Westernblot实验步骤及注意事项
1. 组织块称重
2. 利用液氮、研钵粉碎组织块
3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟
5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟
6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度
8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9. 沸水浴中3分钟
10. 上样
11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
14. Westernblot 试剂盒显色
15. 分析比较记录
western blot的实验步骤及注意事项的资料
1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。
注意事项：
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)
O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
O SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
O 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
O 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳
O 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
O 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
O 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。O 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
O 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
O 通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
O 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
O 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
O 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
O 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
O 参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
O 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
O 参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
O 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
生物实验室注意事项 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】
生物实验室注意事项 13.使用离心机应注意什么？ 14.首先应该根据自己的实验需求选择合适的离心机和转子以及离心管，使用离心机时的工作转速不应该超过离心机、转子以及离心管的最大允许转速。离心前注意严格平衡样品。安装转子和转子盖要规范、准确。离心时要留人看守，发现离心机异常应立即关闭离心机。离心结束后要安放好转子。 14.分子生物学实验室常用的灭菌方法有哪些？ 高压蒸汽灭菌、干热灭菌、化学药剂消毒、过滤除菌 15.使用移液器有哪些注意事项？ 垂直吸液、慢吸慢放；选择合适的量程范围，不能超过量程使用；选择与移液器匹配的枪头，安装枪头时不要用力太猛；移液器每日用完后，应旋到最大刻度。 分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。1.冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品
