工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
培养基的设计与优化 原料：碳源,氮源 十大元素: 碳, 氢, 氧, 氮, 磷, 钾, 硫, 钙, 镁 微量元素: 硼, 锰, 锌, 钼, 钴, 碘, 铜, 等 生长因子、前体和产物促进剂 生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子，生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。 前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接为微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。产物促进剂 指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。其提高产量的机制还不完全清楚，其原因可能是多方面的，主要包括：有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。 水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 培养基的设计与优化 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。 培养基设计的基本步骤是： 1.根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分. 2.通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分。 3.当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。这些实验往往基于多因子实验，包含均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
课程设计说明书 课程名称：新编生物工艺学 设计题目: 培养基优化设计 院系：生物与食品工程学院 学生姓名： 学号：200806040035 专业班级：08生物技术 指导教师：关现军 2011 年6月3 日
课程设计任务书
目录 1.摘要··页码 2.关键字··页码 3.设计背景·页码 3.1培养基简介··页码 3.2培养基优化设计的重用意义··页码 4 设计方案·页码 4.1原材料制备··页码 4.2菌种的选择··页码 4.3营养因子的比例设··页码 4.4理化条件控制··页码 4.5总工艺流程列叙··页码 5 预期结果··页码 6 方案实施时可能出现的问题与对策·页码 7 设计感受··页码 7.1 关于本方案··页码 7.2 关于自我··页码 8参考文献··页码 .
1 摘要 以改良ＭＲＳ发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋白陈等７个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化。利用Ｌ8（２的7次方）正交实验，优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆３％、牛肉膏１％、乳糖１％。研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的ＭＲＳ培养基发酵液中，３７℃培养２０ｈ，菌落数均高于原ＭＲＳ培养基发酵液的菌落数，达到１护ｃｕｍＬ以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约４0％，同时使菌种数量达到最大。 2 关键字 乳酸菌，营养因子，优化培养，最大产菌 3. 设计背景 3.1乳酸菌培养基简介 乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要意义。设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌种的适应期，利于增值。 乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂,影响生长的因素多,在实际工作中还应做其他条件的优化,如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等,因工作量大而时间有限,只能对配方作初步的优化设计。为了降低生产成本,在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解,用以提高增菌效果,再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物,在发酵罐内完成乳酸
