双光子显微镜技术
作者：细胞生物组刘洋完整ppt请见附件
双光子显微镜问世于上世纪90年代，是结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的产物。目前，双光子显微术以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。本报告将对双光子显微镜发明的背景、实现方式、技术特点、应用领域及发展趋势进行简要介绍。
一、双光子显微镜发明的背景
光学显微镜的发展历史是一段不断提高分辨率的历史。在传统宽场（Widefield microscope, WF）光学显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可以投射到同一焦平面上（视网膜或感光元件在此），导致被接收的光线90%是来自焦平面外的杂散光，因此宽场显微镜的成像是整个标本的重叠像，没有纵向分辨能力。对标本内部细节的表现很差，严重影响了分辨率。
为了消除杂散光的干扰，Malvin Minsky于1957年提出了一种利用狭小针孔（Pinhole）滤除焦平面外杂散光的设想，并由G. J. Brakenhoff于1978年借助激光最终实现，这就是激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, confocal）。
与宽场显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜在成像侧的焦点位置设置了一个针孔，只允许来自另一个焦点的荧光通过，而来自其他焦平面的杂散光则被屏蔽。通过焦点的荧光被感光元件（光电倍增管、CCD或CMOS）接收，形成一个点的荧光强度信号。为了解决二维成像问题，激发光通过一组高速摆动的振镜，在标本上进行X-Y方向扫描，来自扫描区域
内各点的信号最后通过计算机重新合成为一张图片。
由于有效滤除了杂散光，激光共聚焦显微镜的分辨率相比宽场显微镜有了本质上的提高（横向200nm，纵向400nm），拥有了对样本的特定焦平面进行精细成像的能力（称为光学切片或“细胞CT”），解决了标本内部细节的问题。在此基础上，激光共聚焦显微镜能够结合多种其它参数，得到重建后的三维图像（XYZ模式）、动态图（XYt模式）或光谱图（XYλ）等数据，以供后续的形态学、动力学等定量分析。
然而，针孔在滤除杂散光的同时也滤除了大部分焦平面荧光，仅有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度，势必要加大激发光功率，容易增加对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白。因此，激光共聚焦显微镜在活细胞/组织成像上的应用受到了一定局限。此外，激发光在穿透标本的过程中会被标本大量散射，以及因激发沿途荧光而损耗，所以对300um
以上厚标本的深部成像并不理想，限制了激光共聚焦在厚样本成像上的应用。
自从上世纪80年代以来，人们一直寻求降低共聚焦显微镜光害、增加灵敏度和穿深的技术改进。直到1990年，双光子显微镜应运而生。
二、双光子显微镜的原理及技术特点
1931年，原子物理学家Maria Goeppert-Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个/多个光子而成激发态，即所谓的双/多光子激发（吸收）。1961年，Kaiser 等借助激光在CaF2∶Eu2+晶体中首次观察到了双光子激发现象。1990年，Winfried Denk利
用双光子激发改造激光共聚焦显微镜，发明了双光子显微镜。
什么是双光子激发？这要从产生荧光的机理讲起。
在普通状态下，基态荧光分子吸收一个激发光的光子后，其电子被激发到一个能量较高但不稳定的激发态。激发态电子随即回到基态，同时将多余的能量以发射光子的方式放出，这就是单光子激发。由于整个过程中存在非辐射的能量损失，发射出的光子能量总是要小于激发光子，也就是发射光的波长大于激发光。
而在双光子激发的情况下，荧光分子可以连续吸收两个波长为原来两倍的激发光子来产生与单光子激发同样的效果。例如在单光子激发中，NADH酶分子吸收一个350nm光子，发射出一个450nm光子；而在发生双光子激发时，吸收两个700nm光子，也可以发射出一
个450nm光子。同理，也可有三光子激发乃至多光子激发，但更难发生。
双光子激发的条件非常苛刻。荧光分子在吸收了第一个激发光子后，等待吸收第二个光子的中间态只能维持10-17s （0.01fs），这要求激发光束中相邻两个光子的间隔必须小到10-18s （1as）才能确保发生双光子激发，换算成激发光的功率密度高达5×1012 W/cm2。任何生物标本都无法经受如此高功率的激光照射。为了解决这个问题，双光子显微镜普遍使用可调谐的锁模红外激光器输出飞秒级的脉冲激光。每个激光脉冲长约10-13s（100fs），强度足够发生双光子激发，而两个脉冲间有10-8s（10ns）的间隔，使整个光束的平均能量密度下降到
略高于普通共聚焦激光的水平。
双光子激发对激发光能量要求极高，所以只能在光子密度最高的物镜焦点周围发生。相对于整个光路上都产生荧光的单光子激发，双光子激发很少产生焦平面以外的杂散光，因此：1）双光子显微镜可以不需要针孔，提高了荧光信号收集率，灵敏度随之得到提高；2）双光子显微镜的光毒性和光漂白仅发生在焦点周围的极小区域（约1um3），非常适合对活细胞、
活组织的长时间成像观察。
光线在介质中的散射能力与波长四次方成反比，因此双光子激发使用的近红外波段激光在厚样本中不易被散射、损耗，穿透力远强于普通共聚焦激光。在一般情况下，双光子激发光能够轻易达到1mm以上的穿透深度，此时的成像深度仅受发射荧光的信噪比限制。尤其适用于毫米级厚样本、不透明样本及含色素样本的成像。