的分离制备实验中，都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具。 使用方法： 1.离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。 2.打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。 3.按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。 4.按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。 5.待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。 注意事项：1.机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。 2.开机前应检查转头安装是否牢固，机腔有无异物掉入。 3.样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。 4.挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔或造成事故。 5.擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。 6.每次操作完毕
微生物检查中无菌操作注意事项 一、关于采用酒精棉球消毒的注意事项 1.用酒精棉球擦拭双手，包括手掌、手背，尤其是手指，更换一个酒精棉球擦拭酒精灯附近（约10cm）桌面。 2.点燃酒精灯，在酒精灯附近拆器皿包装，并对器皿做相应标记。 3.用酒精棉球再次擦拭双手，开始实验操作。 4.消毒用酒精棉球湿度以不挤压出酒精为宜。 二、关于酒精灯正确使用的注意事项 1.酒精量以大于1/3，小于2/3为正确量。 2.防风罩应小口朝上放置于酒精灯上，反过来放置会导致氧气没有充分燃烧。 3.使用酒精灯前要检查灯芯帽是否盖得太紧，以防酒精不能上升，影响酒精灯燃烧。点燃酒精灯时严禁两个酒精灯对点。 4.熄灭酒精灯方法：先用灯芯帽扣压并熄灭火焰，再揭帽重新扣压一次。这样可防止蒸汽倒吸灯帽，再次使用酒精灯时难以揭开灯帽。 5.做样品稀释及从试管取样实验时，酒精灯应放在操作人员和试管架之间，便于无菌操作。 三、关于吸量管使用的注意事项 1.左手拿洗耳球，右手持吸量管，用右手食指平按住吸量管的顶部。 2.吸取样品后进行定量时，吸量管吸液口应贴附于试管内壁；放样时，吸量管吸液口也应贴附于试管约1/2内壁，不应贴附在管口处放液。吸量管应尽可能垂直放液。 3.用吸量管往空平皿加入1ml溶液时，吸量管应贴附于平皿底部中央位置放液；用吸量管在平板上加入溶液做涂布接种时，吸量管应垂直、悬空放液于平板中央。 4.因吸量管拆封包装后应马上使用，故无须对吸量管吸液口过火焰消毒。 5.整个取样放样的过程应尽可能保证试管口或锥瓶口靠近酒精灯火焰附近。
四、关于样品梯度稀释的注意事项 1.从试管架上取出所需试管于酒精灯火焰附近拔出试管塞，并在火焰外焰处对试管口过火焰进行消毒。 2.将试管放回试管架后用吸量管进行取样，然后取出该试管于火焰附近调节吸量管内溶液体积。 3.取样完成后对试管口再次消毒并塞上试管塞，将试管放回试管架原处。 4.从试管架上取出所需加样的试管于火焰附近进行加样放液操作。 五、关于培养皿记号的注意事项 1.标记统一写在平皿底部边缘，以“字数少、字体小、清晰、明确”为原则。 2.标记内容包括：班级、学号、日期、培养基名称、稀释级。 六、关于平板制备的注意事项 1.打开培养皿的方法：左手小指、无名指、中指及一部分掌腹托住平皿底部，食指和拇指张开轻握皿盖侧部，以食指为支点，摆动拇指打开皿盖。打开的皿口应向着酒精灯的外焰。切勿把开口朝向操作人员。 2.手持锥形瓶中下部将瓶中培养基倾倒入平皿中央位置，锥瓶口不应接触平皿。培养基应一次注入够量，不应分次加入（除实验特殊规定）。 3.混匀培养基时应将装有混合培养基的平皿于手中顺时针轻微摇匀2-3次，平放于桌面上后再次顺时针摇匀2-3次，整个过程应在培养基尚未开始凝固时完成。学生只要有其中一个摇匀动作也算完成混匀培养基。 4.手中装有培养基的平皿应水平放置于台面上，不应从台面边缘往里推。在位置允许的情况下，应分开平摊放置待凝。 七、关于涂布方式的注意事项 型涂布棒应放平涂布。 2.涂布时应从中间按同一个方向打圈方式往周边涂布，可以重复涂布。 3.从高稀释级往低稀释级涂布时，可以不用更换涂布棒，也不用灼烧涂布棒。涂布同一个稀释级的不同平板时也不用灼烧涂布棒。但是从低稀释级往高稀释级涂
实验操作注意事项 一．使用温度计测量水温（三年级下册） 1.手拿温度计时正确的位置是提环，不要触摸到玻璃泡位置。 2.测量时温度计玻璃泡应放置于液体中间位置，不要碰到容器壁或容器底部。 3.当温度计放置液体中大约一分钟，温度计液柱稳定不再上升时才能读数，读数时温度计 仍放置在液体内，视线应平视，切记不能仰视或俯视。 二、量筒量液体体积。（三年级下） 1.先弄清楚每一小格的单位体积。 2.量筒放置于水平台上，当测量液体较多时应先用烧杯慢慢加液体，当接近要求测量的体积时，再改用滴管慢慢添加，不要一开始就一直用滴管加。 3，读数时视线应与液体的凹处平视。 三、食盐的溶解实验（四年级上） 1、定量的水，加食盐时用药匙慢慢添加，不要一次添加太多，避免食盐过多时无法溶解完。 