第一部分防腐挑战实验调研结果
1实验样品
样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g
2微生物挑战性实验
2.1实验菌株
不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株
菌株
美国
（药典）
美国
（ISP公司）
英国
（药典）
德国
（Henkel 公司）
德国
（S&M公司）
白假丝酵母V V V V V 黑曲霉V V V V V 红色青霉V
绿色木霉V
绳状青霉V 大肠埃希氏菌V V V V 镉绿假单胞菌V V V V 金黄色葡萄球菌V V V V V 粪肠球菌V
产气肠杆菌V
表皮匍萄球菌V 日勾维肠杆菌V
洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌
恶臭假单胞菌
荧光假单胞菌
表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择
种类菌株数量
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌
至少选一种
发酵革兰氏阴性杆菌表皮匍萄球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌
大肠埃希氏菌
至少选两种
非发酵革兰氏阴性杆菌
变形菌属
日勾维肠杆菌
铜绿假单胞菌
洋葱假单胞菌
荧光假单胞菌
至少选一种
酵母恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属白假丝
酵母
至少选一种
霉菌近平滑假丝酵母
黑曲霉
至少选一种
产芽孢菌
黄绿青霉
枯草芽孢杆菌
供选用
生产现场分离菌适当菌株—种以上
2.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基
2.3 试验用菌液的配置
（1）标准悬液的配制
1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3x108cfu/ml, 此悬液再做3 倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制
实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3X 10f^cfu/ml）相同为止；
此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1X 108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
（3）霉菌菌悬液的配制
将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10 倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 x 108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
2.4 接种
2.4.1 接种方式
（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。
2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。
2.4.2 接种次数和时间
（1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期28 天。（一次加菌
的28 天微生物挑战实验）
（2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）
a法：第21天再接种一次，试验周期为28天。（有实验表明，第21天接菌和不接菌时，第28天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）
b 法：每隔两周接种一下，连续三次（即第1、3、5周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为49 天；
c法：每周接种一次，连续5次，试验周期为35天。（S&M公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30 个月内的防腐安全）
2.4.3 操作方法
称取待测样品30g，对应加入0.3ml浓度为1X107?1x i08cfu/ml的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5土 2.5C 的培养箱中培养，霉菌在22.5± 2.5C的培养箱中培养。
a. 水溶性样品
10g 加入90ml 无菌生理盐水，稀释后取1ml 样品液，加入9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml 样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
b. 油溶性样品
取10g 样品，加入10ml 无菌吐温-80 和10ml 无菌白矿油，再加70ml 无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；
吸取1ml 已稀释的样品液，加入9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为
1 0-1、 1 0-2、1 0-3、1 0-4、1 0-5、 1 0-6、1 0-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml 加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
2.5 培养
细菌放在32.5土25C的培养箱中培养；
霉菌在22.5± 2.5C的培养箱中培养；
混合菌在28 C的培养箱中培养。
2.6菌落计数
分别在0、7、14、21、28 天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。
菌落计数的标准方法：
①先选取平均菌落数在30?300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5?50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；
