SGD-Ⅳ型
全自动还原糖测定仪使用说明书
山东省科学院生物研究所（生物中心）山东省生物传感器重点实验室
一、基本原理
全自动还原糖测定仪（SGD-Ⅳ型）是根据费林试剂测定原理设计而成的，其原理与目前国家标准一致；费林试剂是一种氧化剂，由甲、乙液组成。测定时一定量的甲乙液混合，首先形成氢氧化铜，然后形成酒石酸钾铜络合物。次甲基蓝作为滴定终点指示剂，在氧化溶液中呈蓝色，被还原后呈无色。用标准还原糖滴定时，还原糖首先使铜还原，至铜被还原完毕，才使次甲基蓝还原成无色，即为滴定终点。
在滴定过程中，溶液颜色逐渐变化：蓝色→深蓝色→浅蓝色→紫红色→淡紫红色→在终点时突然变化至无色透明。
采用光电转换装置，检测滴定过程中透光率的变化（见图一）；根据电压变化曲线由仪器控制系统自动记录、采样、确定滴定终点；根据达到滴定终点时消耗的标准还原糖量，由控制系统自动计算出样品中还原糖含量，并显示和打印结果。滴定过程电信号变化及控制原理（见图二）如下：
图一滴定电压的变化曲线
反应池
图二全自动还原糖测定仪控制原理图
二、主要性能指标
1、基于费林试剂测定还原糖原理
2、电源220V 50Hz
3、主机尺寸：421×342×230mm（L×W×H）
4、重量：12Kg
5、显示：液晶屏显示
6、灵敏度：0.10%（g/ml以葡萄糖计）
7、线性范围：0.01—1.00%（g/ml以葡萄糖计）
8、测定周期：≤3分钟
三、仪器结构
仪器由反应系统、自动控制系统和机壳三部分组成。
1、反应系统
核心部件为反应池，其剖面结构如图三所示。
光源
清洗
试剂乙
试剂甲
滴定液
排
加热电极
搅拌电机
图三全自动还原糖测定仪反应池结构图
反应系统由滴定池主体构成；滴定池左右两侧有入射光源和光电转换器，滴定池前后两侧有液体进出管道，滴定池内侧有温度传感器和液体加热电极，根据需要调整液体温度；滴定池底部有电磁搅拌器，使滴定液体均匀混合；上部是进样口，可用移液器将被测样品注入滴定池。
2、自动控制系统
包括电源电路、控制电路、控制面板、微型打印机；按设定程序控制滴定池液体的进出、液体温度、搅拌、光电反应信息的收集和转换、计算、测定结果显示及打印。注射泵自动加入标准液、滴定液、两个蠕动泵可自动完成清洗和排空。全自动还原糖测定仪泵系统如图四所示。
图四全自动还原糖测定仪泵系统结构图
四、泵管连接
1、泵管与试剂瓶连接图如图五所示
斐林甲液
0.7%滴定糖
图五全自动还原糖测定仪泵管与试剂瓶连接图2、试剂泵、滴定泵系统图如图六所示
滴定泵
试剂泵
斐林乙液
斐林甲液0.7%滴
定糖
图六全自动还原糖测定仪试剂泵、滴定泵图
3、单向阀泵连接图如图七所示 0.7%糖连接
反应池0.7%糖连接滴定泵连接斐林乙
液试剂瓶
斐林甲液
连接反应池
连接斐林甲
液试剂泵
连接斐林甲
液试剂瓶
连接斐林乙
液试剂泵
连接斐林乙
液试剂瓶
连接0.7%糖试剂瓶
图七单向阀泵管连接图
（1）清洗泵右端口连接硅胶管接蒸馏水瓶（需将该连接硅胶管置于蒸馏水中），左端口连接硅胶管接反应池最上面不锈钢管道（出厂时已连接上）。
（2）排空泵左端口连接硅胶管接废液瓶（需将该连接硅胶管置于自备废液瓶水中），右端口连接硅胶管接反应池最下面不锈钢管道（出厂时已连接上）。
（3）试剂泵甲、乙液注射器端口各自接相应电磁阀的2号口连接硅胶管（出厂时已连接上），电磁阀1号口连接硅胶管接相应甲、乙液试剂瓶（需分别将该连接硅胶管置于按说明书配置的甲、乙液中），电磁阀3号口连接硅胶管接反应池的甲、乙液不锈钢管道（出厂时已连接上）。
（4）滴定泵端口接电磁阀2号口连接硅胶管，电磁阀1号口连接硅胶管接滴定糖瓶（需将该连接硅胶管置于按说明书配置的0.7%滴定糖液中），电磁阀3号口连接硅胶管接反应池滴定糖不锈钢管道（出厂时已连接上）。
五、试剂配制
1、试剂名称：
（1）硫酸铜（CuSO4?5H2O）
（2）氢氧化钠（NaOH）
（3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa?4H2O）
（4）亚铁氰化钾（K4F e(CN)6?3H2O）
（5）无水葡萄糖（C6H12O6）
（6）次甲基蓝（C16H18CIN3S?3H2O）
（7）蒸馏水
（8）盐酸
2、试剂准备
无水葡萄糖（C6H12O6）烘干：103℃烘3小时，常温后放干燥器储存备用。
3、试剂配制:
（1）次甲基蓝溶液（1.0%）：
精确称量次甲基蓝10.0g，蒸馏水完全溶解后定容至1000mL，放置于棕色瓶中备用。
（2）1.00%葡萄糖溶液（定标用标准糖液）即10.00克/升葡萄糖溶液：
精确称量烘干无水葡萄糖10.000g，蒸馏水溶解后加入5mL盐酸，定容至1000mL，放冰箱中备用。
（3）滴定糖溶液（0.7%）：
精确称量烘干无水葡萄糖7.0g，蒸馏水溶解后加入5.0mL盐酸，定容至1000mL，放冰箱中备用。
（4）甲液：
精确称量11.74g硫酸铜（CuSO4?5H2O），溶解后加入7.0mL次甲基蓝容液（1.0%），定容至1000mL。
（5）乙液：
精确称量4.70g亚铁氰化钾（K4F e(CN)6?3H2O），63.20g 氢氧化钠（NaOH），58.50g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa?4H2O）依次溶解后定容至1000mL。