比起单光子激发，双光子激发的吸收峰和发射峰距离更远，更能避免光谱重叠，有助于提高对比度和减少假阳性信号的出现。此外，同一种染料的双光子吸收谱往往比单光子吸收谱更宽，因此可以用一种双光子激发光同时激发数种不同的短波长荧光。这样，在没有紫外
激光器的情况下也能使用AlexaFluor 350这样的短波长染料，增强荧光搭配的灵活性。
双光子显微镜的大穿深、低光害使其迅速成为活细胞、组织和胚胎观察的有力手段。然而它自身也存在诸多限制，不能取代目前共聚焦显微镜的地位：1）双光子显微镜的分辨率达不到普通共聚焦的水平（约差一半），成像速度无明显提高；2）双光子显微镜焦点处的光漂白和光毒性强于单光子显微镜；3）双光子激发光的热效应强，对部分活标本影响较大；4）不能用于对红外光强吸收的样本；5）双光子显微镜的激光器较复杂，购置和维护成本远
高于一般激光器。
焦显微镜解决的问题，就无需使用双光子显微镜。
三、双光子显微术的应用
双光子显微镜自1990年诞生以来已被广泛地应用于神经生物学、细胞生物学、代谢组学、信号转导等生命医学领域。以下列举一些双光子显微镜解决的科学问题。
细胞形态学分析
双光子成像极强的穿透能力使得人们能够轻松地获得活体深层组织中特定细胞的三维形态信息，并在此基础上进行诸如数量、尺度、体积、形状、突起形态、荧光强度等定量分
析。引用图片展示了小鼠视皮层中间神经元在对小鼠进行暗室饲养后发生的突起形态变化。
离子信号检测
双光子成像与离子探针联用，能够实时观察并量化在体神经元或其它细胞中的离子信号，使得双光子显微镜的应用进入电生理领域。引用图片展示了小鼠听觉皮层椎体神经元的
树突棘对听觉刺激的两种不同响应方式。
细胞运动跟踪
双光子成像结合细胞标记技术，能够对特定组织中标记细胞的分布、活动范围、迁移路线、迁移速度、细胞间相互作用等特征进行测量。引用图片展示了类风湿模型小鼠腘窝淋巴
结中Naive和antigen-experienced 两种T细胞的运动模式。
血流动力学
通过直接对组织微小血管中的红细胞流进行延时成像，人们已经能够测算出血液的流速和血压并建立血流动力学模型。而这在之前是难以想象的。引用图片展示了小鼠脑微小血管
的血压波动及血压分布模型。
胞内活动检测
双光子成像不仅被广泛用于记录组织细胞水平上的各种动态，同样可以应用于囊泡转运、细胞骨架、细胞凋亡、分子代谢等胞内动态过程的监测和分子动力学模型的构建。引用
图片展示了大鼠胰岛beta细胞中胰岛素囊泡外吐的两种不同方式。
新陈代谢监测
通过直接对组织中某些具有自发荧光的生物活性分子（如NADH、FADH2）进行双光子激发，可以对组织的物质和能量代谢情况进行监测。引用图片展示了通过NADH自发荧
光水平反映的小鼠冠状动脉末梢区的供氧情况。
四、双光子显微镜的发展趋势
目前，针对双光子显微镜的各种缺点，科学家们也在对其进行着各种技术革新，以求获得一种集双光子和共聚焦优点于一身的新型成像技术。
提升扫描速度
声光振镜：使用无机械元件的声光振镜取代现有的电光振镜，从根本上提高扫描速度。
多焦点复合扫描：将一束双光子激光通过分光和延时形成数个光束，分别扫描标本上不
同的位置或深度。
提高灵敏度——二次谐波成像技术（SHG）
当强激光穿过非线性光学介质时，能够产生波长减半的二次谐波。整个过程不发生荧光激发，也就不需要荧光染色，更没有光毒性和光漂白。二次谐波同双光子激发一样属非线性光学现象，对物质微观结构高度敏感，有助于提高成像灵敏度。值得注意的是，二次谐波产生的条件与双光子激发相似，因此二次谐波成像与双光子显微镜高度兼容，可在现有落射式
双光子显微镜的基础上增加透射式的二次谐波检测器，升级为二次谐波双光子显微镜。
提高分辨率——双光子TIRF和双光子STED
全内反射荧光成像（TIRF）并不直接使用激发光，而是使用激发光在反射界面上的隐失波场进行激发，有效地地减小了激发范围，提高了分辨率。双光子与TIRF联用，能在双光子的基础上进一步提升分辨率。
受激发射损耗（STED）通过环形光束来减小激发光的激发范围，从而提高分辨率。双
光子与STED连用，能在大穿深、低光害的基础上使分辨率出现飞跃。
附件：two_photon.pdf
我今天讲解的文献题目是对生物组织中过氧化氢进行比率成像的一种双光子荧光探针。 背景知识：过氧化氢是活性氧族中的重要一员，活性氧族包括（超氧阴离子自由基、过氧氢自由基、羟基自由基、过氧自由基、单线态氧、次氯酸等）在生物组织的生理衰老及病理方面有着重要的作用。但是超过细胞正常水平的过氧化氢会引起DNA损伤、突变以及遗传的不稳定性。 1.与其他探针作比较：主要讲了采用硼酸盐机理保护的探针对过氧化氢具有较高的选择性，并在细胞中稳定成像，但是这些探针大多用于单光子显微镜并要求短波长激发，以上这些都限制了它在深入组织中的成像的应用。 与单光子探针比较。双光子显微镜比单光子显微镜具有穿透力强、定位激发以及延长观察时间等大量优点而在检测活细胞组织中的过氧化氢方面具有很好的应用前景。 2.探针设计要求：对过氧化氢高效的双光子探针应具有以下特点：在水溶液缓冲剂中具有足够大的溶解性、对过氧化氢具有较高的选择性、有较高的双光子活性横截面和在生物PH范围内有较稳定的光谱性质。 探针的合成：通过过氧萘引入含有硼酸基的氨基甲酸酯合成了AN1。与过氧化氢相连的硼酸盐与缺电子的氨基甲酸酯分离会得到富电的AN1，引起更多红移荧光散射。并在模拟生理环境下表征它的光学特性以及AN1的光学特性，而且PN1相对AN1发生了50nm的蓝移。AN1相对PN1有较大的位移是因为更稳定的电荷转移激发前荧光团的形态包括给电子基和吸电子基。 荧光性能测定：PN1与过氧化氢的反应主要通过发射荧光和液相色谱-质谱仪检测，产物AN1是主要的荧光物。 其他性能测定：1然后我们估测PN1在双光子模式下对过氧化氢的探测能力。 2PN1要比其他活性氧类对过氧化氢有更高的选择性。 2接下来力图利用PN1做双光子探针来检测细胞环境里过氧化氢含量的变化。 为了进一步建立PN1在生物成像领域的应用，我们也做了这个新探针在检测活的组织中过氧化氢含量变化的能力。 结论：最后我们得出结论，我们研究的这种新型双光子探针PN1具有大的荧光活性面、对过氧化氢有一个很明显的有蓝变绿的一个颜色变化过程、对活性氧类具有较好的选择性、低细胞毒性、对生物活性体内PH的变化不敏感等优点。这个新的探针可以对活细胞以及活组织中的过氧化氢深度范围成像而不受其他生物活性氧类的干扰。当前的努力主要是利用PN1以及对过氧化氢在复杂生物样本内的荧光成像化学过程的研究。
