 在质量肽谱图中能得到分子量低于400u 的小分子肽段, 可以鉴
定一些在其他质量肽谱图中不能区分的肽谱[9 ]。在质量肽谱中应用ES I2M S 可提供一种快速证实多肽氨基酸序列的方法。ES I2M S 所产生的多电荷离子特别适用于串联质谱分析, 用来检测目标肽段, 可得到完全的序列信息。王贤纯等[10 ]运用串联ES I2M S
解析出7 肽及其修饰产物、10 肽、20 肽的氨基酸序列。
2. 3. 3 基质辅助激光解吸质谱(mat
rix2assistedlaser deso rp t ion ion izat ion2mass spect rometry,MALD I2M
S)MALD I2M S 克服了直接用激光解吸离子化的缺陷, 为分析非挥发性、热不稳定的大分子提供了一种较好的离子化方式。它的最大优点是允许样品中含有几百毫摩尔的缓冲液及表面活性剂, 且灵敏度比别的离子化方式高, 可至fmo l 级[11 ]。MALD I2M S
能有效地分析较复杂的肽混合物, 特别适合混合蛋白质多肽类物质相对分子量的精确测定。周红华等[12 ]用基质辅助红外激光解吸质谱法确证了3 种寡肽的一级结构, 为测定寡肽的分子量和一级结构提供了一个简便、快速、准确的方法。
2. 4 核磁共振( nuclear magnet ic
resonance,NMR)NMR 因图谱信号的纯数字化、过渡的重叠范围过宽和信号弱等原因, 以往在多肽物质的分析中应用不多。随着二维、三维以及四NMR 的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,NMR 逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR 可用于氨基酸序列、定量混合物中各组分组成含量等的分析中。NMR 在分析少于30 个氨基酸的小肽时是非常有用的, 可以达到快速准确分析的目的[13 ]。L indon等[14 ]HPLC2NMR 联用, 在连续流动模式下对27个合成的多肽混合物进行了分离和鉴别, 快速得到了各多肽的结构。
2. 5 肽谱分析(pep t ide mapp ing)
肽谱分析是多肽药物质量控制的重要手段。肽谱对每一种多肽药物来说都是特征、专一的。通过
肽谱分析可以鉴别多肽, 预测其一级结构特征, 比较功能相近多肽结构的类似性和各批产品一级结构的一致性。肽谱分析根据多肽分子量大小以及氨基酸组成特点, 使用专一性较强的蛋白水解酶(一般为肽链内切酶) 作用于特殊的肽链位点, 将多肽裂解成较小片段, 通过一定的分离检测手段得到特征性的指纹图谱。肽谱分析对于蛋白质多肽的结构和特性鉴别
具有重要意义, 已成为许多蛋白质多肽药物质量控制的重要方法[15 ]。
2. 5. 1 凝胶电泳(PA GE) 肽谱分析
双向电泳、等电聚焦电泳等凝胶电泳技术在蛋白质多肽的纯度、杂质检查以及分子量、等电点、含量测定等方面发挥了重要作用。双向电泳作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一, 仍然
是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最高的工具。对于分子量大于10 ku 的蛋白质, 凝胶电泳技术已日臻完善; 而对于分子量小于10 ku 的小分子多肽分析总是不尽人意。银染SDS2PA GE 微量肽图法适于CNB r 裂解的较大肽片段的分离检测, 而对酶裂解的肽段, 由于其分子较小, 检测效果不佳[16, 17 ]。随着生物检测技术的不断发展, 本法逐渐被灵敏度更高的肽谱分析方法所替代。
2. 5. 2 HPLC 肽谱分析
由于HPLC 分辨率及检测灵敏度较凝胶电泳高得多, 当多肽药物经作用于特殊肽链位点的蛋白酶裂解, 得到一系列的肽片段后, 可用HPLC 有效地鉴定基因工程产品、天然产品以及有关的杂质。杨化新等[18 ]通过RP2HPLC 法采用
C18柱, 检测了经胰蛋白酶裂解的多种重组人生长激素(rhGH)肽片段, 成功地获得了rhGH 特征性的胰肽图谱。张培培等[19 ] 利用V 8 酶专一性裂解Glu 的羧基端肽链, 通过RP2HPLC 法采用C8 柱, 对胰岛素进行了肽谱分析, 成功地将来自不同种属、结构仅差1 个氨基酸的胰岛素与重组胰岛素进行了鉴别。L ahm等[17 ]和Garn ick 等[20 ]也分别用HPLC 对重组人白介素22 及rhGH 进行了肽谱分析。诸多成功的应表明HPLC 肽谱分析在多肽药物质量控制中具有广阔的应用前景。
2. 5. 3 HPCE 肽谱分析
HPCE 是近十几年发展起来的一项新的分析技术, 它将电泳技术和色谱技术结合, 具有分离效率高, 速度快、模式多等特点。毛细管的柱效与
样品分子的扩散系数成反比, 而蛋白质、多肽具有扩散系数小的特点, 这意味着HPCE 非常适合于蛋白质及多肽的分析研究[21 ]。多肽分析中常用的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等。在用HPLC 进行肽谱分析的过程中, 因亲水性多肽在反相柱上不保留, 某些结构相差1 个氨基酸的多肽片段难以分离。而采用HPCE 进行肽谱分析时, 因为结构相似或氨基酸组成相同而顺序不同的多肽所带的电荷不同, 可通过调节电解质的pH 使迁移时间改变而达到分离。F renz 等[22 ] 分别利用RP2HPLC 和HPCE 对胰蛋白酶降解的rhGH 进行分析, HPLC 出峰大约需时150 m in, HPCE 仅需12m in; 在HPLC 色谱图中未出现的峰在HPCE 中出现了;
收集HPLC 的单峰在HPCE 中运行, 出现了两个峰。此研究结果表明HPCE 是肽谱分析中更有效的工具。
含量测定
1 HPLC
到1980 年代HPLC 就已发展为检测蛋白质多肽结构和纯度的重要分析工具。它用于定量分析具有灵敏、精确、快速的特点, 现在多肽的纯度分析大都采用HPLC 法。包括反相、离子交换和疏水性相互作用在内的HPLC 技术都可用于检测多肽的纯度。对胰岛素的鉴别和含量测定, 中国药典2000 版和美国药典23 版均采用了HPLC 检测方法。董文玉等采用HPLC 成功地将由组合化学合成的10种结构相近的目标多肽与其它杂质分离, 确定了目标多肽的纯度。通
常与HPLC 连用的紫外或荧光检测器无法分辨性质相近的组分间的细小差别, 常常造成结果的偏差。近年来出现的HPLC2M S、HPLC2M S2M S或HPLC2NMR 等联用技术, 使HPLC 能更快速准确地分析样品的组成和纯度。
2 HPCE
与HPLC 相比, HPCE 分离效率更高、上样量更少, 是一种灵敏的蛋白质多肽纯度检测方法。有些多肽在HPLC 上测得纯度为100% , 但在HPCE 分析时纯度仅为90% , 也就是说HPLC 中的单峰在HPCE 中出现多个峰。胰岛素、生长抑制素等多肽药物已有用HPCE 进行纯度分析的报道。HPCE 较差的检测限是该分析方法在纯度分析应用上的一个限制。有研究者采用堆积方法有效地克服了这个问题, 使检测信
号大大增强。
鉴别试验
1.1 生物检定法