（6）特殊样品测定时，根据待测液浓度范围，可选定经我
方技术人员确定的费林甲乙液浓度。
六、面板
控制面板如图八所示：
图八全自动还原糖测定仪控制面板示意图
模式键:
待机状态下，按【定标】键定标T2。
功能键：
开机（接通电源）后，每按一次【功能】键屏幕显示依次显示如下设置参数选项:
“排空”：排空泵（1）（默认值为11秒），设定排空
泵转动时间。
“清洗”：清洗泵（2）（默认值为6秒），设定清洗泵
转动时间。
“试剂”：试剂泵（3）（默认值为11秒），设定试剂
泵转动时间，即控制费林试剂进样量。
“复位1”：试剂泵复位时间（默认值为19秒）。
“复位2”：滴定泵复位时间（默认值为19秒）。
“差值”：采样电压，根据不同的样品选择（默认值
为3）。
“次数”：连续测定次数（默认值为10次）。
以上参数可满足特殊用户的需求设定，如设定某项，在其显示状态下输入数值（**.0）并按下输入键，即完成设定，但每次
开机均需重复同样的设置。一般用户无需设定。
打印键：按键一次取消打印功能，再按一次恢复打印功能。
清洗键：正在进行滴定（反应）时，按下此键，即可终止当前反应，进入排空清洗，完成后自动进入下一次测定。
复位1：按下此键，试剂泵自动排出进样管道中的气泡。如果一次没有完成排空气泡的话，请再按一次该键，直到无气泡为止。（注意：第一次使用时，由于管路中气泡较多，需要连续几次操作。）
复位2：按下此键，滴定泵自动排出滴定糖管道中的气泡。一次没有完成排空气泡的话，请再按一次该键，直到无气泡为止。
（注意：第一次使用时，由于管路中气泡多，需要连续几次操作。）
测定键：滴定反应进行中，液晶显示屏上数字变化时，按下此键，这次测定完成后自动进入待机状态，再次按下此键，又开始下一次测定。待机状态时，按下该键自动进行设定次数的测定，默认10次（“次数”设定项）。
开始键：仪器接通电源后，按下【开始】键，进入完整测定程序（空白、标定，测定）。
数字符号键：用于进行参数设置时的数字输入。
小数点键：用于进行参数设置时的小数点输入。
七、操作步骤
1、接通电源，打开仪器后部右下侧的电源开关，进入待机状态。
2、按【开始】键，仪器运行。自动进入稳定程序及定标值T1（空白）、T2（标准）的确定，并按照内存设定次数（默认值为10次）完成一组测定。
3、若特殊设置需要调整参数设定，需在打开电源开关后按【开始】键前，重复按压【功能】键进行各参数值设定（如不输入参数值，各参数值则为仪器的初始默认值），按【输入】键完成参数设置。一般不需要重新设定参数，此步骤跳过。
4、仪器打印机打印出T1值之后，需手工进行T2值的标定。待液晶屏显示“定标进样”时，用移液器吸取500微升定标用标准葡萄糖（1.00％即10.000克/升）溶液注入反应池进行定标，反应完成后仪器自动打印出定标值T2。
5、T1、T2值定标完成后，仪器自动进入测定程序。待液晶屏显示“样品进样”时，用移液器吸取500微升待测样品注入反应池，仪器自动完成样品的测定，计算并打印出测定结果。
特别提示：样品还原糖浓度超过1.00%即10.000克/升时，样品需要稀释至1.00%以下后方可测定。
6、一组样品（按“次数”显示设定的测定次数，不进行设定仪器按默认值为10次）测定完成后，仪器进入待机状态。如需继续测定，直接按【测定】键，进入下一个设定次数的测定循环（如不设定，仪器按默认值为10次）。
特别提示：
测定过程中如果需要暂停，可在滴定过程中（液晶显示屏时间数字跳动时）按下【测定】键，该次测定完成后，自动停机；再次测定只需按下【测定】键，可继续本轮次测定，无需重新定标。
7、待机状态下关闭电源开关，即可关机。
8、特殊操作说明：
（1）滴定过程中（显示屏时间数字跳动时），按下【清洗】键，即可结束该次测定，仪器不打印测定结果，自动重复本次操作。
（2）重新定标T2值。在仪器一组测定循环完成后的待机状态下，按下【定标】键，根据液晶屏显示“定标进样”提示时，注入500微升定标用标准葡萄糖（1.00％即10.00
克/升）溶液，仪器自动完成定标并重新打印T2值。再次按下【测定】键，则按照重新定标的T2值完成下一组测定。
（3）重新定标T1值。T1值不能单独定标，如需要重新定标T1值，须在待机状态下，按【开始】键完成T1、T2值定标并进入常规测定程序。
八、注意事项
1、仪器使用稳压电源。
2、仪器使用两周后反应池要清洗,用试管刷刷洗反应池，后用蒸馏水冲洗,直至反应池内的渣滓完全清除。
3、谨防反应液溅出。
4、反应池装好后请勿随便转动左右耳,谨防漏液。
5、正确使用移液器。
6、仪器长时间不用时，排除管道中的试剂，注入蒸馏水。
7、定期检查试剂进样器、注射器固定螺丝，拧至适当位置。
九、常见问题及处理措施
全自动还原糖测定仪基本配置
1、还原糖测定仪一台
2、1毫升移液器一支
3、仪器说明书一本
4、仪器配件一套