现代抗生素工业生产过程如下： 菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装 一、菌种 从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱(-190℃~-196℃)内保存。所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。 二、孢子制备 生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5-7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。 三、种子制备 其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养。或直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。在种子罐中培养时，在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。接种量视需要而定。如用菌丝，接种量一般相当于0.1%—2%(接种量的%，系对种子罐内的培养基而言，下同) 。从一级种子罐接入 二级种子罐接种量一般为5%—20%，培养温度一般在25—30℃。如菌种系细菌，则在32—37℃培养。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气。控制
放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取 一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基 本原理和操作技术 二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线
菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
枯草芽孢杆菌发酵培养基 及发酵条件优化 焉兆萍，宋士良，陆克文 (上海邦成生物工程有限公司，上海 201506) 中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A文章编号：1001-0769(2019)01-0051-05 枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境；能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。枯草芽 孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2]；其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。 本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。1 材料与方法 1.1 供试菌种 枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。 1.2 培养基 LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。 LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL，pH 7.2。 1.3 种子液的制备 将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。 1.4 液体种子生长曲线的测定 将液体种子以1％接种量分别接入盛有100 mL种子液体培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h、26 h和27 h，分别取样测其吸光度(OD 600 )。 摘 要：本文对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化。采用单因素试验和正交试验方法， 确定该枯草芽孢杆菌的优化培养基为：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、 磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铵0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸亚 铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L。最适发酵条件为：初始pH 7.2，接种量5％，发酵温度35 ℃，摇床转速 250 r/min。 关键词：枯草芽孢杆菌；发酵培养基；发酵条件 | 2019年第39卷第01期 总第264期 |51
一、名词解释 1、分批发酵：在发酵中，营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气 进入和尾气排出外，与外部没有物料交换。 2、补料分批发酵：又称半连续发酵，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统不 加一定物料的培养技术。 3、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到 产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 4、接种量：移入种子的体积 接种量＝————————— 接种后培养液的体积 5、次级代谢产物：是指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些 对微生物的生命活动无明确功能的物质过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。 