②有两个稀释度在30?300之间，求比值。若比值W 2,报告平均数；若比值＞2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；
③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；
④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；
⑤所有稀释度均在30?300 之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30 或300 的平均菌落数计算；
⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；
⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后X 2,以报告全皿菌落数。
2.7评价标准
2.7.1 CTFA 推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准
CTFA 的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml ）和
1000000cfu/g（ml）（CFU 为菌落单位），要求在第7 天时霉菌降低90%，细菌降低
99.9%，并且在28天内菌数持续下降。
2.7.2美国评价标准
在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表3所示。
表3美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准
2.7.3国内评价标准
国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。
表4国内所用微生物防腐挑战实验评价标准
第二部分实验室可采取的方案
1实验样品
2微生物挑战性实验
2.1实验菌株
金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆
菌
2.2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
2.3试验用菌液的配置
实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37C（细菌）和28 C （霉菌）培养箱中培养。细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10A8CFU/ml ）和霉菌悬液（10A6CFU/ml ）,置于4C冰箱储藏备用。
2.4 一次加菌的28天微生物挑战实验
量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10A6~10A7CFU/ml，霉菌浓度为10A4~10A5CFU/ml，充分混匀。将样品在28摄氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d取样品分析含菌量（培养计数法）。
2.6评价标准
微生物挑战性实验方法 1.0目的 新产品防腐效果的测试 2.0 范围 公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2微生物挑战性实验 4. 2. 1受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验 此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后
充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。 分析与检测 4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断 受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌
化妆品微生物挑战试验 刘树葆臧跃扬桂菊 （天津化妆品科学技术研究皖有强公司） 摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。 关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。 目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。 评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。 １．实验方法 ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验 ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。 １．２试验仪器 恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。 Ｉ．３．培养基和试剂 生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。 ｌ＿４挑战用微生物 测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。 菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。 １．５待测样品 选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。 １．６接种的方式和数量 接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。 接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８。Ｃ（霉菌培养箱中培养。
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go 2微生物挑战性实验 2.1实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国菌株 （药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉 大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V 金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同） 德国 （S&M公