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实验一还原糖和总糖含量的测定 （3,5-二硝基水杨酸比色法） 一．目的 1.掌握还原糖定量测定的基本原理； 2.学习比色定糖法的基本操作； 3.熟悉分光光度计的使用方法。 二．原理 在碱性的条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质）,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别样品中还原糖和总糖的含量。 三．仪器.试剂和材料 1.仪器： （1）25ml刻度试管（2）玻璃漏斗（3）三角瓶（4）100ml容量瓶3个（5）刻度吸管（1ml,2ml,3ml）（6）恒温水浴（7）沸水浴（8）电子天平（9）分光光度计2.试剂； （1）1mg/ml葡萄糖标准液（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（3）碘碘化钾溶液（4）酚酞指示剂（5）6ml/L HCI （6）6ml/L NaOH 3.材料：食用面粉 四．操作步骤 将各管摇匀，在沸水中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25min，用试管塞塞住试管口，颠倒混匀。在540nm波长下，用0号试管调零，分别读取1~6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄样毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
2.样品中还原糖和总糖含量的测定 （1）样品中还原糖的提取：准确称取3g使用面粉，放在100ml三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水中保温20min，使还原糖浸出。过滤，用20ml蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 （2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1g使用面粉。放在100ml的三角瓶中，加入10ml 6mol/L HCI及15ml蒸馏水，置于水浴中加热水解30min。待三角瓶中水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂。以6mol/LNaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤纸全部收集砸100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml 定容过的水解液，移入另一100ml的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测液。 六、结果处理 （1）由管○1、○2吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为：0.167mg
总糖和还原糖测定方法较多，如3，5—二硝基水杨酸法、碱性铜试剂法、蒽酮比色法、斐林氏法等。这里只介绍斐林氏法。 一、目的 学习掌握生产实践中常用的快速定糖方法。 二、原理 还原糖在碱性溶液中能将Ag+，Hg+，Cu2+，Fe（CN）3-等金属离子还原，而糖本身则氧化成各种羟酸，利用这一特性可以对还原糖进行定量测定。本实验采用斐林试剂热滴定法，氧化剂是斐林试剂，它是由甲乙两种溶液组成，甲液中含有硫酸铜、次甲基蓝；乙液中含有氢氧化钠、酒石酸钾钠和亚铁氰化钾（黄血盐）。当甲乙两液混合时，硫酸铜和氢氧化钠作用形成氢氧化铜沉淀，由于溶液中存在酒石酸钾钠，它和氢氧化铜形成了可溶性络合物。 酒石酸络铜（Ⅱ）钾钠盐在与还原糖共热时，二价铜离子即被还原成一价的氧化亚铜红色沉淀。 此氧化亚铜与试剂中亚铁氰化钾反应生成可溶性的亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + 3 H2O →K2Cu2Fe(CN)6 + 2 KOH + 2 H2O 亚铁氰化钾亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐 斐林试剂中二价铜的还原力比次甲基蓝强，因此所滴入的标准葡萄糖溶液首先使二价铜还原，只有当二价铜被还原完毕后，才能使次甲基蓝（甲烯蓝）还原为无色，测定中以此作为滴定终点。 在测定时先做一对照管（不加样品），用标准葡萄糖滴定求知一定体积斐林试剂中二价铜和次甲基蓝的量，即测定对照管消耗的标准葡萄糖量（A）。再做样品管，样品中还原糖消耗斐林试剂中一部分二价铜，剩余的量再用标准葡萄糖来滴定，即样品消耗的标准葡萄糖量（B）。将（A）减去（B）就可求得样品中还原糖量。 三、器材及试剂： 1．器材： ①山芋粉②广范试纸pH1～12。 ③吸管5毫升（×4），10毫升（×2）④容量瓶100毫升（×3）