6、实罐灭菌：实罐灭菌（即分批灭菌）将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通 入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，在冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，也叫间歇灭菌。 7、种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 8、倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 二、填空题 1、微生物发酵培养（过程）方法主要有分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。 2、发酵过程工艺控制的只要化学参数溶解氧、PH、核酸量等. 3、发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。 4、微生物的培养基根据生产用途只要分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 5、常用灭菌方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌 6、发酵过程工艺控制的代谢参数中物理参数温度、压力、搅拌转速、功率输入、流加数率和质量等 7、染菌原因：发酵工艺流程中的各环节漏洞和发酵过程管理不善两个方面。 8、发酵产物整个分离提取路线可分为：预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化和成品加工加工等五个主要过程。 9、发酵过程主要分析项目如下：pH、排气氧、排气CO2和呼吸熵、糖含量、氨基氮和氨氮、磷含量、菌浓度和菌形态。 三、填空题 1．一类单细胞有分枝的丝状微生物，以孢子繁殖，分布广泛大多是腐生菌，少数是动植物寄生菌，是抗生素的主要产生菌，2/3以上抗生素由该类菌产生。这类微生物是：C A．细菌B．霉菌
《抗生素发酵工艺学》知识要点 （1）发酵工业的生产水平取决于三个要素，即生产菌种、生产工艺、生产设备。 （2）目前无菌检测的方法主要四种，即镜检法、肉汤培养法、平板划线培养和发酵过程异常现象观察法。 （3）发酵醪中菌体分离一般采用离心分离和过滤分离两种方法。（4）在微生物培养过程中，引起培养基pH值改变的原因主要有营养成份的消耗和代谢物的累积等。 （5）发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。 （6）发酵工业中常用灭菌方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌。 （7）常用工业微生物可分为细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四大类。（8）常用菌种保藏方法有斜面保藏法、沙土管保藏法、液体石蜡保藏法和真空冷冻保藏法等 （9）发酵高产菌种选育方法包括自然选育、杂交育种、诱变育种、基因工程育种、原生质体融合 （10）发酵产物整个分离提取路线可分为预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化和成品加工等五个主要过程。 （11）工业微生物菌种可以来自自然分离，也可以来自从微生物菌种保藏机构单位获取。 （12）环境无菌的检测方法有显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程的异常观察法等。 （13）发酵罐发酵过程中的物理检测参数有温度、转速、压力、搅拌转速和空气流量）。 （14）前体：是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大提高的化合物。
（15）发酵生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 （16）生理性酸性物质：经微生物代谢等作用后能形成酸性物质使培养基pH值下降的营养物质。 （17）限制性基质：微生物生长速率与底物浓度有一定的依赖关系，当底物浓度很小，微生物生长速率与底物浓度成正比，此时基质叫限制性基质。 （18）发酵热：所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？ 在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水 分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就 叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热 小，温度上升。 （19）染菌率：总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在 内。 （20）连消：连消也叫连续灭菌，就是将将配制好的并经预热（60～75℃）的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使其在短时间内达到灭菌温度 （126～132℃），然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持5～7分钟 后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）的 发酵罐内的培养基灭菌方法。其过程均包括加热、维持和冷却等灭菌操作过程。（21）DE值（葡萄糖值）：表示淀粉水解程度及糖化程度，指葡萄糖（所有测定的还原糖都当作葡萄糖来计算）占干物质的百分率。 （22）补料分批培养：在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以 发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种 方法很多。 （23）次级代谢产物：从初级代谢途径中形成分枝代谢途径，并用初级代谢产物生成与菌体生长繁殖无关的物质或功能还未明的化合物，这个过程称次级代谢。