由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，与二、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定法有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大类。
1.1.1 在体分析常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各类蛋白多肽的生物活性不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性质[1] 而建立的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方
法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物，费时费力，灵敏度不高，变异较大。
1.1.2 离体组织（细胞）分析如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素的大鼠离体子宫法等。随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细胞培养已是最常用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦有多种。如细胞增殖法（Proliferation assays）,快速灵敏,但特异性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),检测系统简单,灵敏而专一; 减少细胞损伤法(Cytopathic effect reduction assays ) [2],则是依据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤, 方法直观灵敏, 但可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细
胞数目的增减为量效指标，计数方法有直接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素（3H,14C）掺入法等。此外，还有根据蛋白多肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法[3]，结合酶反应的酶诱导分解法[4]等。总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其不足也显而易见。首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；其次，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反应，影响了方法的专属性；再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度；依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。1.2 免疫学方法
免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常用的方法有三种。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性取决于抗原抗体的亲和力及标记药物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）该法中被测药物依然是Ag，它先与固定相上的Ab形成Ab∶Ag复合物，再与标记抗体
125I-Ab结合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夹心状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法，只是对标记抗体的纯度要求很高。
1.2.3酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理与IRMA相似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明，它与生物检定法具有一定的量效关系[4]及相关性[5]，提示它可部分地反映药物的生物活性。
免疫学方法的缺点在于它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同时测定代谢
国际多肽药物的发展现状及其前景展望 一、多肽药物发展现状 1、多肽疫苗 多肽疫苗与核酸疫苗一样是目前疫苗研究领域内较受重视的研究方面之一。尤其是对病毒多肽疫苗进行了大量研究。 目前对人类危害极大的两种病毒性疾病艾滋病和丙型肝炎均无理想的疫苗，核酸疫苗和多肽疫苗的研究结果令人鼓舞。1999年美国NIH公布了两种HIV-I病毒多肽疫苗,对人体进行的Ⅰ期临床试验结果，证实两种多肽能刺激机体产生特异性抗体和特异性细胞免疫，并有较好的安全性。我国清华大学也证实HIV-I膜蛋白内一段多肽有很强的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也显示有良好的发展前景，国外学者从丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2内筛选出一般多肽,它可刺激机体产生保护性抗体。其它病毒(如甲肝、麻疹、辛德毕斯病毒等)的多肽疫苗及抗肿瘤，避孕等多肽疫苗的研究也取得了较大进展。例如，美国学者NaZ等从噬菌体肽库内筛选出一个12氨基酸小肽，它能特异性地与人卵子结合，阻止精子与卵子的结合，可用于避孕疫苗。 2、抗肿瘤多肽 肿瘤的发生是多种原因作用的结果，但最终都要涉及及癌基因的表达调控。不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同，选择特异性小肽作小肿瘤发生时所需的调控因子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。现在已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点。美国学者发现了一个小肽(6个氨基酸)，它在体内能显著抑制腺癌的生长，包括肺、胃及在大肠腺癌为治疗这一死亡率很高的恶性肿瘤开辟了一条新路。瑞士科学家发现另外一个小肽(8个氨基酸)，它能进入肿瘤细胞，激活抗癌基因P53，诱导肿瘤细胞的凋亡。 3、抗病毒多肽 病毒感染后一般要经历吸附(宿主细胞)、穿入、脱壳、核酸复制，转录翻译，包装等多个阶段。阻止任一过程均可防止病毒复制。最有效的抗病毒药物应该是作用在病毒吸附及核酸复制两个阶段，因此筛选抗病毒药物主要集中在病毒复制的这两个阶段。病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。因此可从肽库内筛选与宿主细胞受体结合的多肽或能与病毒蛋白酶等活性位点结合的多肽，用于抗病毒的治疗。 HCV非结构蛋白3区(NS3)是一个与病毒复制密切相关的蛋白酶，其活性位点已被确定，并且加拿大、意大利等国家均从肽库内筛选到一个6肽(DDIVPC)能显著抑制该酶活性。同样已从肽库内筛选到能与HIV复制必需的逆转录酶结合的小肽，及能与HIV外膜蛋白结合防止病毒进入细胞的小肽。这些部分小肽已进入临床试验。 4、多肽导向药物 已知很多毒素(如绿脓杆菌外毒素)，细胞因子(如白细胞介素系列)等有较强的肿瘤细胞毒性，但在人类长期或大量使用量时也可损伤正常细胞。将能和肿瘤细胞特异结合的多肽与这些活性因子进行融合，则可将这些活性因子特异性地集中在肿瘤部位,可大大降低毒素、细胞因子的使用浓度，降低其副作用。比如，在很多肿瘤细胞表面存在表皮生长因子的受体，其数量较正常细胞上的数目高几十倍，甚至上百倍，将毒素或抗肿瘤细胞因子与表皮生长因子融合，可将这些活性因子特异地聚集到肿瘤细胞，国内外已有几家将表皮生长因子与绿脓