实验2 还原糖的测定方法 食物中还原糖的测定方法：高锰酸钾滴定法和直接滴定法。 一、高锰酸钾滴定法 1.原理 样品经除去蛋白质后，其中还原糖在碱性环境下将铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量计算氧化亚铜含量，再查表得还原糖量。 2.适用范围 GB5009.7-85，本法适用于所有食品中还原糖的测定以及通过酸水解或酶水解转化成还原糖的非还原性糖类物质的测定。 3.仪器 （1） 滴定管 （2） 25ml古氏坩埚或G4垂融坩埚 （3） 真空泵 （4） 水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 4.1 6 mol/L盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100 ml。 4.2 甲基红指示剂：称取10mg甲基红，用100ml乙醇溶解。 4.3 5 mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。 4.4 碱性酒石酸铜甲液：称取34.639g硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀释至500ml，用精制石棉过滤。 4.5碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500ml，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。 4.6精制石棉：取石棉先用3mol/L盐酸浸泡2～3天，用水洗净，再加2.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡2～3天，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以3mol/L 盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩埚用。 4.7 0.1000mol/L高锰酸钾标准溶液。 4.8 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 4.9 硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷却后加水稀释至1L。 4.10 3mol/L盐酸：量取30ml盐酸，加水稀释至120ml。 5. 操作方法 5.1 样品处理： 5.1.1 乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约0.5～2 g固体样品（吸取2～10 ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50ml水，摇匀。加入10 ml碱性酒石酸铜甲液及 4ml1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液滤液备用。（注：此步骤目的是沉淀蛋白） 5.1.2 酒精性饮料：吸取100 ml样品，置于蒸发皿中，用1mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积1/4后（注：如果蒸发时间过长，应注意保持溶液pH为中性），移入250ml容量瓶中。加50 ml水，混匀。以下按5.1.1自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操
3，5-二硝基水杨酸比色法测量还原糖含量 一．实验目的 1、掌握用制作标准曲线的方法来测量还原糖的含量. 2、学会使用721精密型分光光度计。 3、熟练容量瓶、移液管等简单仪器的使用方法。 二．原理 1、还原糖是指含有醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，多糖中有乳糖和麦芽糖等是还原糖，而淀粉和蔗糖是非还原糖。DNS即3，5-二硝基水杨酸中含有的硝基使其有较强的氧化性，与醛基在加热的条件下发生氧化还原反应，生成红色物质3-氨基-5硝基水杨酸。反应方程式如下： 2、不同浓度的还原糖液与DNS反应时，生成的3-氨基-5硝基水杨酸的浓度不同，导致反应后液体颜色深浅不同。在分光光度计下测量标准梯度浓度的葡萄糖溶液与DNS反应后液体的OD540（波长为540nm条件下样液的光密度值），做出OD540——还原糖含量标准曲线，对于未知样品的测量，只需将OD540带入图像，找到相应的还原糖含量值即可。 3、本实验总糖的测量步骤中，因为样品（面粉）主要由淀粉构成不能与DNS直接反应，所以需要用酸水解法将淀粉降解为单糖进行测量。淀粉由单糖缩合产生，在降解过程中会引 入水分子，所以计算总糖的质量时，应除去水的质量。M葡萄糖=180，M水=18，由于淀粉的 =0.9倍。碳链极长，忽略链末端本身含有的一个水分子，则淀粉的质量为还原糖质量的180?18 180 三．试剂（配制方法） 提前配制试剂 DNS（3,5-二硝基水杨酸试剂）：6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH加到热酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶液溶于500蒸馏水中），再加5g重结晶酚和 5g亚硫酸氢钠于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000ml，储存于棕色瓶中。 碘化钾—碘试剂：称取5g碘10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。 酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml 85%的乙醇中，棕色瓶储存。 6mol/L HCl 溶液 10% NaOH 溶液 面粉样品 0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖0.5g，用水定容到1000ml。 四. 实验仪器 （一）每组配置