日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 至少选一种 发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 至少选两种 非发酵革兰氏阴性杆菌 变形菌属 日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋 葱假单胞菌荧光假单胞菌 至少选一种 酵母 恶臭假单胞菌 黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母 至少选一种 霉菌近平滑假丝酵母 黑曲霉 至少选一种 产芽砲菌 黄绿青霉 枯草芽砲杆菌 供选用 生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基 牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基
2.3试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡 摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4接种 2.4.1接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
摘要：对建立化妆品防腐体系的各种要素进行了分析，就国内外有代表性的微生物挑战试验的评价方法进行了比较，提出了符合实践情况并适用于我国化妆品行业的化妆品防腐体系的效能测试方法的评价标准，还为化妆品防腐体系筛选过程的快速判定提供了经验依据。 关键词：化妆品；防腐剂；防腐体系；微生物挑战试验 大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，环境中的微生物一俟进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。因此，一个良好的防腐体系，对于化妆品产品来说是必不可少的。 1 化妆品的防腐体系 化妆品的防腐体系实际上是由若干种防腐剂（和助剂）按一定比例构建而成。防腐体系的基本要素是防腐剂，但其效能大小又与其用量和使用对象的剂型（液态、粉状、乳状、膏霜状等）特性、组成（是否含碳水化合物、蛋白质、动植物抽提物等）、pH值、可能污染的微生物种类和数量等密切相关。 1.1化妆品防腐剂 早期使用的防腐剂有：尼泊金脂类、苯甲醇、烷基二甲基苄基铵氯化物、对氯间二甲酚、苯氧基乙醇、布罗波尔（Bronopol，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-丙二醇）、道维希尔200（Dowicil-200,六亚甲基四胺衍生物）、杰马-115(Germall-115，咪唑烷基脲)、脱氢醋酸、甲醛、山梨酸等。这些防腐剂至今很多仍在使用。近期推广商品化的化妆品防腐剂见表1。至于复配而成的防腐剂商品更是数不胜数。 防腐剂对微生物的最低抑制浓度（cmc）是判断一种防腐剂效果的首先考虑的基本指标，MIC值越小，表明其效力越高。表2是某些化妆品防腐剂对主要测试微生物的MIC。 表1一些化妆品防腐剂商品及化学成分 商品名称化学成分 Enxylk400 甲基二溴戊二腈和苯氧乙醇 Biopure100 咪唑烷基脲 Nipaguard DMDMH 二甲基二羟基乙内酰脲 Nipaguard TCC N-（4-氯苯基-N-3，4-二氯苯基）脲
迪美RMT 化学组成：2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和3-碘-2-丙炔基-丁基氨基甲酸酯 质量指标： 1.性状：无色至淡黄色透明液体 2.活性物含量：≥7.0% 应用：可用于面霜、乳液、婴儿产品、防晒产品、香波、湿纸巾以及其它停留在皮肤上的产品。 配伍性：可于化妆品中存在的各种组分相配伍，实验结果表明其抑菌能力不受化妆品中的表面活性剂、蛋白质、中草药、ZPT以及Parsol 1789等添加物的影响。 抗菌性能：广谱抗菌活性，能有效地抑制革兰氏阴性菌、阳性菌、酵母菌及霉菌。 用量及特点： 1.一般添加量为0.05~0.2%，用户也可根据自己产品的特点，试验筛选用量比例，在低于45℃最后加入较好。 2.pH值使用范围为：2~12。适用pH值范围广泛，可以覆盖所有化妆品、日化产品的pH值范围。 3.本品使用方便、性能稳定、安全可靠，在使用浓度下对皮肤、眼粘膜均无刺激性，对环境无污染。 4.每一种化妆品均需各自独特的防腐体系来保证其防腐效果，因此，每一种新开发或改进的产品，均需进行挑战性试验，以确保其防腐效果。 对微生物的抑杀效果 微生物菌种最低抑制浓度(ppm) 枯草芽孢杆菌200 表皮葡萄球菌200 肺炎杆菌200 大肠杆菌150 铜绿假单胞菌300 黑曲霉20 桔青霉20 杂色曲霉20 蜡叶芽枝40 绳状青霉20 毒理试验：急性口服毒性试验（大鼠）： L D50 = 1210mg/kg 急性皮肤刺激试验（家兔）：无刺激性（0.1%浓度）
迪美RMB 化学组成：2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇 质量指标： 1.性状：无色至淡黄色透明液体 2.活性物含量：≥19.0% 应用：可用于面霜、乳液、婴儿产品、防晒产品、香波、湿纸巾以及其它停留在皮肤上的产品。 配伍性：可于化妆品中存在的各种组分相配伍，实验结果表明其抑菌能力不受化妆品中的表面活性剂、蛋白质、中草药、ZPT以及Parsol 1789等添加物的影响。 抗菌性能：广谱抗菌活性，能有效地抑制革兰氏阴性菌、阳性菌、酵母菌及霉菌。 用量及特点： 1.一般添加量为0.05~0.2%，用户也可根据自己产品的特点，试验筛选用量比例，在低于45℃最后加入较好。 2.pH值使用范围为：2~12。适用pH值范围广泛，可以覆盖所有化妆品、日化产品的pH值范围。 3.本品使用方便、性能稳定、安全可靠，在使用浓度下对皮肤、眼粘膜均无刺激性，对环境无污染。 4.每一种化妆品均需各自独特的防腐体系来保证其防腐效果，因此，每一种新开发或改进的产品，均需进行挑战性试验，以确保其防腐效果。 对微生物的抑杀效果 微生物菌种最低抑制浓度(ppm) 枯草芽孢杆菌200 表皮葡萄球菌200 肺炎杆菌200 大肠杆菌150 铜绿假单胞菌300 黑曲霉20 桔青霉20 杂色曲霉20 蜡叶芽枝40 绳状青霉20 毒理试验：急性口服毒性试验（大鼠）： L D50 = 1210mg/kg 急性皮肤刺激试验（家兔）：无刺激性（0.1%浓度）