氨基酸、多肽及蛋白质类药物 山东药品食品职业学院张慧婧 第一部分氨基酸、多肽及蛋白质基本知识 一、蛋白质基本知识 蛋白质是一切生命的物质基础，是生物体的重要组成成分之一。无论是病毒、细菌、寄生虫等简单的低等生物，还是植物、动物等复杂的高等生物，均含有蛋白质。蛋白质占人体重量的16%～20%，约达人体固体总量的45%，肌肉、血液、毛发、韧带和内脏等都以蛋白质为主要成分的形式存在；植物体内蛋白质含量较动物偏低，但在植物细胞的原生质和种子中蛋白质含量较高，如大豆中蛋白含量约为38%，而黄豆中高达40%；微生物中蛋白质含量也很高，细菌中的蛋白质含量一般为50%～80%，干酵母中蛋白质含量也高达46．6%，病毒除少量核酸外几乎都由蛋白质组成，疯牛病的病原体——朊病毒仅由蛋白质组成。 这些不同种类的蛋白质，具有独特的生物学功能，几乎参与了所有的生命现象和生理过程，可以说一切生命现象都是蛋白质功能的体现。 1．生物催化作用 作为生命体新陈代谢的催化剂——酶，是被认识最早和研究最多的一大类蛋白质，它的特点是催化生物体内的几乎所有的化学反应。生物催化作用是蛋白质最重要的生物功能之一。正是这些酶类决定了生物的代谢类型，从而才有可能表现出不同的各种生命现象。 2．结构功能 第二大类蛋白质是结构蛋白，它们构成动、植物机体的组织和细胞。在高等动物中，纤维状胶原蛋白是结缔组织及骨骼的结构蛋白，α-角蛋白是组成毛发、羽毛、角质、皮肤的结构蛋白。丝心蛋白是蚕丝纤维和蜘蛛网的主要组成成分。膜蛋白是细胞各种生物膜的重要成分，它与带极性的脂类组成膜结构。 3.运动收缩功能 另一类蛋白质在生物的运动和收缩系统中执行重要功能。肌动蛋白和肌球蛋白是肌肉收缩系统的两种主要成分。细菌的鞭毛或纤毛蛋白同样可以驱动细胞作相应的运动。 4.运输功能 有些蛋白质具有运输功能，属于运载蛋白，它们能够结合并且运输特殊的分子。如脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起运输氧的功能，血液中的血清蛋白运输脂肪酸，β-脂蛋白运输脂类。许多营养物质（如葡萄糖、氨基酸等）的跨膜输送需要载体蛋白的协助，细胞色素类蛋白在线粒体和叶绿体中担负传递电子的功能。 5.代谢调节功能 执行该功能的主要是激素类蛋白质，如胰岛素可以调节糖代谢。细胞对许多激素信号的响应通常由GTP结合蛋白（G蛋白）介导。 6.保护防御功能 细胞因子、补体和抗体等是参与机体免疫防御和免疫保护最为直接和最为有效的功能分子，其化学本质大都为蛋白质，免疫细胞因子、补体和抗体等目前也已用于免疫性疾病和一些非免疫性疾病的预防和治疗。
多肽类抗肿瘤药物研究进展 【摘要】目前，恶性肿瘤已严重威胁人类的健康，传统的手术、化疗、放疗等治疗手段不仅选择性低，毒副作用大，且易产生耐药性。而多肽具有良好的靶向性，且分子量小、来源广泛，具有低毒性、易于穿透肿瘤细胞且不产生耐药性的优点。抗肿瘤活性肽可特异性结合并作用于肿瘤组织，与肿瘤生长转移相关的信号转导分子相互作用，从而抑制肿瘤生长或促进肿瘤细胞发生凋亡。本文将从抗肿瘤多肽药物的来源、作用机制及发展现状进行概述。【关键词】多肽来源抗肿瘤作用机制 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，仅次于心血管疾病，每年死于癌症的患者约占总死亡人数的1/4，且中国占相当庞大的病例数。药物治疗是当今治疗肿瘤的主要手段之一，但目前的抗肿瘤药物不良反应较大。对此，寻找新型高效低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。随着免疫和分子生物学的发展，以及生物技术与多肽合成技术的成熟，人们发现多肽类药物不仅毒性低、活性高、易于吸收，还可以通过提高机体免疫功能抑制肿瘤的生长和转移，增强抗肿瘤作用，而且其广泛存在于动物、植物、微生物体内，因此，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。 抗肿瘤多肽的来源 天然来源的抗肿瘤活性肽 天然活性多肽是存在于动物、植物和微生物等生物体内的一类生物活性肽，可经过特殊提取分离工艺直接得到。近年来，对某些多肽经修饰加工后发现其具有显著的抗肿瘤作用，它们可针对肿瘤细胞发生、发展的不同环节，特异性杀伤、抑制肿瘤细胞，显示出极好的应用前景。 1.1微生物源抗肿瘤多肽 微生物源抗肿瘤多肽主要是指广泛存在于生物体内的一种小分子多肤，它们是非核糖体合成的抗菌肽，如多黏菌素(polymyxin)、杆菌肽(bacitracin)、短杆菌肽(gramicidin)等，主要是由细菌产生，并经结构修饰而获得，这类微生物产生的抗菌多肽的研究近年来取得了较大的进展。 细菌抗菌肽又称细菌素，是最常见的一类抗菌肽，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可分泌。细菌中已发现杆菌肽、短杆菌肽S、多黏菌素E和乳链菌肽(Nisin) 4种类型抗菌肽，能特异性杀死竞争菌，而对宿主自身无害。例如[1]，枯草芽孢杆菌可以产生多种抗微生物物质，如表面活性素(surfactin)，该物质具有抗病毒、抗肿瘤、抗支原体、抗真菌活性和一定程度的抗细菌活性。除此之外，人们还发现某些抗菌肽对部分病毒、真菌和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合。 1.2动物源抗肿瘤多肽 动物源多肽主要是指从哺乳动物、两栖动物、昆虫中分离提取出来的抗肿瘤多肽。如，有些哺乳动物来源的抗肿瘤多肽对淋巴瘤细胞有较强的抗肿瘤活性且免疫原性低；此外，还有Berge [2]等通过体内实验验证来源于牛科动物乳铁蛋白Lfcin B的9肽LTX-302 ( WKKWDipKKWK )的抗肿瘤效果，结果表明其对淋巴瘤细胞A20具有抗肿瘤活性，IC50为16 μmol·L￣1 。 多数研究表明，从天蚕中分离出的天蚕素Cecropins具有较强的抗肿瘤活性。Cecropin A和Cecropin B对膀胱癌细胞有选择性细胞毒作用，以剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞增殖，对所有膀胱癌细胞系的IC50为73.29~220.05 μmol·L￣1，它们的作用机制可能是破坏靶细胞膜导致不可逆的细胞溶解和细胞破坏[3]。 1.3植物源抗肿瘤多肽