2、为了加快溶解使用玻璃棒慢慢搅拌，尽量不要碰到容器壁。 四、酒精灯的使用 1.使用时首先揭开灯帽，灯帽应立放在桌面，避免灯帽滚落。点酒精灯只能用火柴点，不能用燃着的酒精灯去点另一盏酒精灯。 2、熄灭酒精灯时不能用嘴吹，只能用灯帽盖灭，当盖灭以后应将灯帽揭开再重新盖一次。3，使用酒精灯加热物体时应使用外焰加热，因为外焰温度最高。 五、天平的使用。（五年级上） 1、准备测量前，用双手托住底座把天平放在水平台上，使用前弄清楚测量的最大值（天平底座标有），标尺上每一小格所表示的质量值。读游码应看游码左侧对的刻度线。 2、准备测量时先取下两边托盘下的橡胶垫，游码放在标尺左端零刻度线处，再调节平衡螺母，使指针指在分度盘的中线处，（如果指针偏向左侧，螺母向右拧：指针偏向右，则螺母向左拧。） 3、测量物体放左盘（如果测量物体是化学药剂类应用纸垫），砝码放右盘。添加砝码遵循先重后轻，不足再用游码补足，直至再次平衡为止。添加砝码时不能用手拿，必须要用镊子夹。 4、物体的质量是砝码加上游码读数。 六、简单电路连接（四年级下） 1.电池盒放电池时，注意分清正负极。 2、连接开关时，开关应是断开状态，当整个电路连接好时才能闭上开关。（使用开关控制电流时，手不能触摸到金属部分） 3、当连接好整个电路时，闭上开关但是小灯泡不亮时，要会找原因。首先检查连接处是否连接好，小灯泡是否是坏的等等。 七、食盐与水的分离实验（四年级上） 1、注意正确使用酒精灯。 2、加热后期为了防止结出食盐晶体飞溅，用玻璃棒不停搅拌。 八、过滤实验（四年级上） 1、三靠：1、漏斗口靠紧烧杯壁。 2、玻璃棒靠紧滤纸最厚处。 3、倒液体时，烧杯口靠紧玻璃棒。 2,、两低：滤纸低于漏斗边缘；液面低于滤纸边缘。 3、一贴：滤纸紧贴漏斗壁。（可以用水打湿）
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
生物实验室注意事项 13.使用离心机应注意什么？ 14.首先应该根据自己的实验需求选择合适的离心机和转子以及离心管，使用离心机时的工作转速不应该超过离心机、转子以及离心管的最大允许转速。离心前注意严格平衡样品。安装转子和转子盖要规范、准确。离心时要留人看守，发现离心机异常应立即关闭离心机。离心结束后要安放好转子。 14.分子生物学实验室常用的灭菌方法有哪些？ 高压蒸汽灭菌、干热灭菌、化学药剂消毒、过滤除菌 15.使用移液器有哪些注意事项？ 垂直吸液、慢吸慢放；选择合适的量程范围，不能超过量程使用；选择与移液器匹配的枪头，安装枪头时不要用力太猛；移液器每日用完后，应旋到最大刻度。 分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。 1.冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实
验中，都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具。 使用方法： 1.离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。 2.打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。 3.按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。 4.按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。 5.待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。 注意事项：1.机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。2.开机前应检查转头安装是否牢固，机腔有无异物掉入。3.样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。4.挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔或造成事故。5.擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。6.每次操作完毕应作好使用情况