创新助手报告——主题分析报告 创新助手平台提供 北京万方软件股份有限公司 2014-07-10
报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介 (1) 二、主题相关科研产出总体分析 (1) 2.1 文献总体产出统计 (1) 2.2 学术关注趋势分析 (2) 三、主题相关科技论文产出分析 (2) 3.1 中文期刊论文 (2) 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2) 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3) 3.1.3 发文较多期刊 (4) 3.1.4 发文较多的机构 (4) 3.1.5 发文较多的人物 (4) 3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4) 3.1.7最近相关中文期刊论文 (5) 3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6) 3.2 学位论文 (7) 3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7) 3.2.2 学位论文增长趋势 (8) 3.2.3 硕博学位论文数量对比 (8) 3.2.4 发文较多的机构 (9) 3.2.5 发文较多的人物 (9) 3.2.6 最近相关学位论文 (9) 3.3 中文会议论文 (10) 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10) 3.3.2 中文会议论文增长趋势 (10) 3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (11) 3.3.4 发文较多的机构 (11) 3.3.5发文较多的人物 (11) 3.3.6最近相关中文会议论文 (12) 3.4 外文期刊论文 (12) 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (12) 3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (13) 3.4.3 最近相关外文期刊论文 (13) 3.5 外文会议论文 (13) I
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920375721.9 (22)申请日 2019.03.22 (73)专利权人 中国科学院苏州生物医学工程技 术研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城 科灵路88号 (72)发明人 徐欣 高峰 张欣 金幸杰 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 韩飞 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) (ESM)同样的发明创造已同日申请发明专利 (54)实用新型名称 光学相干层析和双光子荧光同步成像系统 (57)摘要 本实用新型公开了一种光学相干层析和双 光子荧光同步成像系统，包括双光子光源、快轴 扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫 描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光 子荧光成像模块以及成像显微物镜。本实用新型 的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，通 过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像 技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方 法有效减少了系统硬件，实现了光学相干层析技 术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用， 达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 209946009 U 2020.01.14 C N 209946009 U
权 利 要 求 书1/2页CN 209946009 U 1.一种光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜； 所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。 2.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。 3.根据权利要求2所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。 4.根据权利要求3所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。 5.根据权利要求4所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。 6.根据权利要求5所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置。 7.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析系统或者扫频源光学相干层析系统。 8.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。 9.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、 2