淀粉、总糖、还原糖的测定方法 淀粉的测定方法---蒽酮法 一( 原理 用乙醇将烟叶中可溶性糖浸出并分离出去，而后烟叶中淀粉用适量Hcl，因淀粉在稀酸作用下被水解成葡萄糖，再按葡萄糖测定进行。根据葡萄糖的含量从而算出淀粉含量。二( 仪器设备 三角瓶50ml 容量瓶100ml 移液管10ml、1ml 漏斗圆底烧瓶1000ml 离心管和离心机水浴锅温度计烘箱滤纸天平分光光度计 三( 试剂 盐酸乙醇氢氧化钠蒽酮 四、试剂的配制和标准曲线的绘制 1. 葡萄糖标准液的配制称取无水葡萄糖(AR级)0.1g溶于蒸馏水中，定容至100毫升，用前取此液10毫升，再用水稀释至100毫升。 2. 标准曲线的绘制取6支干洁刻度试管，依次移入葡萄糖标准液 (100μg/ml)0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml后，再从1至6试管依次补加1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0ml蒸馏水后，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，以吸光值为纵坐标，糖含量为横坐标，绘出标准曲线 3. 80%乙醇的配制取400毫升乙醇加水定容至 500ml 4. 1当量的盐酸配制 43毫升浓盐酸加水定容至500ml 5. 10%氢氧化钠配制 10g氢氧化钠溶于100ml水中 6. 蒽酮试剂:1克蒽酮溶于72%的HSO1000ml(98%的HSO+240的蒸馏水)，棕色瓶冰箱2424
保存2,3周。 五实验步骤 1. 分离出水溶性糖 0.1g样置于离心管中加入8毫升80%乙醇 80?水浴浸 提30分钟冷却后离心(3600转)5分钟残渣再加入 8ml80%乙醇。重复三次 2. 水解 残渣用1当量的盐酸15ml洗入50ml三角瓶，摇匀后烘箱105度加热3.5小时，冷却后加10%氢氧化钠6ml中和，过滤，蒸馏水定容100ml。 3. 测定 取滤液1ml(空白用1ml蒸馏水代替)，加入蒽酮试剂5ml，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色 六结果的计算与表述 C=AN*0.9/W C—样品淀粉含量(μg/g) W—样品重量(g) A—标准曲线查得的糖量(μg) N—样品提取液占样品反应液的倍数 蒽酮比色法测总糖: 实验步骤: 1、可溶性糖的提取:准确称取烟叶样品0.100克，置于离心管中，加入8毫升80%乙醇，于80?水浴浸提30分钟，冷却后于4000转离心5分钟，收集上清液，残渣再加入8毫升80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。 2、总糖的测定:取提取液1毫升于试管中(空白中用1毫升蒸馏水代替)，加入蒽酮试剂5毫升，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色。
实验1 糖的呈色反应和还原糖的检验 一、实验目的 1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。 2.了解鉴定还原糖的方法及其原理。 二、实验原理 糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。 这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。与一元酚如α一萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下： 通常使用的无机酸为硫酸。如用盐酸，则必须加热。常用的酚类为α一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。 有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式；