紫外可见分光光度计法测定食品中防腐剂的含量 一、实验目的 1.进一步了解和熟悉紫外-分光光度计的原理和结构，以岛津UV-2450为例学习紫外分光光度计的操作。 2.掌握利用紫外分光光度法测定苯甲酸和山梨酸的吸收光谱图。 3.掌握标准曲线法测定样品中苯甲酸和山梨酸及其钠盐和钾盐的含量。 二、实验原理 为了防止食品在储存、运输过程中发生腐蚀、变质，常在食品中添加少量防腐剂。防腐剂使用的品种和用量在食品卫生标准中都有严格的规定，苯甲酸和山梨酸及其钠盐、钾盐是食品卫生标准允许使用的主要防腐剂之一。 苯甲酸具有芳香结构，在波长225nm和272nm处有K吸收带和B吸收带。根据苯甲酸（钠）在225nm处有最大吸收，测得其吸光度即可用标准曲线法求出样品中苯甲酸的含量。山梨酸具有α,β-不饱和羰基结构，在波长255nm处有π—π*跃迁的K吸收带，因此可根据它们的紫外吸收光谱特征可以对它们进行定性鉴定和定量测定。 由于食品中防腐剂用量很少，GB2760-2011 规定0.2-1.5g/kg，并且食品样品中其它的成分也可能对防腐剂的测定具有干扰作用，因此一般可预先将样品中的防腐剂与其它成分进行分离，再经过提纯和浓缩进行测定。常用的分离方法包括蒸馏法和溶剂萃取法等。 本实验采用溶剂萃取法，先用HCl溶液将样品进行酸化，再利用乙醚将这两种防腐剂品从样品中萃取出来，然后将乙醚蒸发，剩下的萃取物经过碱性溶液（NaOH）溶解与处理。最后对照标准物质，利用紫外分光光度计对目的成分进行检测。 三、实验仪器和试剂 1.紫外可见分光光度计UV2450（日本岛津），1.0cm石英比色皿，50mL容量瓶。 2.HCl溶液（1:1）、NaOH溶液（40g/L）、NaCl溶液（5%）。 3.苯甲酸钠标准溶液的配制 （1）苯甲酸钠标准贮备液（1.000g/L）：准确称量经过干燥的苯甲酸钠 1.000g（105℃干燥处理2h）于1000mL容量瓶中，用适量的蒸馏水溶解后定容。该贮备液可置于冰箱保存一段时间。 （2）苯甲酸钠标准溶液（32mg/L）：准确移取苯甲酸钠储备液32.00mL于1000mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释定容。 （3）系列标准溶液的配制：分别准确移取苯甲酸钠标准溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL 、 2.00mL和2.50mL于5个10mL容量瓶中，用NaOH溶液稀释定容。得到浓度分别为
光谱技术在食品分析中的应用 实验四食品中防腐剂的测定-紫外可见分光光度法 一、实验目的 1、了解紫外可见分光光度计仪器的基本结构和原理； 2、学会紫外可见分光光度计仪器的操作技术； 3、了解食品中防腐剂的测定意义； 4、学会用此法测定山梨酸。 二、基本原理 用三氯甲烷从样品中提取出山梨酸，再以碳酸氢钠提取，使山梨酸形成钠盐溶于水溶 液中，山梨酸钠水溶液在254nm处有最大的吸收峰，测其吸光度可对其定量。 三、仪器和试剂 1、仪器 （1）紫外分光光度计UV-2450（岛津），石英比色皿 （2）组织捣碎机 2、试剂 （1）三氯甲烷：以三氯甲烷体积之半的碳酸氢钠（0.5mol/L）提取两次，用无水硫酸钠干燥，过滤备用。 （2）0.5mol/L碳酸氢钠：取21克碳酸氢钠溶于500毫升水中。 （3）0.3mol/L碳酸氢钠：将13.6克碳酸氢钠溶于500毫升水中。 （4）6mol/L盐酸 （5）山梨酸标准液（100微克/毫升）：准确称取100毫克山梨酸于1000毫升容量瓶中，用0.3mol/L碳酸氢钠稀释至刻度，使用时再稀释成50ug/ml的山梨酸标准使用液。 四、实验步骤 1、样液的制备：称取50.0克样品加450毫升水于组织捣碎机中，搅5分钟，取10克匀浆于50毫升容量瓶中，以水定容，移取10毫升此溶液于分液漏斗中，加6mol/L盐酸 1～2滴酸化，用50毫升氯仿提取1分钟，将氯仿层分至250毫升带塞锥形瓶中，用3克 无水硫酸钠干燥，振摇后静置。 2、标准曲线的绘制：取25毫升比色管5支，分别加入山梨酸标准使用液0、0.5、 1.0、1.5、 2.0毫升，用0.3mol/LNaHCO3稀释至刻度，于254nm处测吸光度，作标准曲线。 3、样品中山梨酸的测定：取上述氯仿液25毫升于125毫升分液漏斗中，用25毫升 0.3mol/L碳酸氢钠提取1分钟，静置分层后，小心放出氯仿层，测水层吸光度，从标准曲
防腐挑战性实验规程 一、目的 本方法及标准摘自欧盟标准BP2002 XVIC EFFICAIY OF ANTIMICROBIAL PRESERVATION,测定化妆品抵抗微生物的能力。 二、材料及工具 1.待检样品600g（实际操作中常用300g以节约样品）； 2.电子秤1台、不锈钢勺子、200ml烧杯、10ml试管、150ml三角烧瓶、酒精灯1盏、1ml移液枪（100～1000μL）、1ml移液枪枪尖、灭菌培养皿、0.85%灭菌生理盐水； 3.适量普通营养琼脂培养基、虎红培养基； 4.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠艾希氏菌、黑曲霉、白色念珠霉菌的菌种各1支，其菌种传代次数<5代。 三、步骤 1.标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。 2.细菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 3.霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀； 用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们