电子显微技术在纳米科学研究中的作用 摘要：本文概述了电子显徽技术在纳米科学研究中的应用特点和适用范围，介绍了透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、扫描隧道显微镜(STM)和原子力显微镜(AFM)等电子显微技术在纳米材料中的新应用和新方法。 关键字：电子显微技术纳米科学 纳米科学技术是在0.1nm~100nm尺度空间内，研究电子，原子和分子运动规律与特性的高技术学科。纳米科学技术涵盖纳米物理学，纳米电子学，纳米材料学，纳米机械学，纳米制造学，纳米显微学，纳米计量学，纳米化学，纳米生物学，纳米医学。纳米科学技术是现代物理学与先进工程技术相结合的基础上诞生的，是基础研究与应用探索紧密联系的新兴高尖端科学技术。纳米科学和技术是在纳米尺度上研究物质的特性及其相互作用，并且对这些特性加以利用的多学科的高科技。纳米科技是未来高科技的基础，适合纳米科技研究的仪器分析方法是纳米科技中必不可少的实验手段。 电子显微技术是以电子束为光源，用一定形状的静电场或磁场聚焦成像的分析技术，比普通光学显微镜具有更高的分辨率。根据其所检测信号的不同，电子显微技术主要包括透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、扫描透射电镜(STEM)、扫描隧道显微镜(STM)、原子力显微镜(AFM)、电子探针(EPM)、俄歇电子能谱(AES)、场发射显微镜(FEM)和场离子显微镜(FIM)等。 目前，电子显微技术已广泛应用于纳米科学研究的各个领域。使用电子显微技术可以获取高质量的图片，从而帮助我们理解纳米结构，以达到改进合成方法和提高性能的目的。将它与最新发展起来的测控技术相结合，实行原位纳米器件的加工、制造和性能表征，如纳米晶体化学组分的表征[1]。总之纳米技术的飞速发展使得电子显微技术成为了纳米科学研究不可缺少的有力的工具。 1 扫描电镜技术 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope)，简称SEM，是一种大型的分析仪器，是3 0 年代中期发展起来的一种新型电镜，是一种多功能的电子显微分析仪器，主要功能是对固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析，广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域。SEM一般只能提供微米或亚微米的形貌信息，与TEM相比，其分辨率较低，因而表征结果不如透射电镜准确，但目前的SEM都配有x射线能谱仪装置，可以同时进行显微组织形貌的观察和微区成分分析，是当今普遍使用的科学研究仪器。李东等[2]
激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别
相关技术指标与进口必要性 双光子显微镜的独特优势有以下几点： 1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。 2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。更加适合活体 下微弱荧光信号的观察。 3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。 4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。 主要技术指标： 1 显微镜 1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm； 1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式 对样品进行定位和观察； 1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm； 1.4 配备长寿命落射荧光光源； 1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块； 1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直
光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand） 显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base） 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator） 透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch） 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。