抗生素的发酵生产工艺 镇 专业生物科学专业 年级2012级
1抗生素定义（别名：抗细菌剂） 抗细菌药（英语：antibacterial）也称为“抗细菌剂”，是一类用于抑制细菌生长或杀死细菌的药物。在不引起歧义的情况下，抗细菌药也可简称为“抗菌药”。抗细菌剂与抗生素并不是相同的概念，抗生素实际上仅为抗细菌剂下的一类。抗细菌药除了包括青霉素类、四环素类等抗生素，还包括抗真菌药以及磺胺类、喹诺酮类等药物。 2基本简介 抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代产物或人工合成的类似物。20世纪90年代以后，科学家们将抗生素的围扩大，统称为生物药物素。主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，一般情况下对其宿主不会产生严重的副作用。2011年10月18日，中国卫生部表示，在中国，患者抗生素的使用率达到70%，是欧美国家的两倍，但真正需要使用的不到20%。预防性使用抗生素是典型的滥用抗生素。 3抗生素的分类 糖的衍生物：主要由氨基己糖的衍生物组成。 多肽类抗生素：主要或全部由氨基酸组成，有多肽或蛋白质的某些特性。 多烯类抗生素：分子结构中有多个双键。 大环酯抗生素：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成一个巨大的芳香酯化合物。 四环类抗生素：都具有四个缩合苯环。
嘌呤类抗生素：都含有嘌呤环。 4抗生素的作用机理 ①阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡。哺乳动物的细胞没有细胞壁，不受这类药物的影响。喹诺酮类抗生素三大不良反 喹诺酮类抗生素三大不良反 ②与细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，让细菌部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。 ③与细菌核糖体或其反应底物（如tRNA、mRNA）相互所用，抑制蛋白质的合成——这意味着细胞存活所必需的结构蛋白和酶不能被合成。 ④阻碍细菌DNA的复制和转录，阻碍DNA复制将导致细菌细胞分裂繁殖受阻，阻碍DNA转录成mRNA则导致后续的mRNA翻译合成蛋白的过程受阻。 5抗生素的发酵生产工艺 （1）制备过程 菌种——孢子制备——种子制备——发酵——发酵液预处理——提取及精制——成品包装 （2）具体介绍 ①菌种 来源于自然界，获得能产生抗生素的微生物，经分离、选育和纯化后即称为菌种。 菌种的保藏：冷冻干燥、超低温冷冻、砂土管、液体石蜡、斜面低温保藏。
方法一： LB培养基、平板保存的工程菌HB101/pJJ－rhIFNα2B、Amp、酵母提取物、蛋白胨、 10×SAE、100×MgCl2、100×TES、Tris、HCl 10×SAE配方(1L)： KH2PO410g、K2HPO4·3H2O52.4g、NH4Cl10g、K2SO426g 100L 【步骤】 种子制备： 1、取100mLLB培养基加入到一无菌的500ml三角形中，同时加入100μl100mg/ml的Amp。 2、接种甘油管保存的工程菌HB101/pJJ/rhIFNα-2b100μl，使工程菌分散于培养液中。 3、盖好试管，在摇床上以220rpm的速度，于37℃培养至对数中期（约5小时） 上罐准备： 1、配置500ml10×SAE 2、配置发酵培养基(3L)
称取胰蛋白胨30g，酵母提取物90g，加入2.64L去离子水，搅拌溶解后加入300ml 10×SAE、30ml100×MgCl2、30ml100×TES。 3、将培养基加入到5L发酵罐，插入pH、溶氧电极和温度探头，装上空气过滤膜，包扎好后放入灭菌锅中，同时放入一瓶250ml30%磷酸（调pH用），于1.05kg/cm2高压下蒸汽灭菌30min。 4、待灭菌结束后，将发酵罐放在冷却底座上，开启发酵罐控制系统，联接好冷凝水、空气线路。 5、控制pH=7.4，在转速650r/m、通气量3L/min 定D.O.为100％于自动控制发酵罐上37℃发酵22小时。 6、当培养基温度冷却到37℃后，接入制备好的种子 7、从接种完时刻起，每两小时取适当量样品，其中取1ml用于测菌体浓度（A600nm）；另取1ml加入到一称过重ep管中，12000rpm离心，小心取出900μl上清用作测菌体浓度的空白，甩干后再次称重，计算菌体湿重，按每8.3mg菌体湿重加入300μL水重悬菌体，冻于-20℃备用。并记录发酵罐上溶氧、pH、温度等参数以了解工程菌的生长状态。 8、SDS－PAGE检测不同时间rhIFNα2B的表达情况。 