（一）糖的呈色反应 1．Molish反应(α～萘酚反应) 本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α一萘酚作用，形成红紫色复合物。在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 2．蒽酮反应 糖经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10一酮一9，10一二氢蒽)反应生成蓝一绿色复合物。 3. Seliwanoff反应(间苯二酚反应) 该反应是鉴定酮糖的特殊反应。在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需20—30s。在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较慢。只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。 4．Bial反应(甲基间苯二酚反应) 戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在下，它与甲基间苯二酚(地衣酚)缩合，形成深蓝色的沉淀物。此沉淀物溶于正丁醇。己糖也能发生反应，但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。 （二）还原糖的鉴定 含有自由醛基(一CHO)或酮基(>C==O)的单糖和二糖为还原糖。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(铜、铋、汞、银等)还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质
食物中还原糖的测定方法：高锰酸钾滴定法和直接滴定法。 一、高锰酸钾滴定法 1.原理 样品经除去蛋白质后，其中还原糖在碱性环境下将铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧 化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量计算氧化亚同含量，再查 表得还原糖量。 2.适用范围 ，本法适用于所有食品中还原糖的测定以及通过酸水解或酶水解转化成还原糖的非还原性糖类物质的 测定。 3.仪器 （1）滴定管 （2） 25ml古氏坩埚或G4垂融坩埚 （3）真空泵 （4）水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 6 mol/L盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100 ml。 甲基红指示剂：称取10mg甲基红，用100ml乙醇溶解。 5 mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。 碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加硫酸，再加水稀释至500ml，用精制石棉过滤。 碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500ml，用精制石 棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。 精制石棉：取石棉先用3mol/L盐酸浸泡2～3天，用水洗净，再加L氢氧化钠溶液浸泡2～3天，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜已液浸泡数小时，用水洗净。再以3 mol/L 盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软县委，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩埚用。 L高锰酸钾标准溶液。 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷却后加水稀释至1L。 3mol/L盐酸：量取30ml盐酸，加水稀释至120ml。 5. 操作方法 样品处理： 乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约～ 2 g固体样品（吸取2～10 ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50 ml水，摇匀。加入10 ml碱性酒石酸铜甲液及 4 ml1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。（注：此步骤目的是沉淀蛋白） 酒精性饮料：吸取100 ml样品，置于蒸发皿中，用 1 mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至 原体积1/4后（注：如果蒸发时间过长，应注意保持溶液pH为中性），移入250 ml容量瓶中。加50 ml 水，混匀。以下按自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操作。 含多量淀粉的食品：称取2～10 g样品，置于250 ml容量瓶中，加200 ml水，在45℃水浴中加热 1 h，并时时振摇。（注意：此步骤是使还原糖溶于水中，切忌温度过高，因为淀粉在高温条件下可糊化、水解， 影响检测结果。）冷却后加水至刻度，混匀，静置。吸取200 ml上清液于另一250 ml容量瓶中，以下按自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操作。 含有脂肪的食品：称取2～10 g样品，先用乙醚或石油醚淋洗3次，去除醚层。