中药粉末显微鉴别技术 第一 取样、制片、染色 节 一、取样 取样的代表性直接影响到结果的判断准确，因此必须重视取样的各个环节。 （一） 对照品 对照品粉末是检定供试品的参照物，其制备是显微鉴别的先决条件。有经验者，可自取标本，鉴定后制作，或购买药材经品种基原鉴定。还应注意有些药材的显微特征受生长年限及环境的影响，会产生一定的波动，所以对于供试品的产地、采收期、加工方法等也应当认真记录。 （二） 供试品 中药材 原药材应注意基原、产地、规格的完整性、清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，并详细记录。 （1）从同批药材包件中抽取有代表性的检定用样品。 （2）对破碎的、粉末状的或大小在1cm以下的药材，一般药材100g-500g；粉末状药材25g；贵重药材5g-10g；个体大的药材，根据实际情况抽取代表性的样品。 （3）将所取有代表性样品混合均匀，即为总样品量。 （4）前处理：将供试品捡净后，用量较小时，可以用乳体或小型电磨粉碎过《中国药典》6号筛（1.0μm-250μm）备用。 1、中成药 （1）取样：从各批号的箱、包、瓶中随机取样，记录好厂家、批号，从各包装盒中任意取1丸，每批号不得少于3次。各供试品留样保存，保存期限至少1年。 水丸无包衣时，可直接取2丸-3丸，乳钵中研成细粉后，取少量置裁玻片上，滴加规定的试液，搅拌均匀，使粘结的细胞、组织分离，再按粉末特征加水合氯醛试液或其他适当试液处理后观察。 水蜜丸或大蜜丸；可直接用刀片横向切开取一薄片，或用小钢铲取一小块（约15mg）放置在载玻片上制片观察。 （1） 去包衣：中药片剂常见包衣为糖衣，隔离层常使用胶浆、糖浆和滑石
双光子显微镜 https://www.doczj.com/doc/bb2356714.html,/view/1428311.htm?fr=ala0_1 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新 技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题： 一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。
透射电子显微镜的原理 XXX （大庆师范学院物理与电气信息工程学院 2008级物理学 200801071293 黑龙江大庆163712） 摘要：透射电子显微镜在成像原理上与光学显微镜类似。它们的根本不同点在于光学显微镜以可见光作照明束，透射电子显微镜则以电子为照明束。在光学显微镜中将可见光聚焦成像的玻璃透镜，在电子显微镜中相应的为磁透镜。由于电子波长极短，同时与物质作用遵从布拉格(Bragg)方程，产生衍射现象，使得透射电镜自身在具有高的像分辨本领的同时兼有结构分析的功能。 关键词：第一聚光镜；第二聚光镜；聚光镜阑；物镜光阑；选择区光阑；中间镜 作者简介：XXX（1988-），黑龙江省绥化市绥棱县，物理与电气信息工程学院学生。 0引言： 工业多相催化剂是极其复杂的物理化学体系。长期以来,工业催化剂的制备很大程度上依赖于经验和技艺,而难以从原子分子水平的科学原理方面给出令人信服的形成机制。为开发更高活性、选择性和稳定性的新型工业催化剂,通过各种表征技术对催化剂制备中的过程产物及最终产品进行表征是一个关键性的基础工作。在当前各种现代表征手段中,透射电子显微镜尤其是高分辨透射电子显微镜,可以在材料的纳米、微米区域进行物相的形貌观察、成分测定和结构分析,可以提供与多相催化的本质有关的大量信息,指导新型工业催化剂的开发。 为什么透射电子显微镜有如此高的分辨率那？本文阐述了透射电子显微镜的工作原理。 1透射电子显微镜的定义/组成 1.1定义 在一个高真空系统中，由电子枪发射电子束， 穿过被研究的样品，经电子透镜聚焦放大，在荧光 屏上显示出高度放大的物像，还可作摄片记录的一 类最常见的电子显微镜称为透射电子显微镜。[1] 1.2组成 透射电子显微镜由照明系统、成像系统、记录 系统、真空系统和电器系统组成。（如图1） 2透射电子显微镜的照明系统 照明系统的作用是提供亮度高、相干性好、束 流稳定的照明电子束。它主要由发射并使电子加速 的电子枪和会聚电子束的聚光镜组成。
中山大学竞争性谈判采购公告附件 项目编号:中大招（货）[2010]015号 项目名称：中山大学附属第一医院双光子显微镜采购项目 一．激光器 1．常规单光子激光器配置，激发谱线≧6（不包括多光子激光器）, 激发谱线越多越好。 1.1红激光（HeNe 633或635nm，≧10mW） 1.2 蓝激光（Ar 457或458nm,473nm或476nm，488nm,514或515≤nm，≧65mW激发谱线）。 1.3绿光（HeNe 543nm，≧1mW） 1.4紫外激光器UV（固态激光器405 nm，≧50mW） 1.5自动扩束装置，保证更换各个波长和物镜时，光束直径能自动适应物镜后出瞳面，保证各 个波长和物镜条件下实现最佳的分辨率和激发效率。 2.多光子脉冲激光照射系统：Chameleon Ultr II 或Mai Tai Deepsee，飞秒级或皮秒脉冲激光波 长不低于此范围680-1080nm。 二．扫描头 1．点扫描，扫描频率2800线/秒或以上，每个通道的扫描图像均可同时达到6144 x6144或以上的扫描分辨率。 2．扫描振镜：独立的检流扫描振镜≥3个，保证每个激光扫描斑点一样，视场更均匀。用于放大、旋转、分支。 3．扫描放大范围最小≤1倍放大，最大≥60倍放大，步进0.1倍。 4．扫描范围：扫描视场对角线≥22mm，均匀照明, 保证每个扫描点都是圆形的，并且激发光光程 长度一致。 5．检测器采用制冷技术提供灵敏度，独立的共聚焦扫描成像荧光光谱检测通道≥3个，或32+2阵 列式检测器，还要加光电倍增管的DIC和Dodt Contrast透射光检测通道1个。 6．必须配激光追踪自动Z轴防漂移补偿系统，激光自动跟踪焦平面，激光定时校准，消除焦平面 漂移。 7．必须配置自动对齐的同步刺激双向扫描功能或SIM或DUOSCAN或相同功能FLY model， FRET,FRAP,FLIP及解龙锁，光活化等实验室必须要有的特性。 8．配置NDD直接检测器4个，TLD透射光检测器和RLD反射光检测器各两个。 9. 配置在体活鼠脑固定夹具 三．显微镜 1．配置全自动高级研究型正置固定载物台电生理专业显微镜,显微镜控制方式：软件、触摸屏、手 动，可通过三种方式控制功能切换，透/反射光路切换，物镜转换，载物台升降，荧光滤片组转换， 透射光光阑及聚光器功能转换。 2. 观察方法: 明场,荧光,微分干涉（DIC）, 渐层照明Dodt Contrast。 3．电动控制转换的6孔物镜转盘、微分干涉电动转盘。 4．目镜视场≥25mm，电动XY载物台。 5．荧光系统：120瓦金属卤化物光源，灯泡平均寿命2000小时。