发布日期20071127 栏目化药药物评价>>非临床安全性和有效性评价 标题合成多肽药物有关物质研究的几点考虑 作者审评五部 部门 正文内容 审评五部 有关物质研究是合成多肽药物药学研究的一项重要内容，由于合成多肽本身结构、合成工艺以及稳定性方面的特殊性，这类药物的 有关物质研究较为复杂、存在一定的难度。国家食品药品监督管理 局颁布的《合成多肽药物药学研究技术指导原则》已经就该类产品 的有关物质研究提出了原则性的要求，本文主要是根据审评中遇到 的一些共性问题就合成多肽药物有关物质研究需重点关注的几个 问题做进一步的说明。 （一）合成多肽药物有关物质的特点和研究的难点。 合成多肽的有关物质主要为源于合成过程带来的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等。 工艺杂质尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工
艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质（如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等）与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。而且，不同的多肽合成方法也在很大程度上决定了终产品中杂质的性质，例如液相合成和固相合成所引入的工艺杂质就会明显不同，固相合成中Boc合成法与Fmoc合成法所产生的杂质也会有所差异，甚至不同的保护/脱保护策略都会带来不同的工艺杂质。因此，在进行合成多肽的有关物质研究时，研究者必须结合自身的工艺特点对可能由此引入的杂质有充分认识，从而才能够建立有针对性的有关物质研究方法。同时，这也意味着，对于仿制产品而言不能盲目照搬国家标准、已上市产品的有关物质检查方法，必须充分考虑到产品本身的工艺特点。 降解产物及聚合物多肽的化学稳定性和物理稳定性一般较差，因此降解产物、聚合物等是合成多肽有关物质研究的主要对象之一。影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β-消除、聚集等，研究显示合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应（尤其是在pH值升高和高温条件下）；甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化，对光照也较为敏感；天冬氨酸参与形成的肽链较易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。由于一个多肽分子中通常
多肽类药物制剂研究现状 方宏清 (军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071) 摘 要 多肽类药物制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好、体内半衰期短和生物膜透过性差。本文综述了多肽类药物不稳定的原因;提高多肽稳定性的方法;多肽类药物制剂货架时间的确定;多肽类药物的分析手段;多肽类药物的控释研究;多肽的非注射途径给药研究。最后还提出了多肽类药物制剂研究的展望。 关键词 多肽 药物制剂 稳定性 控制释放 非注射途径给药 随着生物技术的发展,多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛,相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统的小分子有机药物相比,多肽具有稳定性差,体内半衰期短和不易通过生物膜等特点。本文从稳定性、缓释系统、非注射途径给药三方面对多肽类药物制剂的研究概况进行介绍。 1 多肽的稳定性研究 1.1 引起多肽不稳定的原因[1～3] (1)脱酰胺反应 在脱酰胺反应中, Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关。提高pH值、升高温度都将有利于脱酰胺反应的进行。在-Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。 (2)氧化 多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中, Met、Cys和H is、Trp、Ty r等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。 (3)水解 多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。 (4)形成错误的二硫键 二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。 (5)消旋 除Gly外,所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。 (6)β-消除 β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Th r、Phe、Ty r等残基都可通过β-消除降解。在碱性p H 下易发生β-消除,温度和金属离子对其也有影响。 (7)变性、吸附、聚集或沉淀 变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以恢复。在多肽变性过程中,首先形成中间体。通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。 蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题,如r IL-2在进行灌注时会吸附在管道表面,造成活性损失[4]。 1.2 提高多肽稳定性的途径[1,3] (1)定点突变 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳 16 药 学 进 展 1998年 22卷 第1期军事医学科学院青年科研基金资助项目