加入50ml水混匀，以下按自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操作。 汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100 ml样品置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250 ml容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后，备用。 样品测定： 吸取50ml处理后的样品溶液，于400ml烧杯中，加入25ml碱性酒石酸铜甲液及25ml乙液，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确煮沸2min，乘热用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不成碱性为止。（注：还原糖与碱性酒石酸铜试剂的反应一定要在 沸腾状态下进行，沸腾时间需严格控制。煮沸的溶液应保持蓝色，如果蓝色消失，说明还原糖含量过高， 应将样品溶液稀释后重做。）将古氏坩埚或垂融坩埚放回原400ml烧杯中，加25 ml硫酸铁溶液及25ml水，用玻棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以L高锰酸钾标准液滴定至微红色为终点。 同时吸取50ml水，加与测样品时相同量的碱性酒石酸铜甲、乙液，硫酸铁溶液及水，按同一方法做试剂空 白实验。 6. 计算： X1=（V-V0）×N×（1） 式中： X1--样品中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，mg；
直接滴定法测定还原糖的原理与主要影响因素 日常食品检测中，还原糖是一个常规理化检验项目，涉及的样品种类很广，如乳制品、肉制品、发酵酒及果蔬制品叶等。目前还原糖的检测分二大类，一类是具体检测某一还原糖含量，如葡萄糖、果糖等；一类是测定还原糖总量，还原糖总量目前应用较多的是化学滴定法，食品检测中最常用的是国标GB/T 中的第一法：直接滴定法。本文讨论的是后者。 检测原理 （1）碱性酒石酸铜甲液与乙液混合后，生成蓝色氢氧化铜沉淀，此沉淀立即与酒石酸钾钠反应生成深蓝色的酒石酸钾钠铜络合物。 （2）当碱性酒石酸铜甲、乙液与还原糖共热时，酒石酸钾钠铜被还原生成红色的氧化亚铜沉淀物，而还原糖的醛基或酮基则被氧化为羧基，生成还原糖酸。 （3）当还原糖将溶液中酒石酸钾钠铜耗尽时，稍微过量的还原糖可将亚甲基蓝还原而呈无色，指示滴定终点的到来。 （4）为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，与红色的氧化亚
铜发生络合反应，生成可溶性无色络合物，利于终点的判定。 检测原理的补充性解释 酒石酸钾钠作用。既然实验须在碱性条件下进行，那么硫酸铜遇碱生成氢氧化铜沉淀后，不利于实验正常进行，必须使其（铜离子）在可溶状态下才行，酒石酸钾钠与铜离子络合物酒石酸钾钠铜是可溶的，从而达到了目的。 亚铁氰化钾作用。当样品中存在大量的如铁、锰、钴等金属离子，或样品处理时，沉淀剂乙酸锌过量了，都会消耗碱性酒石酸铜乙液中的亚铁氰化钾，当亚铁氰化钾被过量消耗时，不能有效络合氧化亚铜，致使滴定终点不显无色而显暗红色。可另配制亚铁氰化钾溶液，滴定时往锥形瓶中适量添加，标准与样液添加量一样。 定量标准物质。碱性酒石酸铜甲液中的硫酸铜的铜离子（Cu2+）为此滴定反应的定量标准物质，碱性酒石酸铜乙液中氢氧化钠提供了强碱性环境，故国标GB/T 中：“吸取碱性酒石酸铜甲液”的体积量取精度应改为“”，否t检测结果的有效位数达不到该标准的要求：“还原糖含量≥10g/100g时计算结果保留三位有效数字”。 还原糖被氧化反应式。还原糖与酒石酸钾钠铜的反应，以葡萄糖为例，常见的有下面3式，（6）式中，电子转移数为2，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸；（7）式中，电子转移数为6，葡萄糖被氧化为葡萄糖二酸；（8）式中，电子转移数为6，
实验八食品(炼乳)中还原糖含量的测定
一、实验目的 1、了解食品中还原糖的含量； 2、学习直接滴定法测定还原糖的原理，并掌握其定糖方法。 3、通过对实验结果的分析，了解影响测定准确性的因素。 二、原理， 食品中的还原糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖、麦芽糖等，还原糖之所以具有还原性，是由于其分子中含有游离醛基(-CHO)或酮基(>C=O)。 测定还原糖的经典化学方法都是以其能被多种试剂氧化为基础的。在这些方法中，以各种根据碱性酒石酸铜溶液氧化作用改进方法的应用最广。本实验就是采用使用碱性酒石酸铜作为氧化剂的直接滴定法。 碱性酒石酸铜溶液A、B二液等体积混合时生成的天蓝色Cu(OH)2沉淀后，立即与酒石酸钾钠起反应生成深蓝色的酒石酸钾钠铜络合物。