9、发酵终了，收集发酵液，8000rpm离心10min，回收菌体。 10、用1.2L去离子水重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清 11、再用600mlTE重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清,得到菌体-20℃保存 方法二： 2.1种子培养基的配制 LBA：（Tryptone蛋白胨10g ＋Yeast Extr+acts酵母粉5g ＋NaCl 5g ＋双蒸水1L）∕L （NaOH调节PH至7.0）高压蒸气灭菌，压力：0.14Mpa 温度121℃时间：20min，用前加卡那霉素至50μg/ml。 LBA平板：加入2%琼脂粉，其余同上。 2.2生产菌种的制备 2.2.1琼脂培养基菌种的制备 从－80℃的冰箱中取出甘油种子管，在超净工作台中划LBA平板，37℃培养箱中培养过夜。2.2.2一级种子液制备 从LBA平板中挑取单菌落，在超净工作台上接种于约60ml LBA培养液中，与摇床上37℃，180rpm，生长16h，OD600值约为3.0。 2.2.3二级种子液制备 将60ml一级种子液接种于3L LBA 培养液中，于摇床上37℃，180rpm，生长12h，OD600值约为3.0。 3.发酵
抗生素发酵生产自动化控制（DCS）工程可行性研究报告
一、概述 1．项目概况 1．1 项目名称：抗生素发酵生产自动化控制（DCS）工程 1．2 项目承担单位：岳阳中湘XX药业集团有限公司 1．3 项目负责人：xx 1．4 项目起止时间：2001年元月—2002年6月 1．5 项目主管部门：湖南省信息产业厅 1．6 项目简要内容及实施目标：利用计算机集散控制技术实现公司主要抗生素生产车间（包括六、九、十车间共计1495T红霉素发酵体积）的发酵自动化控制。 2．企业概况 2．1 企业简介 2．1．1 企业名称：岳阳中湘XX药业集团有限公司 2．1．2 法定代表人：xx 2．1．3 所有制性质：国有独资 2．1．4 隶属关系：中国医药集团总公司下属中国医药工业公司的全 资子公司 2．1．5 企业地址：湖南省岳阳市xx山一号 2．1．6 电话：0730—8XX0411 2．1．7 邮政编码：414000 2．2 人员情况 2．2．1 职工总数：2053人 2．2．2 工程技术人员：605人 其中高级职称：11人 中级职称：175 人 初级职称：419 人 2．2．3 计算机、自控及相关专业人数：28人 2．3 企业资产信用状况 2．3．1 资产总额：42386 万元 2．3．2 固定资产原值：29248 万元 2．3．3 固定资产净值：22368 万元 2．3．4 流动资产：17405 万元 2．3．5 负债总额：31726 万元 2．3．6 流动负债：12584 万元 2．3．7 所有者权益总额：10659 万元
2．3．8 收入总额：25628 万元 2．3．9 主要营业收入：25628 万元 2．3．10 税后利润总额：1605 万元 2．3．11 银行借款总额：19628 万元 2．3．12 银行信用等级：A级 2．3．13 税务局情况记录：纳税先进单位 2．4 企业生产经营情况 岳阳中湘XX药业集团是以生产抗生素原料药为主，同时生产制剂、中成药的大型医药企业，现有六条抗生素原料生产线（其发酵规模名列全国同行业厂家第四位）、三条合成药生产线、一个制剂分厂、一个药物研究所，下辖五个子公司和一个合资公司。1999年完成工业总产值43557 万元，销售收入22794 万元，上交利税1463 万元，实现利润1129 万元；2000年完成工业总产值49821 万元，销售收入24848 万元，上交利税1554 万元，实现利润1325万元。公司有自营进出口权，产品畅销全国各地，远销东南亚、意大利、西班牙、东欧等国家，国家级新药阿瑞被列为国家高新技术产业化规划。 二、项目开发的必要性 1．项目提出的背景 中湘XX的前身为岳阳市制药一厂，多年来一直主要生产红霉素、螺旋霉素等抗生素原料系列产品。由于产品结构单一、融资渠道不畅、设备装备水平较低、营销网络不够健全、信息收集手段落后等多方面因素的影响，中湘XX的整体竞争能力比较差，特别是在90年代末期表现得尤为突出。1996至1998年，企业连续三年亏损，生产经营举步维艰。1999年，公司决策层实施战略结构调整，提出原料药、制剂药和中成药三分天下、齐头并进的发展思路，并通过实施兼并重组、技术创新、设备改造、健全营销网络等诸多强有力措施，一举扭转了生产经营的被动局面，当年实现了扭亏为盈的目标。但日趋激烈的市场竞争态势迫使我们必须更加冷静地面对现实，中国加入世界贸易组织既给我们带来了发展的机遇，又使我们面临着更大的挑战。2000年，国内市场上随着系列红霉素衍生物的不断开发问世，红霉素原料药的市场需求量相应地得到了增长，但红霉素原料药的生产厂家也在不断地增多，红霉素原料市场总的趋势是供大于求，一场没有硝烟的价格大战已经打响；国际市场方面则表现为欧洲发达国家有大量进口中国红霉素原料药的迹象，但进口的门槛较高，对产品的质量提出了更高的要求。作为红霉素老牌生产厂家，
文献综述 发酵培养基的优化 申请学位：学士学位 院（系）：药学院 专业：生物技术 姓名：张永芳 学号：114080107 指导老师：张小华（讲师） 二O 一五年六月五日