多肽类药物研究及应用进展 内容摘要：多肽是一类在氨基酸构成及其连接方式上与蛋白质相同,但在某些性质方面又有别于蛋白质的物 质,如其空间结构较简单、免疫原性较低或无免疫原性、生理活性强等。但多肽类物质自身固有的特点，如口服利用率较低、酶 降解性高以及半衰期极短等，使其作为药物开发应用受到诸多的局限。而导致多肽类药物不稳定的一个重要原因就是多肽特殊的分子结构。 本文重点从分子结构改造方面对多肽类药物的研究进展做一综述。 关键词：多肽药物结构改造化学修饰基因工程环肽 多肽作为药物，具有生理活性强、免疫原性低、疗效高等诸多优点，随着生物技术的不断发展，其在人类疾病治疗中的地位也日趋重要，目前已成为国际药学界研究的热点之一。但多肽类物质自身固有的特点，如口服利用率较低、酶降解性高以及半衰期极短等，使其作为药物开发应用受到诸多的局限。而导致多肽类药物不稳定的一个重要原因就是多肽特殊的分子结构，其中多肽主链氨基酸的降解和侧链氨基酸残基的结构变化是多肽结构不稳定的主要原因，因此从多肽类药物本身的分子结构进行改造，是改变其理化性质和药代动力学性质的根本。本文拟重点从分子结构改造方面对多肽类药物的研究进展做一综述。 1 化学修饰 化学修饰不仅是多肽类药物定向改造、提高稳定性的有力工具，也是研究多肽结构与功能的一种重要手段。对多肽的主链基团和侧链基团都可以进行化学修饰。主链基团修饰包括氨基酸肽链的延长、切除及氨基酸定位突变等；侧链基团修饰主要集中于氨基、巯基和羧基上。修饰剂主要有葡聚糖、多聚唾液酸、聚乙二醇、四硝基乙烷等。根据修饰剂与 多肽之间反应的性质，修饰反应可分为糖基化反应、酯化反应、酰化反应、取代反应、磷酸化反应、烷基化反应、氧化还原反应等。由于烷基化反应和氧化还原反应对多肽的活性影响较大，实际应用较少，而磷酸化反应对多肽稳定性的影响意义不大。现主要对前 4 种修饰反应进行重点介绍。 1.1 糖基化反应 糖基化是指多肽的氨基和单糖还原端的羰基在温和的条件下经过一系列变化成为较稳定的糖肽的过程，是一种较为理想的稳定多肽类药物的方式，糖链的存在及其结构的可变性、复杂性和多样性直接影响着糖肽在组织中的降解和在体内的寿命[1]，也使得糖肽成为药学研究的新热点。脑内的亮氨酸脑啡肽可特异性地与阿片受体结合，在机体内起着调控痛觉感受并调节心血管与胃肠功能的作用，但半衰期短。 1.2 酯化反应 酯化是指多肽的羧基和醇羟基形成较稳定的酯类化合物的反应。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是常用的酯化反应试剂，是一种线性、亲水、灵活而不带电的高分子聚合物。通常选择相对分子质量大于10 000 的PEG 在温和的条件下对多肽进行修饰，选择合适的修饰类型、修饰程度以及修饰位点有利于改善多肽类药物的活性并提高其稳定性。目前已有不少经PEG 修饰的多肽类药物如PEG-IL-2[2]、PEG-水蛭素[3]等已进入临床试验阶段。 1.3 酰化反应
多肽、蛋白质类药物缓释剂型的研究进展 作者：文章来源：点击数：3201 更新时间：2004-7-13 随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现。目前已有35种重要治疗药物上市，生物技术与生物制药企业的发展也日益全球化。生物技术药物研究的重点是应用重组技术开发可应用于临床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。据＇s 报道，目前已有723种生物技术药物正在接受审评(包括Ⅰ～Ⅲ期临床及评估)，700种药物处于早期研究阶段(研究与临床前)，还有200种以上药物已进入最后批准阶段(Ⅲ期临床与评估)［1］。 生物技术药物的基本剂型是冻干剂。常规制剂尽管其疗效早为临床所证实，但由于半衰期短，需要长期频繁注射给药，从患者的心理与经济负担角度看，这些都是难以接受的问题。为此，各国学者主要从两方面着手研究开发方便合理的给药途径和新制剂：①埋植剂和缓释注射剂。 ②非注射剂型，如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等［2］。缓释生物技术药物的注射制剂，是很有应用前景的新剂型，有一些品种如能缓释1至3个月的黄体生成素释放激素()类似物微球注射剂已经上市［3］，本文着重介绍这类制剂。 1多肽、蛋白质药物缓释制剂的主要类型 多肽、蛋白质药物缓释制剂的研究与开发，从发展过程及剂型看，主要分埋植剂和微球注射剂两类。 1.1埋植剂() 1.1.1细棒型埋植剂［4］埋植剂外形为一空心微型细棒，一头封闭，另一头开口，棒材为聚四氟乙烯等非生物降解聚合物。腔内灌入药物与硅胶(,聚二甲基硅氧烷)混合物。埋植剂埋入人体皮下，药物通过硅胶基质开口处缓慢释放。美国内科医生手册()上收载了商品名为?的埋植剂，药物为左旋-18乙基炔诺酮，用于计划生育。该制剂每根直径 2.4 ，长34 ，医生通过手术将6根细棒状物埋植在患者上臂内侧，药物可在体内按零级模式释药达5年，药物释完后再经手术取出。 1.1.2微型渗透泵埋植剂美国公司20世纪70年代开发了外形像胶囊的埋植剂，该制剂埋植于皮下或其它部分，体液可渗透过外壳，溶解夹层电解层，使体积膨胀的夹层压向塑性内腔，促使药物溶液从开口定速释放。有不少生物大分子药物，如胰岛素、肝素、神经生长因子等作为模型药物的动物体内外研究报道［5］。埋植剂对需要长期用药的慢性患者的治疗具有积极的意义，但它存在以下缺陷：①必须经手术途径植入。②制剂骨架材料为非生物降解聚合物，释药结束后还需经手术取出。③制剂在局部组织有刺激与不适感。 1.1.3可注射的埋植剂可生物降解聚合物作为埋植型或注射型缓释制剂骨架是近20年来国内外学者大力研究的方向，这类聚合物包括两大类：①天然聚合物，如明胶、葡聚糖、白蛋白、甲壳素等。②合成聚合物，如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸-羟乙酸()、聚丙交酯乙交酯()、聚己内酯、聚羟丁酸等。 近年合成聚合物尤为人们重视，于20世纪70年代起即用作外科缝线及体内埋植材料，如人工关节、护板、螺栓等。聚合物在体内可逐渐
多肽、蛋白质类药物给药系统 摘要随着重组DNA技术的发展．基因工程肽和蛋白质药物的大规模生产已成现实，这类药物应用于临床的数量越来越多。与传统的化学合成约物相比，其优点受到了广泛的关注，即与体内正常生理物质十分接近，更易为机体吸收，其药理活性高、针对性强、毒性低。但由丁多肽、蛋门质类约物(1)分子质量大、稳定性高、易被胃肠道中的的蛋白水解酶降解；(2)生物半衰期短、生物膜渗透性差、生物利用度不高、不易通过生物屏障等，故其给药系统的研究一直足约剂学领域的一个热点。许多学者曾尝试对肽类、蛋白质类约物进衍化学修饰、制成前体药物、应用吸收促进剂、使用酶抑制刺、采用离子电渗法皮肤给药以及设计各种给药系统解决上述问题．此炎药物一般注射给药，基本剂型足注射剂和冻粉针剂，常需频繁注射，患者顺从性差，且加重了患者的身体、心理和经济负担。近年来，脂质体、微球、纳米粒等制剂新技术发展迅述歼逐渐完善，国内外学者将其广泛应用于多肽、蛋白质炎约物给约系统(drug deiivery system，DDS)的研究中，为此炎药物的临床应用铺平了道路。 本文就多肽、蛋白质类约物的给药系统及新技术进行综述。主要介绍注射给药系统和非注射给约系统，及其下属几个分支。重点介绍非注射给药系统。 关键字给药系统注射非注射 l 新型注射给药系统 1.1 控释微球制剂 为了达到多肽、蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂。目前已经实际应用的生物可降解材料主要有淀粉、明胶、葡糖糖、清蛋白、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PIGA)、聚邻酯、聚内酯和聚酐等；其中PLGA最为常用，改变乳酸乙醇酸的比例或相对分子质量，可得到不同降解时间的微球。 