兽医微生物学实验复习题 1、兽医微生物实验室注意事项是什么？ 答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序 2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？ 答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。 3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？ 答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂， 4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？ 答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。 5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？ 答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。 6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？ 答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止 注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢 2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜 7、微生物绘图要求有哪些？ 答：①绘出一个视野，圆形。 ②细菌大小比例合理，必须标明名称。 ③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。 ④绘图一律用铅笔。 8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？ 答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。 9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。 注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。固定方法：火焰固定和化学固定。 10、细菌染色的原理是什么？ 答：细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 11、试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。革兰氏染色的原理是什么？ 答：原理：G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈蓝紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
类仪器名称 别 试管 (平口、翻 可口、具支) 直 接 坩埚 加 (坩埚钳、 热泥三角、 三脚架) 蒸发皿 燃烧匙 烧杯 隔 网 可 烧瓶： 可分为圆加 底烧瓶、平 热底烧瓶和 蒸馏烧瓶。 注意圆底 烧 瓶与蒸馏 烧 瓶的区别。 锥形瓶 不集气瓶 能 加 热滴瓶 试剂瓶 化学实验常用仪器 一、常用仪器的名称、用途、使用注意事项 主要用途使用方法和注意事项 用来盛放或溶解少①可直接加热，用试管夹夹在距试管口1/3 量药品、常温或加热处。 情况下进行少量试②放在试管内的液体，不加热时不超过 剂反应的容器，可用试管容积的l/2，加热时不超过l/3。 于制取或收集少量③加热后不能骤冷，防止炸裂。 气体。④加热时试管口不应对着任何人；给固 体加热时，试管要横放，管口略向下倾斜。主要用于固体物质 一般为瓷质。把坩埚放在三脚架上的泥 三 的高温灼烧。角上直接加热。取、放坩埚时应用坩埚 钳。定量实验时应在干燥器中冷却。 蒸发或浓缩溶液或可直接加热，但不能骤冷。 结晶。盛液量不应超过蒸发皿容积的 2/3， 结 晶时，近干时可停止加热。 取、放蒸发皿应使用坩埚钳。加热后的 蒸发皿要放在石棉网上冷却。 少量固体燃烧的反 应器。 用作配制溶液和较 加热时应放置在石棉网上，使受热均 匀。 大量剂量的反应容溶解物质用玻璃棒搅拌时，不能触及杯 器，在常温或加热时 壁或杯底，反应液量不超过容积 的2/3，加使用。（水浴加热）热时不超过1/2。 须注意常用规格的选用（如配100mL 溶液）。 用于试剂量较大而圆底烧瓶和蒸馏烧瓶可用于加热，加热 又有液体物质参加时要垫石棉网，也可用于其他热浴（如 反应的容器，可用于水浴加热等）。 装配气体发生装置。液体加入量不要超过烧瓶容积的2/3, 加 蒸馏烧瓶用于蒸馏热时不少于烧瓶容积的1/3，蒸馏时温度 以分离互溶的沸点计水银球应放在支管口处并加碎瓷片防 不同的物质。暴沸。 中和滴定反应器及液体不超过容积的1/3，中和滴定时应 蒸馏接受器。用右手振荡，（且只振荡不搅拌）。 收集或贮存少量气 瓶口磨砂，用磨砂玻片涂凡士林封盖。 燃 体及气体间的反应，烧时有固体生成时，瓶底应加少量水或 安全瓶、量气装置。铺少量细砂，不能加热，盛不同密度的 气体放置时瓶口方向不同。 须防止倒吸。 盛少量液体药品。见光易变质的试剂装入棕色瓶，带有 玻璃塞的试剂瓶不可装强碱性试剂；滴 管不能互换，倾倒液体时标签向手心， 滴瓶不存放强挥发性腐蚀性试剂（浓 溴水、浓硝酸等）。 广口：盛固体药品 棕色瓶盛见光易变质药品；盛碱液时应 橡