所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 4.分别称取待测样品100g，倒入5个烧杯中，分别标记大、金、绿、黑、白及日期。 5.分别在5个烧杯中，对应加入1ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌菌悬液及霉菌菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。 6.水溶性样品 10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取1ml样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。 7.油溶性样品 取10g样品，加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀； 吸取1ml已稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。 8.培养 细菌放在32.5±2.5℃的培养箱中培养48h； 霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养5天。 9.分别在2天、7天、14天、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。 10.菌落计数的标准方法 ①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围； ②有两个稀释度在30～300之间，求比值。若比值≤2，报告平均数；若比值>2，以其中较小的稀释度计算细菌总数； ③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；
饮料中防腐剂含量的检测 1 引言 随着食品工业的发展，防腐剂的种类也由过去单一苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类发展到了更加丰富多样的产品。如丙酸盐、对羟基苯甲酸酯等。近年来，天然食品防腐剂也得到了人们重视与发展，如壳聚糖、海藻糖等。 苯甲酸钠作为一种常用的防腐剂，成人日允许摄入量(ADI)为0－5mg/kg。过量摄入防腐剂会对人体部分器官造成不同程度的损害, 我国大部分地区的食品都不同程度地存在过量使用防腐剂的情况，因此检测它在食品中的使用量，对于保障人们身体健康具有非常重要的现实意义。 2紫外光谱法对苯甲酸钠含量的测定 3.1 药品与仪器苯甲酸钠标准溶液(0.032g/L)；蒸馏水；紫外 -可见分光光度计（Agilent-8453）。 3.2 实验方法取7.5mL标准溶液于50mL容量瓶中，并加蒸馏水至刻度。用1cm比色皿，以蒸馏水为参比，用紫外 -可见 分光光度计测定紫外吸收光谱，见图1中曲线3。选择最大吸收波长为224nm，分别取标准溶液2.5mL； 5.0mL；10.0mL；12.5mL于50mL容量瓶中用蒸馏水稀释到刻度。以蒸馏水为参比，测定紫外吸收光谱（见图1中曲线1、 2、 4、 5）。得到不同浓度下各溶液的最大吸光度（见表1） 图1 各溶液的紫外吸收光谱图2 苯甲酸钠溶液的浓度与吸光度关系图(224nm) 表1 不同浓度苯甲酸钠溶液的吸光度（224nm） 3.3 稳定性检测选择溶液3，放置10min， 20min， 30min， 60min， 90min， 120min
后，进行紫外光谱测定，得到的紫外光谱图中最大吸光度基本没有发生变化，说明苯甲酸钠溶液的稳定性很好（见表2）。 表2 稳定性实验结果（224nm） 3.4 线性关系的确定以不同浓度的苯甲酸钠溶液为横坐标，选择224nm最大吸收波长对应的吸光度为纵坐标，扣除背景影响，选择可能不过零点的直线方程，绘制直线（见图2）。 3.5 样品中苯甲酸钠含量的测定分别取3种饮料样品，用不含苯甲酸钠的饮料为参比液(即饮料相应的水果汁)，用紫外-可见分光光度计进行检测，结果见表3。从表3可知不同样品中苯甲酸钠的含量不同。 表3 不同样品中苯甲酸钠的吸光度及含量（224nm）
化妆品防腐性能挑战性试验及评价标准化妆品防腐挑战性试验及评价标准 投产前对产品防腐体系的可靠性做效能测试是十分必要的，目前，国内外配方设计时普遍采用防腐挑战性试验评价防腐剂的有效性。防腐挑战性试验更接近实际应用，该方法能够模拟化妆品生产和使用过程中受到高强度的微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适宜条件，从而避免由微生物污染造成的损失和为消费者健康提供可靠的保证。 1.CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准 CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g(ml)和 1000000cfu/g(ml)(CFU为菌落单位)，要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。美国在CTFA评价方法的基础上提出更为严格的标准，即，若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100 cfu/g(ml)以下，28天全部为0，则视为效果优良通过挑战试验;若第七天时下降到1000 cfu/g(ml)以下，则视为勉强通过;若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求，防腐体系则评定为无效。 2.国内参照CTFA加菌防腐挑战性试验及评价标准 初始接种细菌量1000000 cfu/g(mL) (1)第28天时，样品中含细菌或霉菌,1000cfu/g(mL)该样品不能通过微生物攻击的挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地志到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。 (2)第28天时，样品中含细菌或霉菌在100 cfu/g-1000 cfu/g(mL)，该样品有条件地通过挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时
第一部分防腐挑战实验调研结果 1 实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。 2 微生物挑战性实验 2.1实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 菌株 美国 (药典) 美国 (ISP公司) 英国 (药典) 德国 (Henkel公司) 德国 (S&M公司) 白假丝酵母√√√√√黑曲霉√√√√√红色青霉√ 绿色木霉√ 绳状青霉√大肠埃希氏菌√√√√镉绿假单胞菌√√√√金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√ 产气肠杆菌√ 表皮葡萄球菌√日勾维肠杆菌√洋葱假单胞菌√√
肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√ 表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 至少选一种表皮葡萄球菌 发酵革兰氏阴性杆菌肺炎克雷伯氏菌 至少选两种阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 变形菌属 日勾维肠杆菌 非发酵革兰氏阴性杆菌铜绿假单胞菌 至少选一种洋葱假单胞菌 荧光假单胞菌 恶臭假单胞菌 黄杆菌属 不动杆菌属 酵母 白假丝酵母 至少选一种近平滑假丝酵母 霉菌 黑曲霉 至少选一种黄绿青霉 产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上
2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基 2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4 接种 2.4.1接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
1.0目的 新产品防腐效果的测试 2.0 范围 公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1 化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2 微生物挑战性实验 4. 2. 1 受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于 37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2 一次加菌的28 天微生物挑战试验 此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g 样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡
混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。 分析与检测 4. 2. 3 重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断 受试样品一次加菌和 3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌的防腐力; 但若大于0. 1%, 即使在以后的测试时间内有逐渐下降至0 的趋
广州美尔生物科技有限公司，广州欣浪生物化工有限公司 防腐剂浓度对化妆品配方的防腐挑战试验结果对比 防腐剂是化妆品中必不可少的成分，防腐剂的种类与含量对于化妆品来说非常重要。化妆品防腐体系是否能迎接由化妆品自身、使用者污染及环境污染滋生菌等方面产生的挑战至关重要，防腐体系必须有助于防止微生物污染物的增长，保护产品不变质或损害其预期的效果。 添加防腐剂或防腐剂组合的效果取决于其与产品的独特成分配方的相互作用。正是由于这一原因，很难完全根据化妆品成分列表选择出适当的防腐剂。 评价化妆品中防腐体系是否具有足够的防腐能力，需通过对完整的化妆品配方进行防腐挑战试验来实现。防腐挑战试验通过给化妆品样品添加细菌和真菌，并在测试期内定期评估其受污染程度。对于防腐挑战测试结果显示防腐功效不足的产品，将通过调整产品的配方来达到防腐性能，对于化妆品配方优化具有重大的意义。本文从“防腐剂浓度对化妆品配方的防腐挑战试验结果的影响”切入，从而阐述这一防腐性能评价方法。 实验用细菌选取金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）；真菌选取白假丝酵母（白色念珠菌）、黑曲霉作为测试菌种。分别培养，实验选取第4-10代菌株。分别配制混合细菌悬液或混合真菌悬液，分别接种到精华及膏霜样品中，使细菌初始浓度为1x106cfu/mL，真菌初始浓度为1x105cfu/mL，细菌和真菌分别在37℃和28 ℃下培养进行培养。分别于0h、1d、7d，14d时取样稀释，通过平板计数法计算每g/mL样品中菌数目，过程中可另外选取时间点进行更精细的计数。 本次实验挑战用菌选取真菌，对同防腐剂浓度的精华及膏霜体系进行防腐挑战试验，结果如下： 注：①体系防腐剂均使用Esonal OSM-308，为辛酰羟肟酸的复配物，为欣浪生化防腐剂单位：cfu/mL ②＜10表示无菌生长 结果显示，3h时，随着防腐剂浓度的增大，菌浓度减小；1d时0.8%精华及1.0%精华完全杀灭；7d时0.5%精华完全杀灭；14d时0.3%依然有菌生长，浓度还出现反弹。表明配方体系的防腐抑菌能力与防腐剂浓度有关，浓度越大，抑菌效果越好。
实验食品中防腐剂的紫外光谱测定 一、实验目的 通过实验了解食品防腐剂的紫外光谱吸收特性，并利用这些特性对食品中所含的防腐剂进行定性鉴定。 掌握最小二乘法处理光度分析数据的方法并对食品中防腐剂的含量进行定量测定。 二、实验原理 为了防止食品在储存、运输过程中发生变质、腐败，常在食品中添加少量防腐剂。防腐剂使用的品种和用量在食品卫生标准中都有严格的规定。苯甲酸和山梨酸以及它们的钠盐、钾盐是食品卫生标准允许使用的两种主要防腐剂。苯甲酸具有芳烃结构，在波长228nm和272nm处有K吸收带和B吸收带；山梨酸具有α、β不饱和羰基结构，在波长250nm处有π→π＊跃迁的K吸收带,因此根据它们的紫外吸收光谱特征可以对它们进行定性鉴定和定量测定。 由于食品中防腐剂用量很少，一般在千分之一左右，同时食品中其它成分也可能产生干扰，因此需要预先将防腐剂与其它成分分离，并经提纯浓缩后进行测定。常用的从食品中分离防腐剂的方法有蒸馏法和溶剂萃取法等。本实验采用溶剂萃取的方法，用乙醚将防腐剂从样品中提取出来，再经碱性水溶液处理及乙醚萃取以达到分离、提纯的目的。 采用最小二乘法处理标准溶液的浓度和吸光度数据，以求得浓度与吸光度之间的回归直线方程，并根据直线方程计算样品中防腐剂的含量。 三、仪器、试剂及材料 1. 仪器：UV-2000紫外可见分光光度计和TU-1901紫外可见分光光度计；电子天平；带盖石英比色皿2个；分液漏斗 150mL，250mL；容量瓶 0mL，25mL，100mL；移液管 1 mL ，2mL，5mL，10 mL 2. 