PLGA 微球相对于常规注射剂具有如下优点：(1)释药周期长，避免频繁给药； (2)使用安全；(3)药理作用增强；(4)避免发生明显的不良反应；(5)生物利用度显著提高。 1.2 脉冲式给药系统 普通注射剂(疫苗、类毒素)一般至少接种3次，才能确保免疫效果，血药浓度波动大，且不能保证在疾病发作时相应的血药浓度。而脉冲给药制剂具有普通制剂不可比拟的优点，它可以根据忠者发病的节律性提前给药，使给药时间与释药时间有一个与生理周期相匹配的时间差，从而预防发病，降低药物的不良反应，且不易产生耐受性，提高患者的顺应性，是现代药剂学研究的新模式。 2 非注射给药系统 2.1 口服给药系统 多肽、蛋白质类药物口服给药主要存在4个问题：(1)在胃内酸催化降解；(2)在胃肠道内的酶水解；(3)对胃肠道黏膜的透过性差；(4)存在肝的首过效应。因此研制新的剂型，提高多肽、蛋白质类药物的生物利用度是人们关注的 热点。 2.1.1 纳米粒 Kawashima等以降钙素为模型药物制备壳聚糖包衣PLGA纳米粒来评价黏膜黏附纳米粒对肽类药物吸收的影响。体外实验表明，壳聚糖包衣PI GA纳米粒对十二指肠、空肠和回肠的黏膜黏附效应无部位特异性，且壳聚糖的黏附特性要强于聚乙烯醇和海藻酸钠。药物的释放特性与未包衣纳米粒相比没有变化。
多肽类药物 氨基酸是蛋白质的基本单位，两个以上的氨基酸缩合形成肽链(polypeptidechain)。蛋白质是机体内最重要的一类生物大分子，目前被广泛地作为药物用于疾病的治疗。但是，蛋白质类药物也有缺点，如分子量大、制备困难、存在抗原性、体内易降解等。令人惊喜的是，人们发现某些分子量较小的多肽同样具有类似蛋白质的活性，且功能更显着。随着对这类生物活性多肽的进一步研究，已为新药的研制和开发提供了一个新的途径。从生物学角度看，多肽和蛋白质的区别只是前者结构小一些，后者结构大一些。在人的生命活动中，蛋白质不断分解变化，蛋白质分解后形成多肽，多肽聚合又形成蛋白质。在人体中，多肽是涉及各种细胞功能的生物活性物质，几乎所有的细胞都能合成多肽，所有细胞又受多肽调节。生命科学之所以将目光投向多肽，原因恰恰在于多肽在人体内担当的这种独特的生理和生化反应的信使角色。 蛋白质和多肽之间在分子量上并无明确的区分，习惯上将胰岛素(51个氨基酸组44)10的(或2成，分子量5733)视为多肽和蛋白质的界限。也有人将分子量小于10×氨基酸链称为多肽。目前生物医学在人体中已发现了1000多种具有活性的多肽，仅-12-9mol/L，～10脑中就存在近40种，它们在生物体内的浓度很低，血液中一般仅有10但生理活性很强，在神经、内分泌、生殖、消化、生长等系统中发挥着不可
或缺的生理调节作用。人们比较熟悉的有谷胱甘肽(3肽)、催产素(9肽)、加压素(9肽)、脑啡肽(5肽)、β-内啡肽(31肽)、P物质(10肽)等。 作为药用的肽，通常是由几个到二十几个氨基酸组成的比较短的多肽。开发和发展内源性活性物质作为治疗疾病的药物具有重要的实用价值，因为它是最符合人体生物学调节规律的治疗手段，可以避免许多其他类型药物给人体带来的不良反应。目前，全世界已经应用于临床的多肽类药物约有几十种，包括人们熟知的胰岛素、． 胸腺肽、抗艾滋病新药T20以及肽类激素等。近几年蛋白质/多肽类 药物市场的发展速度惊人，年增长率达24%，与增长率仅为9%的总体医药市场相比，该领域令人注目。鉴于多肽生物活性高，一些肽在人的生长发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰防老及分子进化等方面又具有极其特殊的功能，多肽类药物的研发自然成为近年生命科学的一大热门领域。 1.多肽药物的优势 多肽药物是近年来世界新药研究开发的热点，也是我国生物医药研究的重点方向之一。与传统药物相比，多肽药物具有以下明显的优势： (1)活性高，在很低的剂量和浓度下即可表现出显着的高活性； (2)分子量小，相对蛋白质而言易于人工化学合成，方便进行结构改造； (3)合成效率高。近年来技术的进步使多肽的固相合成变得简单，过 程自动化，易于控制；
附件三 合成多肽药物药学研究技术指导原则
合成多肽药物药学研究技术指导原则 一、前言 多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。 采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。 合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究的内容与深度还要取决于品种本身的特性。 本指导原则适用于采用液相或固相合成方法制备的多肽药物。
二、合成多肽药物药学研究的基本考虑 合成多肽药物药学研究的主要内容、研究思路、研究方法及一般性的技术要求与其他类型的化学药物基本一致。但是，由于多肽药物的特点，在进行药学研究时还应注意考虑以下问题。 1、关于多肽（原料药）合成工艺选择的考虑 多肽的化学合成是有机合成的一个非常特殊的分支，目前主要有液相合成和固相合成两种方法。 液相合成是经典的多肽合成方法，一般采用逐步合成或片段缩合方法。逐步合成法通常从链的C'末端氨基酸开始，向不断增加的氨基酸组分中反复添加单个α-氨基保护的氨基酸。片段缩合一般先将目标序列合理分割为片段，再逐步合成各个片段，最后按序列要求将各个片段进行缩合。液相合成的优点是每步中间产物都可以纯化、可以获得中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失，缺点是较为费时、费力等。 固相合成是将目标肽的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(树脂)相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨基酸（氨基保护）的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基脱保护后与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一过程,直至目标肽形成为止。其优点是简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。 液相合成和固相合成各有优缺点，应根据合成的实际需要选择适合的工艺。一般而言，液相合成法较适于合成短肽；固相合成法