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
微生物实验室安全及操作规定1目的： 为规范微生物实验操作，确保操作安全有效，制定本规定。 2.适用范围：化验室的微生物检测。 3.要求： 3.1无菌室的门要随手关闭，以防外界微生物的进入。 3.2微生物室内应保持清洁，不得存放与实验室无关的物品。 3.3进入无菌室前要更换经过灭菌的专用工作衣.帽.鞋。 3.4无菌室内应备有体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液.体积分数为70~75%的酒精棉球，以便样品表面及意外污染消毒。 3.5无菌室内应备有镊子.剪刀.接种针.接种环，每次使用前后应在酒精灯火焰上灼烧至无菌。3.6检验人员在操作过程中需严格按照要求进行操作，不得随意减少工序。 3.7无菌室禁止交谈，操作过程中不得用手触摸其它未消毒.灭菌的区域，与该工作无关人员不得随便出入无菌室。 3.8微生物（无菌室.缓冲间）每次使用前，用紫外灯照射30min，要每周检测一次室内空气清洁度，确保其符合实验条件。每周对微生物室进行至少一次2h以上紫外灯消毒。微生物室内的的菌种总数>5cfu/平皿时，需要对无菌室.缓冲间用85~95%乳酸熏蒸1h，熏蒸结束后（必要时可以将空间密闭整晚），用体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液或体积分数为70~75%的酒精棉彻底对洁净室.缓冲间及其内所有设备.物品进行清洗；后对无菌室.缓冲间进行半小时以上紫外线消毒，结束后，验证室内空气清洁度是否合格，仍不合格，则可加大乳酸熏蒸时间及紫外线灭菌时间。3.9每次微生物试验紫外灯灭菌前，需将所用的吸头.剪刀.纱布等物品浸泡于消毒剂中。 3.10接种前所用的试管.平皿及培养基必须经消毒灭菌，打开包装未使用完毕的器皿，不能再继续使用，金属用具应高压灭菌或用酒精灯过火三次后方可使用。 3.11切忌用手直接接触标本及已灭菌的器材内部，打开瓶塞或管塞时，应夹持在手中适当位置，避免污染。使用完毕的吸管.三角瓶.样品等应及时撤离，不可随意放在洁净工作台内。 3.12微生物检验每批必须做空白.对照试验（菌落总数做1个盐水对照.1个琼脂对照，大肠菌群做单料.双料各1个琼脂空白培养，整个检验过程超净台内的环境空白），同时记录。当有菌生长时必须保留样品及时汇报，分析原因再做处理，如果空白试验不符合要求，微生物结果不能出具。 3.13每次微生物实验结束后，所有物品及时撤离无菌室，并用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液将超净台内清理干净，酒精灯、剪刀等物品上的样品擦拭干净，用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液浸手或以肥皂洗手，再用清水冲洗干净。 3.14凡要丢弃的培养物，必须进行妥善处理，培养霉菌的培养物和玻璃器皿要先高压灭菌、再洗刷干净，然后再进行灭菌处理。 3.15严格控制培养箱温度以及培养时间，对培养箱的温度每个班至少监控两次。 3.16每周进行消毒剂擦拭一次培养箱内金属孔架及内壁，再有平皿破碎的情况时必须马上进行清理消毒，防止污染。．
编订：__________________ 单位：__________________ 时间：__________________ 实验室安全防护知识注意 事项(正式) Standardize The Management Mechanism To Make The Personnel In The Organization Operate According To The Established Standards And Reach The Expected Level. Word格式 / 完整 / 可编辑
文件编号：KG-AO-4600-41 实验室安全防护知识注意事项(正 式) 使用备注：本文档可用在日常工作场景，通过对管理机制、管理原则、管理方法以及管 理机构进行设置固定的规范，从而使得组织内人员按照既定标准、规范的要求进行操作，使日常工作或活动达到预期的水平。下载后就可自由编辑。 近日，合肥工业大学化学楼发生硫化氢泄漏事件。化学试剂在实验中随时充满了危险，因此需要特别注意！发点实验室安全防护方面的知识，一起学习。 化学实验中会经常使用各种化学药品和仪器设备，以及水、电、煤气，还会经常遇到高温、低温、高压、真空、高电压、高频和带有辐射源的实验条件和仪器。若缺乏必要的安全防护知识，会造成生命和财产的巨大损失。因此，对从事化学实验室工作人员的安全防护教育是非常重要的，必须引起本中心全体人员的重视。 危险化学品 易燃试剂 在处理易燃试剂时，都应严格检查在附近有无明