文献综述： 发酵培养基的优化 张永芳：114080107 指导老师：刘向勇 【摘要】：发酵，这一门悠久的技艺，在古今中外的生产生活与科学研究中扮 演着不可或缺的角色。在实验室发酵过程中,经常需要通过试验来寻找研究对象的变化规律,这些对象包括培养基的设计、工艺参数等;而这些变化规律的寻找就要通过科学的试验设计与数据分析来实现。通过对规律的研究达到各种实用的目的,比如提高产量、降低消耗、提高产品质量等,特别对于新菌种、新产品的试验。本文对发酵培养基优化的基本方向进行了综述,并比较了常用的试验设计与数据分析方法。 【关键词】：发酵、发酵培养基、优化、最优组合、响应面法优化 【内容】： 在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。培养基优化，是指面对特定的微生物，通过实验手段配比和筛选找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。目前，对培养基优化实验进行数学统计的方法很多，下面介绍几种目前应用较多的优化方法： 响应曲面分析法:Box和Wilson提出了利用因子设计来优化微生物产物生产过程的全面方法，Box-Wilson方法即现在的响应曲面法（(Response Surface Methodolog，简称RSM）。RSM是一种有效的统计技术，它是利用实验数据，通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题。通过对RSM的研究表明，研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合，以及对响应值的预测，而均比一次次的单因素分析方法更有效。现在利用SAS软件可以很轻松地进行响应面分析。 改进单纯形优化法:单纯形优化法(Modified simplex method)是近年来应用较多的一种多因素优化方法。它是一种动态调优的方法，不受因素数的限制。由于单纯形法必须要先确定考察的因素，而且要等一个配方实验完后才能根据计算的结果进行下一次实验，因此主要适用于实验周期较短的细菌或重组工程发酵培养基的优化，以及不能大量实施的发酵罐培养条件的优化。 遗传算法:Genetic algorithm法是一种基于自然群体遗传演化机制的高效探索算法，它是美国学者Holland于1975年首先提出来的。它摒弃了传统的搜索方式，模拟自然界生物进化过程，采用人工进化的方式对目标空间进行随机化搜索。它将问题域中的可能解看作是群体的一个个体或染色体，并将每一个体编码
抗生素的发酵生产工艺 姓名魏镇 专业生物科学专业 年级 2012级
1抗生素定义（别名：抗细菌剂） 抗细菌药（英语：antibacterial）也称为“抗细菌剂”，是一类用于抑制细菌生长或杀死细菌的药物。在不引起歧义的情况下，抗细菌药也可简称为“抗菌药”。抗细菌剂与抗生素并不是相同的概念，抗生素实际上仅为抗细菌剂下的一类。抗细菌药除了包括青霉素类、四环素类等抗生素，还包括抗真菌药以及磺胺类、喹诺酮类等药物。 2基本简介 抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物。20世纪90年代以后，科学家们将抗生素的范围扩大，统称为生物药物素。主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，一般情况下对其宿主不会产生严重的副作用。2011年10月18日，中国卫生部表示，在中国，患者抗生素的使用率达到70%，是欧美国家的两倍，但真正需要使用的不到20%。预防性使用抗生素是典型的滥用抗生素。 3抗生素的分类 糖的衍生物：主要由氨基己糖的衍生物组成。 多肽类抗生素：主要或全部由氨基酸组成，有多肽或蛋白质的某些特性。 多烯类抗生素：分子结构中有多个双键。 大环内酯抗生素：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成一个巨大的芳香内酯化合物。 四环类抗生素：都具有四个缩合苯环。 嘌呤类抗生素：都含有嘌呤环。 4抗生素的作用机理 ①阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡。哺乳动物的细胞没有细胞壁，不受这类药物的影响。喹诺酮类抗生素三大不良反 喹诺酮类抗生素三大不良反 ②与细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，
让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。 ③与细菌核糖体或其反应底物（如tRNA、mRNA）相互所用，抑制蛋白质的合成——这意味着细胞存活所必需的结构蛋白和酶不能被合成。 ④阻碍细菌DNA的复制和转录，阻碍DNA复制将导致细菌细胞分裂繁殖受阻，阻碍DNA转录成mRNA则导致后续的mRNA翻译合成蛋白的过程受阻。 5抗生素的发酵生产工艺 （1）制备过程 菌种——孢子制备——种子制备——发酵——发酵液预处理——提取及精制——成品包装 （2）具体介绍 ①菌种 来源于自然界，获得能产生抗生素的微生物，经分离、选育和纯化后即称为菌种。 菌种的保藏：冷冻干燥、超低温冷冻、砂土管、液体石蜡、斜面低温保藏。 ②孢子制备 将保藏的处于休眠状态的孢子，接种至固体斜面培养基，在一定温度下培养5-7或7日以上。 进一步用扁瓶在固体培养基上扩大培养。 ③种子制备 目的使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中。 摇瓶或直接将孢子接入种子罐逐级放大培养。 种子培养定时取样做无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析。 种子级数 ④培养基的制备 碳源 供给菌种生命活动所需能量，构成菌体细胞及代谢产物 参与抗生素的生物合成