长效多肽药物研究进展 王秀贞 1,2 吴 军 13 孟宪军 2 (1军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071 2沈阳农业大学食品科学院 沈阳 110161) 摘要 重组蛋白药物在体内存留时间的长短,极大地影响到药物的使用剂量和治疗效果。防止 多肽在体内迅速降解、延长半衰期成为蛋白质工程药物改造的重要课题之一。经过许多学者多年来的不懈研究,不少长效多肽药物已经上市,还有一些正在进行临床研究。综述了几种多肽药物常用的长效改造方法如化学修饰、基因融合、点突变以及药物制剂释放系统的改造。关键词 多肽药物 半衰期收稿日期:2003203221 修回日期:20032082223通讯作者,电子信箱:wqmxjr @s https://www.doczj.com/doc/c015268221.html, 生物技术的发展极大地促进了多肽、蛋白药物的研制开发,目前已有40种以上重要的治疗药物上市,720多种生物技术药物正进行Ⅰ～Ⅲ期临床试验或接受FDA 审评,其中200种以上的药物进入最后的批准阶段(Ⅲ期临床与FDA 评估)。多肽因子、蛋白药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于20kDa 的多肽因子在代谢过程中易由肾小球滤过;通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出,因而半衰期短。为维持一定的疗效需要大剂量反复用药,长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。近几年各国学者主要从化学修饰、基因融合、点突变以及制剂改造等方面着手进行长效多肽药物的研究。 1 化学修饰 化学修饰是延长蛋白药物半衰期的一个有效途径,其中应用最为广泛的修饰剂是单甲氧基聚乙烯二醇(methoxypoly ethylene glycol ,mPEG ),其次是多糖类如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等;同源蛋白质、人工合成多肽类如白蛋白、聚丙氨酸等;长链脂肪酸类以及聚烯属烃基化合物、聚酸酐等[1] 。PEG 是惰性、两亲、不带电荷的柔性聚合物,分子量随聚合程度而变化(1～50kDa ),有线性和支链两种构型,其中线性单甲氧基聚乙烯醇(mPEG )已经FDA 批准作为许多药物的安全载体。mPEG 通过共价键与蛋 白质连接,对蛋白表面氨基进行修饰以有效地改变多肽、蛋白药物在体内的分布和药物学特性。目前mPEG 修饰已应用于40多种不同蛋白的修饰如猪血清白蛋白(BS A )、粒细胞集落刺激因子(G 2CSF )、白介素22(I L 22)等。PEG 修饰后血浆半衰期一般可延长几倍至几十倍甚至是上百倍(表1),但大部分蛋白的免疫原性也有所降低,而蛋白的生物活性也有不同程度降低。这可能是由于PEG 大分子在蛋白分子周围形成一层外壳阻碍了免疫细胞与蛋白的接触保护了蛋白,掩盖了蛋白酶识别位点避免蛋白酶降解的发生,但同时也使蛋白的活性位点受到影响。中国药科大学田泓等[2] 用聚乙二醇修饰干扰素α2的研究表明活性损失与修饰率有关,修饰率保持在30%以内时生物活性保持较好M otoo Y amasaki 等[3] 在PEG 修饰重组人粒细胞集落刺激因子(rhG 2CSF )中发现修饰位点的多少(即1分子rhG 2CSF 与几分子PEG 结合)对半衰期的延长方面并无多大影响,但修饰位点少活性损失就相对少一些;为保持蛋白的生物活性,采取位点特异性修饰即将蛋白功能结构域中易与PEG 结合的氨基酸残基换成功能相似不干扰蛋白与PEG 结合的氨基酸 残基如赖氨酸替换成精氨酸[4] 。PEG 修饰应用十分广泛,它对酶、多肽、受体、抗体片断等均能实现偶联以延长半衰期,抗体药物是继疫苗之后的第二大生物技术药物产业,但是异体抗体容易产生免疫识别而被清除,经PEG 修饰后就可得到明显改善[5] ,从而为抗体更广泛地应用于疾病的治疗提供了基础。随着研究的不断深入,不少PEG 修饰蛋白药物已经上市或者进入临床(表2)。 第23卷第10期 中 国 生 物 工 程 杂 志 CHI NA BI OTECH NO LOGY 2003年10月
多肽类药物 多肽和蛋白质类生物药物按药物的结构分类可分为：氨基酸及其衍生物类药物、多肽和蛋白质类药物、酶和辅酶类药物、核酸及其降解物和衍生物类药物、糖类药物、脂类药物、细胞生长因子和生物制品类药物。 结构分析 多肽的定性至少应包括氨基酸分析、序列分析及质谱分析。纯肽的氨基酸分析可提供该多肽的氨基酸组成和数量。序列分析则提供氨基酸残基的精确排列顺序。基于多种技术的质谱, 如快原子轰击、电喷雾、激光解吸, 经常用于提供多肽的相对分子量及其序列信息。肽谱是蛋白质或多肽通过酶解得到的肽片段经分离和分析所得到的“指纹图谱”。当多肽含有20 个以上的氨基酸残基时, 肽谱分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。 2. 1 氨基酸分析 用于氨基酸分析的水解方法主要是酸水解, 同时辅以碱水解。酸水解中使用最广泛的是盐酸(一般浓度为6mo l?L )。多肽于110 ℃真空或充氮的安瓿瓶内水解10～24 h, 然后除去盐酸。水解过程中氨基酸遭破坏的程度与保温时间有线性关系, 因此该氨基酸在多肽中的真实含量可通过以不同的保温时间对相应时间的样品中该氨基酸的含量作图, 用外推法求出。高氨基酸分析仪的使用使氨基酸的分析越来越准确, 如W aters 公司的氨基酸分析系统的检出限已达100 fmo l。 2. 2 序列分析 氨基酸测序主要为化学法, 酶法也有一定的意义。化学法以Edman 降解法最为经典, 它对所有氨基酸残基具有普适性和近乎定量的高产率, 是近50年N 2端顺序分析技术的基础。
Edman机理的液相(旋转杯) 自动蛋白顺序分析仪在1967 年推出。近年来不断对其改进, 其灵敏度已达到可以对0. 1pmo l 的样品进行常规分析。 2. 3 质谱(mass spect romet ry,M S) 质谱以质量分析为基础, 可提供化合物的分子量以及一些结构信息。1980 年代以后发展了许多新的“软电离”技术, 使其在蛋白质多肽分析中的应用越来越广。目前应用较多的有原子轰击、电喷雾和基质辅助激光解吸质谱。质谱测序是对Edman 降解的一个很好补充, 它可对N 2端封闭的多肽进行测序; 并可以通过碰撞诱导断裂(C ID ) 得到部分至完全的序列信息后, 作出M S2肽谱, 这可对修饰的氨基酸残基定性, 并确证其位置。而且质谱技术与分离技术如HPLC、HPCE 直接相连可相互验证, 同时还可对混合肽进行测序。 2. 3. 1 快原子轰击质谱(fast atom bombardmen t2mass spect romet ry, FAB2M S)FAB2M S 克服了传统质谱中样品必须加热气化的限制, 可对热不稳定、难挥发的蛋白质多肽进行分析。与其他质谱技术相比, FAB2M S 更适合于小分子多肽的检测[6 ]。FAB2M S 测定肽的氨基酸序列具有用量少、方便和快速的优点。一些寡肽, 特别是人工合成的有保护基的寡肽在遇到N 2端封闭不宜用氨基酸序列仪测定其结构的情况下, 有可能用少量样品采用FAB2M S 直接获得寡肽的分子量和氨基酸序列。俞振培等[7 ]用FAB2M S 对7 个带有不同保护基的3～5 肽成功地进行了氨基酸序列研究。串联FAB2M S 将第一次轰击得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击, 使肽链在不同部位断裂, 从而得到一组片段的质谱信息, 使多肽测序得以实现 2. 3. 2 电喷雾质谱(elect ro sp ray ion izat ion2massspect romet ry, ES I2M S) ES I2M S 由于可以产生多电荷峰, 与传统质谱相比扩大了检测的分子质量范围, 提高了灵敏度, 可以得到准确的分子量。ES I2M S 可分为正离子和负离子, 一般多肽和蛋白质的ES I2M S 分析总是以正离子方式进行。ES I2M S 的最大优势是可直接与HPLC、HPCE 联用,