火。下列常用的有机溶剂都具有很大的易燃性：碳氢化合物如己烷、轻石油（即石油醚）、苯、甲苯；醇类如甲醇、乙醇；酯类如乙酸乙酯；酮类如丙酮；醚类化合物因其暴露在空气或见光会产生易爆炸的过氧化物，因此，使用时要特别注意。常用的乙醚和四氢呋喃就属于醚类，处理时要特别小心。 此外，乙醚还具有相当低的沸点和一定程度的麻醉作用，二硫化碳具有很高的易燃性，甚至用水浴加热都会导致它着火，因此在实验中应尽量避免使用。 氧化剂 硫酸、硝酸既有很强的腐蚀性，也有很强的氧化性。像漂白粉、过氧化氢、过酸、二氧化钴和高锰酸钾等都是很强的氧化剂。 腐蚀性药品 处理或使用腐蚀性试剂时一定要戴上防护手套。一旦溅到皮肤上，应立即用大量的水冲洗干净。无机酸当中的硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸和硝酸，有机酸中的羧酸、磺酸都是具有腐蚀性的。苯酚也是相当危
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
高中生物的实验操作注意事项 1、应注意实验选材的合理性 如：⑴所选材料应有利于实验现象的观察：如可溶性还原糖的鉴定中应选择“白色或近白色”的材料; ⑵所选材料应容易获得：尽可能选择无明显季节性、地域性的材料; ⑶所选材料应价格便宜 2、应注意操作细节的合理性 如：⑴溶液或培养基灭菌后是否要冷却后使用?冷却后 ⑵向淀粉糊中加了唾液后是否要振荡试管呢?要 ⑶酶促反应的试管如何加热?是直接加热，还是水浴加温?水浴加热 ⑷用酒精溶解叶中叶绿素时，酒精直接或隔水加热?隔水加热 ⑸使甲状腺激素、胰岛素、生长激素进入动物体内的方法应如何操作?是饲喂，还是注射?甲状腺激素饲喂，胰岛素、生长激素注射 ⑹不同的情况下要合理地选用不同的水。如：清水、池水、凉开水、蒸馏水、生理盐水。 3、应注意操作顺序的合理性 例：为“验证pH对唾液淀粉酶活性的影响”。在如下实验步骤中，顺序应该是
①在1-5号试管中分别加入0.5%的淀粉液2mL; ②加完淀粉液后，向各试管中加入相应的缓冲液3mL，使各试管中反应液的pH依次稳定在5.00、6.20、6.80、7.40、8.00; ③分别向1-5号试管中加入0.5%唾液1mL，然后进行37℃恒温水浴; ④反应过程中，每隔1min从第3号试管中取出一滴反应液，滴在比色板上，加一滴碘液显色，待呈橙黄色时，立即取出5支试管，加碘液显色并比色，记录结果; A.①②③④ B.③①②④ C.③②①④ D.①③②④ 答案：C 4、应注意实验方案的可操作性 例：为“验证镁是植物生活的必需元素”。请写出你的设计思路。 方案1：将幼苗中运载Mg2+的载体去掉 方案2：用去掉镁的砂性土壤培养幼苗 方案3：将植物体内的Mg2+分离出来 方案4：取生长状况一致的大豆幼苗，用符合实验要求的容器，对照组盛有含植物必需的各种矿质元素的完全培养液，实验组盛有不含镁离子的完全培养液，两组置于相同的适宜条件下培养;观察比较两组植物的生长发育情况。 方案1、2、3均缺乏可操作性，正确思路应该是方案4。
微生物实验室的安全操作规程 1 实验室安全 1.1 微生物实验室的生物安全性 1.2 科室安全文档 （a）生物危害防护：实际操作规程见（《实验室生物安全通用要求》，中华人民共和国国家标准GB19489-2004。2004-01-05发布，2004-10-01实施。） （b）实验室安全：原则和措施见（《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，中华人民共和国卫生行业标准WS 233-2002。2002-12-03发布，2003-08-01实施。）1.3 应用： 以上的操作规程应用于微生物科室的所有部门。工作人员或访问人员必须遵守各项规定。 1.4 关于新规定或现行规定的修改案： 任何新规定或现行规定的修改案必须通知负责科室安全的人员及相关人员，他们将建议科室主任考虑实施。 1.5 生物性危害 1.5.1 与各种操作有关的生物危害水平取决于： a.处理的传染性物质的本身： 按照传染性物质对个人和社区的潜在危险性以及经空气传播的可能性，其划分成不同等级。所采用的等级划分详见＂《实验室生物安全通用要求》＂；原则和措施（见《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》）。 b.使用的设备和设施： 处理不同等级的传染性物质的要求在＂实验室安全＂中已规定。这些符合要求的设备都要承担重要临床工作，科室负责人必须保证中应污染物水平。 c.培训，特别是员工的安全性培训和安全性经验积累。所有员工应该接受一定训练，能安全处理任何实验室可能碰到的物质，避免将实验不能处理或规定之外的传染性物质暴露在实验室，即使暴露事故在实验室，即使暴露事故发生也要会正确处理。 1.5.2 传染性物质的分类 1.5. 2.1分类系统