1.设备名称 双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜 2.数量 1套 3.设备用途说明 4.工作条件 电源220V±10%，50HZ 室温：20~25℃ 其他：防尘，除湿，抗震动 工作台：牢固，稳定，防震 5.规格、技术要求及参数 5.1 双光子飞秒激光器部分 5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW 5.1.2HeNe激光：543nm，1mW 5.1.3HeNe激光：633nm，5mW 5.1.4405激光：405nm，30mW 5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能 5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。 5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5 微秒。AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。 5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。 5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。 5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。 5.2扫描器 1
5.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设 计，一体化像差及色差校正。 5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。 5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。 5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。 5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。 5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检 测器。 5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和 1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果） 5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪 器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。 5.2.9一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。 5.2.10*两个独立的电动的10位滤光片转轮，通过滤光片导入激发光、透过荧光并阻 断从样品反射回的激光，可提供多至50种激发光波长组合。其中一个转轮可由用户自由更换滤光片，满足系统升级扩展的需要。 5.2.11可对荧光光谱进行分析，拆分光谱重叠的不同标记的信号，可以解决同时使用 多种荧光标记时，如GFP/YFP双标记，激发光或发射光波长重叠造成的串色问题。 5.2.12具有实时计算机系统（Real time computer ）监控扫描过程、同步及数据采 集，可选择使用16位、12位和8位A/D转换的动态范围。 5.2.13采用X、Y轴独立的双镜扫描，扫描为线性扫描。 5.2.14*扫描分辨率：可以在4 x 1至6144 x 6144之间自由选择。所有通道同时使 1
双光子荧光显微镜的原理特点 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理是： 在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。 双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。 这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。 为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。 1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限: 1)一是光毒性现象： 因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得