试剂：苯甲酸；山梨酸；乙醚；NaCl；NaHCO3(1％水溶液）；HCl（0.05mol·L-1，2mol·L-1） 待测样品：饮料、果汁、果酱或酱油。(学生自备) 四、实验步骤 1. 认真阅读UV-2000紫外可见分光光度计的操作说明书。 2．样品中防腐剂的分离 准确称取待测样品2.0g，用40mL蒸馏水溶解，移入150mL分液漏斗中，加入适量的粉状NaCl，待溶解后滴加 0.lmol·L-1HCl，使溶液的pH＜4。依次用30mL、25mL和20mL3份乙醚萃取样品溶液，合并乙醚溶液并弃去水相。用2份30mL0.05mol·L-1HCl洗涤乙醚萃取液，弃去水相。然后用3份20mL1％NaHCO3水溶液萃取乙醚溶液，合并NaHCO3溶液，用2mol·L-1HCl酸化NaHCO3溶液并多加 lmL，将该溶液移入250mL 分液漏斗中。依次用 25mL、25mL、20mL乙醚分3次萃取已酸化的NaHCO3溶液，合并乙醚溶液并移入100mL 容量瓶中，用乙醚定容后吸取2mL于10mL容量瓶中，定容后供紫外光谱测定。 3．防腐剂定性鉴定 取经提纯稀释后的乙醚萃取液，用1cm的石英吸收池，以乙醚为参比，用TU-1901紫外可见分光光度计在波长210～310nm范围作紫外吸收光谱，根据吸收峰波长及吸收强度确定防腐剂的种类。 4．制作工作曲线 ⑴配制苯甲酸（或山梨酸）标准溶液 准确称取0.20g苯甲酸，用乙醚溶解，移入50mL容量瓶中定容，吸取该溶液2mL用乙醚稀释至50mL，此溶液含苯甲酸为0.16mg·mL-1作为储备液。吸取10mL储备液于50mL容量瓶中，定容后成为32μg·mL-1苯甲酸标准溶液。 分别吸取苯甲酸标准溶液0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL和2.5mL于5个10mL容量瓶中，用乙醚定容。 ⑵用1cm吸收池，以乙醚作参比，在UV-2000紫外可见分光光度计上分别测定上述5个标准溶液的吸收光谱，并测定苯甲酸K吸收带吸收最大波长处的吸光度。 如果待测样品中含山梨酸，则可用同样方法配制山梨酸标准溶液并测定其K吸收带的吸光度。
康复新液药用塑料瓶铝箔封口密封性实验 1、目的： 通过微生物入侵的挑战性实验证明康复新液铝箔封口药用塑料瓶的密封性完好。 2、原理： 将灌装有康复新液的药用塑料瓶铝箔封口后浸泡于高浓度的菌液4小时，样品均无微生物入侵，证明铝箔封口密封性完好。 3、适用范围： 本实验适用于802、803车间康复新液药用塑料瓶铝箔封口的生产。 4、实验人员： 4.1生产技术部：负责实验的起草、实验的实施、实验数据的整理和审核。 4.2质量管理部：协助实验的起草，组织协调实验工作，并总结实验结果。 4.3化验室：负责按计划完成实验中的相关检验任务，确保检验结果的正确可靠。 4.4 802、803车间：协助实验工作的实施。 4.5质量授权人：负责实验内容和结果的审查。 5、实验内容： 5.1样品的制备 5.1.1制备方法： 由于康复新液富含营养物质，是微生物生长繁殖的理想环境，故可直接将康复新液作为微生物繁殖的培养基。 铝箔封口后连续取样100瓶，收集于一盘，做好标记，115℃灭菌30分钟。灭菌后每瓶进行编号，水平放置，使康复新液与铝箔封口内接缝充分接触，30-35℃放置14天，观察并记录瓶口是否长菌。 5.1.2判断标准： 所有样品均不应长菌。 5.1.3实验结果：
5.1.4小结： 实验人员：日期： 5.2确认康复新液促菌生长能力—营养性实验 5.2.1试验方法： 随机取试样20瓶，每瓶试样内接种0.1ml的铜绿假单胞菌ATCC 9027，菌液浓度：10～100CFU/0.1ml。在30～35℃下培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结果并记录。 5.2.2判断标准： 在紫外灯下康复新液呈蓝绿色荧光，且所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好。否则试验无效，须弃去全部试样，重新从头开始试验或改变培养基后重新开始试验。
环境与健康杂志２００８年２月第２５卷第２期ＪＥｎｖｉｒｏｎＨｅａｌｔｈ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００８，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２ ｗｉｔｈｎａｎｏｓｃａｌｅＴｉＯ２ｒｏｄｓａｎｄｄｏｔｓｉｎｒａｔｓ：ｔｏｘｉｃｉｔｙｉｓｎｏｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔｕｐｏｎｓｉｚｅａｎｄｓｕｒｆａｃｅａｒｅａ〔Ｊ〕．ＴｏｘｉｃｏｌＳｃｉ，２００６，９１：２２７－２３６． ＷａｎｇＪＸ，ＺｈｏｕＧＱ，ＣｈｅｎＣＹ，ｅｔａｌ．Ａｃｕｔｅｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｉｚｅｄｔｉｔａｎｉｕｍｄｉｏｘｉｄｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｍｉｃｅａｆｔｅｒｏｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ〔Ｊ〕．ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００７，１６８：１７６－１８５． 薛志刚，朱晒红，潘乾，等．硅纳米颗粒的生物毒理学研究〔Ｊ〕．中南大学学报医学版，２００６，３１（１）：６－８． 王天成，汪冰，丰伟悦，等．纳米锌对小鼠血清生化指标的影响〔Ｊ〕． 中国公共卫生，２００６，２２（８）：９３４－９３５． 王天成，孙红芳，贾光，等．纳米氧化铝对小鼠血清生化指标的影响〔Ｊ〕．中国职业医学，２００６，３３（３）：１７１－１７２． 王天成，贾光，王翔，等．纳米氧化铁黄材料对小鼠血清生化指标的影响〔Ｊ〕．实用预防医学，２００６，１３（３）：４８６－４８７． （收稿日期：２００７－１１－１４修回日期：２００８－０１－２２） （本文编辑：杜宇欣） ［５］［６］［７］ ［８］ ［９］ 文章编号：１００１－５９１４（２００８）０２－０１１４－０３ 几种防腐剂在化妆品中的作用效果评价 郑萍，陈西平 摘要：目的了解化妆品常用防腐剂在化妆品基质中的防腐效果。方法采用纯培养的微生物挑战性实验验证０．