微生物发酵培养基的优化方法 作者：余继叁中国热带农业科学院热带生物技术研究所 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步[2]。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）[7]。设计发酵培养基时还应时刻把工业应用的目的留在脑海里[22]。 1 发酵培养基的成分 现代分离的微生物绝大部分是异养型微生物，它需要碳水化合物、蛋白质和前体等物质提供能量和构成特定产物的需要[2]。其营养物质一般包括碳源、氮源（有机氮源、无机氮源）、无机盐及微量元素、生长因子、前体、产物促进和抑制剂等。另外，在设计培养基时还必须把经济问题和原材料的供应问题等因素一起考虑在内[6]。 此外，还要考虑所筛选的菌种来源的地点环境，比如本实验室长期从事红树林微生物的分离及其研究工作，红树林的环境处于海洋与陆地之间，所以配制培养基所用的水除了 一般的去离子水外还包括陈海水。 如果在知道产物结构或者产物合成途径的情况下，我们可以有意识地加入构成产物和合成途径中所需的特定结构物质。我们也可以结合某一菌株的特定代谢途径，加入阻遏或者促进物质，使目的产物过量合成。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体α-氨基已二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激赖氨酸的合成。这是因为α-氨基已二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少α-氨基已二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。 ２发酵培养基的设计和优化 由于发酵培养基成份众多，且各因素常存在交互作用，很难建立理论模型；另外，由于测量数据常包含较大的误差，也影响了培养基优化过程的准确评估，因此培养基优化工作的量大且复杂[8]。许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如：生物模型（Biologicalmimicry）、单次试验（One at a time）、全因子法（Full factorial）、部分因子法（Partialfactorial）、Plackett andBurman法等。但每一种实验设计都有它的优点和缺点，不可能只用一种试验设计来完成所有的工作[22]。 2.1 单次单因子法
宁夏工商职业技术学院 毕业论文 题目: 抗生素的生产工艺 作者: 学号: 系别: 化工工程系 专业: 应用化工技术专业 指导教师: 专业技术职务: 3月 宁夏银川 目录 一、抗生素 1、抗生素的定义 (3) 2、抗生素的发展 (4)
3、抗生素的应用 (4) 4、抗生素的生产工艺 (5) 二、青霉素 1、青霉素的定义 (5) 2、青霉素菌种 (6) 3、青霉素培养基 (6) 4、青霉素发酵件控制 (7) 5、青霉素的分离和纯化 (7) 6、青霉素工艺控制要点 (8) 讨论 (8) 结论 (9) 致谢 (11) 参考文献 (12) 抗生素的生产工艺 摘要: 发酵工程药物中最主要的就是抗生素, 抗生素是临床上日常应用量最大的抗感染药物、它是生物, 包括微生物、植物和动物在内, 在其生命活动过程中所产生的, 能在低微浓度下有选择地抑制或影响她种生物功能的有机物质。 【关键词】抗生素, 青霉素, 生产工艺 引入 : 抗生素是生物体在生命活动中产生的一种次级代谢产物。当前人们在生物体内发现的6000 多种抗生素中, 约60%来自放线菌, 抗生素主要用微生物发酵法生产, 少数抗生素也可用化学方法合成, 人们还对天然得到的
抗生素进行生化或化学方法改造, 使其具有更优越的性能。抗生素不但广泛用于临床医疗, 而且已经用于农业、畜牧及环保等领域中。青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素, 1928 年为英国人弗莱明发现, 40 年代投入工业生 产, 在 二战期间马上大显身手, 它能有效控制伤口的细菌感染, 挽救了数百万战争中受伤者的性命。 一、抗生素 ( 一) 抗生素的定义 抗生素又称抗菌素, 指某些微生物在代谢过程中所产生的, 对于其它微生物具有抑制生长或杀灭作用的化学物质, 是制药工业中一类重要原料药。某些抗生素对一部分较大的滤过性病毒也有抑制作用; 或有刺激动植物生长的作用; 或具有抗恶性肿瘤、抗辐射等作用。有些天然抗生素, 经用化学方法进行分子结构改造后, 可得到疗效更高的半合成抗生素。少数天然抗生素可用化学方法进行大量生产, 成为合成抗生素。 ( 二) 抗生素的发展 最早具有临床实用价值的抗生素是 1928 年英国细菌学家 A.弗莱明发现的青霉素, 是由点青霉菌或产黄青霉菌产生。1944 年, 俄国出生的S.A.瓦克斯曼发现了由灰色链霉菌产生的链霉素。1946～1956 年先后从土壤中寻找到由放线菌产生的氯霉素、金霉素、土霉素、制霉菌素、红霉素及丝裂霉素 C 等。60～70 年代,半合成抗生素迅速发展,获得了具有显著疗效的新型抗生素,如半合成青霉素和头孢菌素类, 具有耐青霉素酶、耐酸和抗菌谱广等特点, 为抗生素的临床应用开辟了新的领域。