足够的信噪比; 而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。 在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器? 双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。 例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。 3.双光子显微镜的激光器有何特别之处? 双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。 因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。
胰腺细胞悬浮液样品适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况 目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化 原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为 1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙 震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。 Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。 方法： 1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃ 避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic F-127备用。 2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10 umol/L 染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光温育30 min。 3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1 ml DMEM液后置于 20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。 4.启动LSCM，选择488 nm 氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp 2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30 sec）、扫 描次数（300次），开始扫描。 5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。 1)如果直接做活细胞观察,可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上,然后培养,等观察时用镊子把盖玻片取出,倒扣在载玻片上就行了. 2)需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察. 如果是用探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出,倒扣在载玻片上就行了. 买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小孔中，罐流都可以的。我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细胞可种在大玻片上，这样透光好。1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏。你最好拿弱酸，如稀盐
5.2 金相显微镜的基本原理、构造及使用 金相显微镜可用来鉴别和分析各种金属和合金的组织结构，广泛应用在工厂或实验室进行铸件质量的鉴定、原材料的检验或对材料处理后金相组织的研究分 析等工作。还可用于半导体检测、电路封装、精密模具、生物材料等检验与测量。【实验目的】 1.了解金相显微镜的基本原理、基本结构和使用方法。 2.掌握仔细阅读显微镜使用说明书并进行正确操作的方法。 【实验原理】 显微镜的基本放大作用由焦距很短的物镜和焦距较大的目镜来完成的，物体位于物镜的前焦点外但很靠近焦点位置，物体经过物镜形成倒立的放大实像，这个像位于目镜的物方焦距内但很靠近焦点位置，作为目镜的物体，目镜将物镜放大的实像再放大成虚像，位于观察者的明视距离（距人眼250mm）处，供眼睛观察。光路图见“2.4光学基本仪器”中的图2-？ 为了减少球面像差、色像差和像域弯曲等像差，金相显微镜的物镜和目镜都是由透镜组构成的复杂光学系统。显微镜的成像质量在很大程度上取决于物镜的 质量，因此物镜的构造尤为复杂，根据对各种像差的校正程度不同，物镜可分为消色差物镜、复消色差物镜和平视场物镜等三大类。近年来，由于采用计算机技术，物镜的设计和制造都有了很大改进。 实际上，一方面，金相显微镜所观察的显微组织，往往几何尺寸很小，小至 可与光波波长相比较，此时不能再近似地把光线看成直线传播，而要考虑衍射的影响。另一方面，显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成像过程是个比较复杂的衍射相干过程。此外，由于衍射等因素的影响，显微镜的分辨能力和放大能力都受到一定限制，目前金相显微镜可观察的最小尺寸一般是0.2μｍ左右，有效放大倍数最大为1500~1600倍。 金相显微镜总的放大倍数为物镜与目镜放大倍数的乘积。放大倍数用符号“Х”表示，例如物镜放大倍数为20Х，目镜放大倍数为10Х，则显微镜的放大倍数为200Х。通常物镜、目镜的放大倍数都刻在镜体上，在使用显微镜观察试 样时，应根据其组织的粗细情况，选择适当的放大倍数，以细节部分能观察得清晰为准。 金相显微镜最常见的有正置、倒置和卧式三大类。本实验使用的是正置金相显微镜为例，光学系统结构图如图5-2-1所示。