０５％，０．１％，０．２％，０．４％的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，０．１％，０．２％，０．３％，０．４％的咪唑烷基脲，０．０１％，０．０２％，０．０５％，０．１％的凯松，０．０１％，０．０２％，０．０３％，０．０５％布罗波尔对金黄色葡萄球菌（ＡＴＣＣ６５３８）、大肠杆菌（ＡＴＣＣ８７３９）、黑曲霉（ＡＴＣＣ１６４０４）、白色假丝酶母（ＡＴＣＣ１０２３１）的抑菌效果。结果在化妆品基质中，对羟基苯甲酸酯类防腐剂抑制细菌的能力较弱，对真菌的作用效果较好；咪唑烷基脲对真菌类的抑菌能力较差；布罗波尔的抑菌效果较好，凯松在允许使用的剂量范围内不能达到抑制微生物的作用。同时化妆品成分对防腐剂的作用效果有影响。结论仅０．４％对羟基苯甲酸丙酯、０．１５％和０．１％凯松、０．０５％布罗波尔通过了纯培养挑战性实验。筛选、复配防腐剂要根据化妆品的配方结合实际情况进行。 关键词：化妆品；防腐剂；微生物挑战性实验；纯培养 中图分类号：Ｒ１６８文献标识码：Ａ ＥｆｆｅｃｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓＣｏｍｍｏｎｌｙＵｓｅｄｉｎＡｃｔｕａｌＣｏｓｍｅｔｉｃｓＺＨＥＮＧＰｉｎｇ，ＣＨＥＮＸｉ－ｐｉｎｇ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｆｏｒＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＲｅｌａｔｅｄＰｒｏｄｕｃｔＳａｆｅｔｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２１，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅａｎｔｉｓｅｐｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅａｃｔｕａｌｃｏｓｍｅｔｉｃｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｓｉｎｇｌｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｏｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ＲｅｓｕｌｔｓＩｎｔｈｅａｃｔｕａｌｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，ｐａｒａｂｅｎｓｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｆｕｎｇｉｗｅｌｌｂｕｔｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｙｌｕｒｅａｗａｓｃｏｎｔｒａｒｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｗｅｌｌｂｕｔｆｕｎｇｉ．２－ｂｒｏｍｏ－２－ｎｉｔｒｏｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉｏｌｇｏｔｇｏｏｄｅｆｆｅｃｔ．Ｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｄｉｄｎｏｔｓｈｏｗａｎｅｆｆｅｃｔｉｎｔｈｅａｌｌｏｗａｂｌｅｒａｎｇｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｃｏｓｍｅｔｉｃｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｃｏｓｍｅｔｉｃｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｏｓｍｅｔｉｃｓaＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓaＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｅｓｔaＳｉｎｇｌｅｃｕｌｔｕｒｅ 作者单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所微生物研究室（北京１０００２１） 作者简介：郑萍（１９８０－），女，硕士研究生，从事环境微生物研究。 通讯作者：陈西平，Ｔｅｌ：（０１０）８３１３２３８１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｘｐ１１９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ【论著】 化妆品中一般都含有丰富的营养物质，容易造成微生物的污染，添加防腐剂是预防化妆品微生物污染的主要手段。但是防腐剂在预防微生物污染的同时，还是化妆品中的危险因素—— —引起化妆品性皮炎的因素之一。而且化妆品的成分复杂，主要有油性原料、粉质原料和水溶性聚合物等，其中干扰防腐剂作用效果的因素比较广泛，因此防腐剂的选择是化妆品研制的一个重要环节，既要达到防腐的效果又要尽可能地减少防腐剂的用量。目前对防腐剂的评价多是通过高效液相色谱法、气相色谱法等方法测定其在产品中的含量来进行。这类方法测定的结果只能定量而不能直接反映出该类产品中防腐剂的实际防腐效果。微生物挑战性实验是目前比较公认的评价防腐剂防腐效果的生物学方法，通过该方法可以选择既能有效抑菌又可以使产品安全的化妆品中防腐剂的最低浓度。但以往很多评价都是采用混合培养的方式进行的，没有排除微生物之间的相互影响因素，缺少防腐剂在化妆品中对具体微生物防腐效果的数据。化妆品常用防腐剂一般包括酚类、酯类、卤化物及季铵盐等［１］。我国一些地区的调查及美国ＦＤＡ关于化妆品防腐剂的使用情况公布显示对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、凯松使用频率排名在前三位［２，３］，其次咪唑烷基脲和布罗波尔的使用频率也比较高。笔者采用上述防腐剂，用纯培养的方式，探索在化妆品基质中不同防腐剂对不同菌株的作用效果，为防腐剂的选择提供依据。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１化妆品样品实验用化妆品为本实验室自制的样品，生产过程经过严格的无菌控制，防腐剂成分及含 １１４??