实验室注意事项 实验过程中的坏习惯有哪些？ 样品称量或者测定的时候，把数据先记录在草稿纸上，样品做完在抄到记录本上去； 有时候实验完毕才统一填写记录； 仪器还没降到限度以下，就开始关仪器； 气相色谱分析的时候，注射器针头直接用手指蹭下，不用滤纸擦拭。 实验前处理过程的坏习惯 称量样品时，多次重复使用称量纸； 配置酸碱时不在通风橱内进行； 有时候不戴手套进行称量或其他操作； 定容最后环节不采用滴管，而是直接用洗瓶，定容得不太准确，常常是静置后会超出刻度线； 称量前，不校正，不看水平气泡是否在中心地带。 用药匙取料，多余的药品仍返回瓶内。 实验完成后的坏习惯 实验室废液直接倒入下水池，而不是处理回收； 实验完成之后不顾台面的整洁； 使用天平完毕后，不关闭天平门。 影响他人的坏习惯 最主要的是一些实验操作规范的问题，像试剂的节约、仪器的爱护等等，轻者是自己的实验出问题，重者是影响到实验室的风气问题。比如：实验完成后不及时清理现场,总留给别人一个烂摊子；2.长时间占用实验室公用电脑,上网聊天游戏,妨碍他人查资料；3.公用仪器不爱惜,损坏后隐瞒不报,推卸责任。 1.瓶子不做标记，不知道里面装的是什么。 2.标准溶液瓶上的配置信息偷懒不更新。 3.频繁无计划的开冰箱，并且冰箱门大开进行某些操作。导致冰箱温度的不稳定，影响了其他的放置物品的冻存效果。乱翻其中放置的物品，使后来人要费很大的劲才能找到自己的物品。 4.打开细胞培养箱门的幅度过大，过频，不及时关闭，导致培养箱温度及二氧化碳浓度降低。未经他人同意，而私自观察他人培养的细胞。有时候，细胞正需要绝对的静止，而他人的私自查看，可能就影响了细胞的贴壁。 5.他人消毒后的物品，没有在超净台中而私自打开。后不告知而又重新包装上。 6.穿在手上，并且粘有有毒物质（如EB、PMSF等物质）的手套乱摸，包括门把手、键盘等。导致他人裸手而间接粘上此类有毒物质。 7.粘有有毒物质的瓶子不给予特殊处理，而同其他的瓶子放到一起。 8.在公用试剂的标签上乱写，标明自己的剂量，而影响后人的使用。 9.使用完毕离心机、显微镜等，不关机就离开。
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
一级生物安全实验室注 意事项 https://www.doczj.com/doc/bc102067.html,work Information Technology Company.2020YEAR
一、一级生物安全注意事项 1.在实验期间实验室门保持关闭状态。 2.按照操作规程使气溶胶的产生降到最小。 3.在一级生物安全区域内不许吸烟、进食、喝饮料及贮存食物。 4.穿实验服。 5.不许用嘴吸吸液管，应使用机械的吸液设备。 6.避免使用皮下注射针。 7.完成实验操作离开实验室前要洗手。 8.定期消毒工作台面，有液体飞溅应立即消毒。 9.生物废弃物丢弃前需消毒。其它污染的原料在清洗、再利用或丢弃前也 需消毒。 10.污染物封口、耐用的、防漏的容器袋包裹，高压消毒后送到指定销毁 点。 11.控制昆虫和啮齿动物的出没。 12.保持工作区清洁。 二、清除污染 建议使用次氯酸盐和高级别的消毒剂来清除污染。一般情况可使用新鲜配制的含有效氯1 g/L 的次氯酸盐溶液，处理溢出的血液时，有效氯浓度应达到5 g/L。 (一)血液溢出物 1.穿戴手套、实验服和口罩， 2.用纸巾覆盖溢出物，向纸巾上倒有效氯含量5000mg/L含氯消毒剂，直到全 部浸透且不能流出。并维持适当的接触时间约30分钟。 3.用镊子夹取纸巾丢入医疗垃圾袋中。 4.用有效氯含量1000mg/L含氯消毒剂喷雾溢出区域并空气干燥15分钟。 5.15分钟接触反应后，用清水冲洗，用纸巾擦净这一区域。 6.将纸巾、手套丢入丢入医疗垃圾袋中。 7.用皂液和消毒洗手液洗手。 8.就此事件和处理过程做一个记录，报告给主管部门。 (二)皮肤感染
用抗菌皂液和温水冲洗感染部位15分钟。 (三)眼、面部飞溅 用冲眼器冲洗冲洗感染部位15分钟。 (四)医疗锐器伤或粘膜受血液或体液沾染 1.用肥皂液和流动水清洗污染的皮肤，用生理盐水冲洗粘膜。 2.如有伤口，应当在伤口稍上方轻轻挤压，从伤口近心处向远心方向挤压， 尽可能挤出损伤处的血液。禁止在伤口的局部，以免损伤局部组织。再用肥皂液和流动水进行冲洗5分钟，还应注意是哪个病人污染的，如果不知是哪一个病人，也应留意刺伤自已的针头。然后，填写《医疗锐器伤登记表》，报有关部门，做好登记，定期监测。 3.受伤部位的伤口冲洗后，应当用消毒液，如：75%酒精或者0.5%碘伏进行消 毒，并包扎伤口；被暴露的粘膜，应当反复用生理盐水冲洗干净。 4.如遇被乙肝病人或艾滋病病人用过的针头刺伤，除了上述处理方法外，还 要立即注射免疫球蛋白，同时注射相应的疫苗，如乙肝疫苗等。同时还要在当时，三个月及六个月时抽血化验有没有相应的表面抗原，然后，报有关部门，做好登记，定期监测。 (五)检验冰箱冰柜离心机消毒 1.冰箱、冰柜的消毒 1)冰柜、冰箱的冷藏冷冻室的消毒用75%的酒精。 2)冰箱、冰柜的门把宜每日清洁，用75%的酒精浸湿毛巾擦拭，然后用干布擦 拭水分。 3)冰柜、冰箱的冷藏冷冻室最好每月清洁一次，清洁前取出全部物品，用75% 的酒精浸湿毛巾擦拭，然后用干布擦拭水分。作好记录。 2.离心机的消毒 1)离心机表面的消毒每天一次，按仪器表面消毒操作程序进行。 2)离心机内部的消毒宜每周一次，打开离心机盖，用75%酒精浸湿的毛巾擦拭 离心机内壁，转动机杆、转盘。 3)取出离心机离心筒用75%酒精醮湿棉签擦拭，当发生意外时，如试管离心 破裂时，要立即取出机筒，将玻璃碎片放入锐器盒，将污染的机筒放入容