扫描电子显微镜的基本原理和结构 下图为扫描电子显微镜的原理结构示意图。由三极电子枪发出的电子束经栅极静电聚焦后成为直径为50mm的电光源。在2-30KV的加速电压下，经过2-3个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成孔径角较小，束斑为5-10m m的电子束，并在试样表面聚焦。末级透镜上边装有扫描线圈，在它的作用下，电子束在试样表面扫描。高能电子束与样品物质相互作用产生二次电子，背反射电子，X射线等信号。这些信号分别被不同的接收器接收，经放大后用来调制荧光屏的亮度。由于经过扫描线圈上的电流与显象管相应偏转线圈上的电流同步，因此，试样表面任意点发射的信号与显象管荧光屏上相应的亮点一一对应。也就是说，电子束打到试样上一点时，在荧光屏上就有一亮点与之对应，其亮度与激发后的电子能量成正比。换言之，扫描电镜是采用逐点成像的图像分解法进行的。光点成像的顺序是从左上方开始到右下方，直到最後一行右下方的像元扫描完毕就算完成一帧图像。这种扫描方式叫做光栅扫描。 扫描电镜由电子光学系统，信号收集及显示系统，真空系统及电源系统组成。 1 电子光学系统 电子光学系统由电子枪，电磁透镜，扫描线圈和样品室等部件组成。其作用是用来获得扫描电子束，作为产生物理信号的激发源。为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。 <1>电子枪： 其作用是利用阴极与阳极灯丝间的高压产生高能量的电子束。目前大多数扫描电镜采用热阴极电子枪。其优点是灯丝价格较便宜，对真空度要求不高，缺点是钨丝热电子发射效率低，发射源直径较大，即使经过二级或三级聚光镜，在样品表面上的电子束斑直径也在5-7nm，因此仪器分辨率受到限制。现在，高等级扫描电镜采用六硼化镧（LaB6）或场发射电子枪，使二次电子像的分辨率达到2nm。但这种电子枪要求很高的真空度。 扫描电子显微镜的原理和结构示意图
各厂家超分辨技术 1、莱卡公司采用的超分辨技术STED 2000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率．当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态．利用这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率,原理见下图。 STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛.
2、蔡司公司采用的超分辨技术PLAM 2002年，Patterson和Lippincott‐Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA‐GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott‐Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是用PA‐GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂
德国Lavision Bio tec 光片照明显微镜（light-sheet microscopy）
特点： ☆采用光片照明技术，无需对样品切片 -左右双光片多角度扫描，可在5°内自由偏转 ☆适合生物大样品的最大成像深度 -成像深度可达1 cm，可观察超厚样品 ☆超大工作距离，超大样品尺寸 -成像尺寸1.2 cm X 1.2 cm X 1 cm ☆在亚细胞水平观察动植物活体动态 -具有极低的光漂白与光毒性 工作原理： LaVision BioTec的选择性光片照明（light-sheet microscopy, Selcetive plane illumination microscope, SPIM）显微镜--Ultramicroscope显微镜使用一层光束从样品侧面激发荧光样品即sheet illumination，通过CCD来检测成像，而入射照明光路和CCD来检测成像，而入射照明光路和CCD接收荧光光路互相垂直。通过移动样品使入射光面激发不同的平面，且激发光束从左右两个方向入射到样品上，光束的角度可以改变，这样我们就可以很容易的得到整个组织的3D图像，同时保证细胞水平的分辨率。由于样品受激发的平面就是成像平面，所以可以将光漂白和光学损伤降低到最低。整个系统配置可以达到大视野的快速摄像和3D成像。这也是Lavision特有的设计和配置，
是全球唯一一款可以实现超大样品块、快速扫描、深度成像、高分辨率、3D动态图像输出的荧光显微镜。 应用领域： 生物表型学、发育生物学、结构生物学、肿瘤研究、干细胞再生研究等 适用对象： 动植物组织、动植物器官、或者整个动物胚胎等 应用优势： 不管你是想研究动植物结构、发育动态还是生物表型学，Ultramicroscope显微镜都是一个很好的工具, Ultramicroscope显微镜可以很快而且方便地研究表型学、动植物组织、整个动植物器官或者动植物发育阶段（动物方面如淋巴结、小鼠大脑甚至整个小鼠胚胎或者整个果蝇）。为了分析幼年小鼠的大脑，显微镜的左右两个方向光束的多角度移动可以扫描整个大组织样品的全部结构而不会受到颗粒或者高密度成分的阻挡。并且我们有一套特有的清洁样品的程序，最后将样品放置于清洁缓冲液中成像，大大提高了分辨率。 光学改进： 清洁后的样品仍然含有一些较高光学密度的颗粒。如果使用静态光扫描的话，这些颗粒会导致线性阴影为了避免这种干扰，Ultramicroscope显微镜整合了一个可移动的激发光平面。激发光通过不同的角度透射样品，从而提供更加均质的照明。这项新技术