多肽类药物冲刺“重磅炸弹”新贵 在重组药物领域，多肽类药物由于其毒性低，特异性高，分子量小等自身独 特的优势，其成为患者的最佳选择。另外，随着制造工艺和给药系统的改进，多 肽类药物从上世纪70 年代诺华的Lypressin（赖氨加压素）上市起，已经取得了 迅猛发展。 据全球肽治疗基金会的报告显示，在过去的几十年，进入临床开发的多肽类 药物数量不断增加，上世纪90 年代年均为9.7 种，2000~2008 年间增加到16.8 种。 2000~2008 年间，进入临床研究的多肽最常见适应症是癌症和代谢性疾病 （包括糖尿病和肥胖症），分别占18％和17％。而治疗过敏、免疫功能紊乱和 心血管疾病的多肽类药物研究有所下降。而据生命科学产业的首席战略与管理咨 询公司Bionest Partners 预计，全球多肽类药物市场将会从2003 年的53 亿美 元增长到2013 年的115 亿美元，复合年均增长率（CAGR）为8.1%。 在全球医药市场上，数种多肽类药物已经取得了商业上的成功，其销量已经 达到或者接近“重磅炸弹”级药物的销售水平。 新贵1：醋酸格拉替雷 以色列梯瓦制药公司的拳头产品Copaxone（醋酸格拉替雷）是一种人工合 成的肽类制剂，由谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和赖氨酸四种氨基酸组成。Copaxone 于1996 年获美国FDA 核准用于治疗多发性硬化症。在具有较多多发性硬化症 患者的西方国家中，Copaxone 的疗效与耐受性皆获得十足的肯定。 目前国内暂无企业申报格拉替雷或进口。2011 年Copaxone 全球销售额达 到36 亿美元。据悉2012 年一季度，该药物创下了9.09 亿美元的销售额。6 月，梯瓦制药公司在发布的年度经济预测中表示，该药物2012 年或将为公司带来高 达38 亿美元的收入。不过Copaxone 可观的收益也引来仿制药公司的挑战。近日，梯瓦制药公司宣布，此前公司同包括Momenta 生物制药公司、诺华制药公 司山德士分公司、迈兰制药公司以及Natco 生物制药公司数家制药公司之间就Copaxone 的专利权展开了一场法律诉讼案件，日前美国纽约州法院表示梯瓦制 药公司胜诉。梯瓦制药公司对于该药物的市场独家销售权有效期将会延至2014 年。 新贵2：醋酸亮丙瑞林 雅培的Lupron（醋酸亮丙瑞林），是一种自然产生的促性腺激素释放激素 GnRH 或促黄体生成释放激素（LH-RH）的合成九肽类似物。Lupron 适应症较广，包括子宫内膜异位症；伴有月经过多、下腹痛、腰痛及贫血等的子宫肌瘤； 绝经前乳腺癌，且雌激素受体阳性患者；前列腺癌；中枢性性早熟症。 2011 年，雅培的Lupron 在全球的销售额达到8.1 亿美元。在中国市场，武 田药品工业株式会社2000 年起进口销售。2009 年，北京博恩特药业有限公司 和上海丽珠制药有限公司上市国产醋酸亮丙瑞林。近两年，国内16 个重点城市 样本医院醋酸亮丙瑞林用药快速增长，增长率保持在50%左右，2011 年就达到5730 万元。国内醋酸亮丙瑞林市场份额中，武田药品工业株式会社占据着86.73 的市场份额。 新贵3：醋酸戈舍瑞林 阿斯利康的诺雷得（醋酸戈舍瑞林）是一种注射用的促黄体生成素释放激素
多肽类药物的开发、应用及发展前景 摘要: 本文从多肽类药物的简介与分类,和对多肽类药物开发的技术研究和给药途径,以及对多肽类药物的研究前景等方面,对多肽类药物有了综合性的认识。阐述了多肽类药物在国内和国际上的巨大前景以及对研究现代疾病的预防和治疗发挥着至关重要的作用。 关键字：多肽类药物研发技术与方向给药途径前景与展望 Polypeptide drugs development, application and development prospects Abstract: This article from the introduction and classification of polypeptide drugs, and for peptide drug delivery system for research and development of technology, and the study of peptide drugs prospects, etc., for a comprehensive understanding of peptide drugs. Polypeptide drugs in the huge prospects as well as to the research on domestic and international modern disease plays an important role in the prevention and treatment keyword：polypeptide drugs research and development Technology and the direction Delivery way prospects and look ahead 一、多肽的简介： 多肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低于10，000Da（Dalton道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。[1] 百度百科“多肽”。也可把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10~50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为。[2]《生物化学教程》高等教育出版社王镜岩等主编 分子式：[3]《多肽药物研究于开发》人民卫生出版社厉保秋主编 二、多肽类药物的特点 多肽类药物是指用于预防、治疗和诊断的多肽类物质生物药物[4]《蛋白药物的制备与展望》张政朴等编著 许多活性多肽都是由无性的前体，经过酶的加工剪切转化而来的，它们中间许多有共同的来源，相似的结构，甚至还保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结构与功能的关系及活性之间结构的异同与其活性的关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物。国内外一些临床上确有疗效的组织提取剂，其有效成分有的还不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究他们的物质基础和作用机制，预计可获得一定成效。 三、多肽类药物的分类