此络合物与还原糖共热时，二价铜即被还原糖还原为一价的红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜沉淀与亚铁氰化钾反应，生成可溶性化合物，达到终点时，稍微过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原成无色，溶液呈淡黄色而指示滴定终点，根据还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖的质量，以及测定样品液所消耗的体积，计算还原糖含量。反应式如下： CuSO4＋2NaOH→Cu(OH)2↓＋Na2SO4 COOK COOK ││ CHOH CHO │＋Cu(OH)2→│Cu＋2H2O CHOH CHO ││ COONa COONa COOK COOK │CHO COOH │ CHO ││CHOH │Cu＋(CHOH)4 →(CHOH)4 ＋│＋Cu2O↓ CHO ││CHOH │CH2OH CH2OH │ COONa COONa 三、仪器与试剂 1、仪器 (1)容量瓶100 ml、250 ml (2)三角瓶250 ml (3)碱式滴定管50 ml或25 ml (4)烧杯100m1 (5)吸管5 ml、50 ml (6)分析天平 (7)电炉1KW可调 (8)恒温水浴锅 2、试剂 (1) 碱性酒石酸铜溶液A液：称取15.00 g硫酸铜(CuSO4·5H2O)(AR)及0.05g次甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释至1000 ml。
还原糖和总糖含量的测定（3 ，5 一二硝基水杨酸比色法） 作者：佚名文章来源：生物化学实验技术点击数：2132 更新时间：2006-5-13 11:29:24 一、目的 植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成其他物质如有机酸等。此外，水果蔬菜中糖量的多少，也是坚定其品质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉蔗糖等，经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，练习比色定糖法的基本操作，热悉分光光度计的使用方法。 二、原理 各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可以植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。 在碱性条件下，还原糖与 3 ， 5 一二硝基水杨酸共热， 3 ， 5 一二硝基水杨酸被还原为 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系， 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 三、仪器、试剂和材料 1 .仪器 （ 1 ）刻度试管： 25 ml X 11 （ 2 ）离心管或玻璃漏斗 X2 （ 3 ）烧杯： 1OOml X 1 （ 4 ）三角瓶： 100m1 X 1
（ 5 ）容量瓶： 100ml X 3 （ 6 ）刻度吸管： 1 ml X 1 ， 2m1 X 4, 10ml X 1 （ 7 ）恒温水浴 （ 8 ）沸水浴 （ 9 ）离心机（过滤法不用此设备） （ 10 ）电子顶载天平 （ 11 ）分光光度计 2 .试剂 （ 1 ） 1 mg/ ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 8 0 ℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容量瓶中，以馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （ 2 ） 3 ， 5- 二硝基水杨酸试剂：将 6.3g 3, 5- 硝基水杨酸和 262ml 2mol/NaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml ，贮于棕色瓶中备用。 （ 3 ）碘 - 碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100 ml 蒸馏水中。 （ 4 ）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250ml 70 ％乙醇中。 （ 5 ） 6mol ／ L HCl 。 （ 6 ） 6mol/L NaOH 。 3 .材料 食用面粉。
发酵生产中还原糖和葡萄糖检测指标的分析 史建国杨俊慧孟庆军杨艳马耀宏张利群 （山东省科学院生物研究所，济南，250014） 摘要采用还原糖测定法和葡萄糖酶电极测定法，对谷氨酸发酵生产上淀粉糖原料和发酵液中还原糖和葡萄糖进行了测定，对其变化的特点和意义进行了研究。结果表明：淀粉糖液中葡萄糖/还原糖比值变化从80% - 94.2%；发酵过程中，谷氨酸生产菌首先消耗葡萄糖，发酵28h，葡萄糖含量接近零，而还原糖含量为 1.0%；还原糖测定仪用于发酵后期还原糖测定，精密度（RSD％）为2.21，对发酵后期的精确控制具有一定的应用价值。 关键词还原糖，葡萄糖，发酵过程控制 微生物发酵生产中常以淀粉为基本原料，经水解生成还原糖或葡萄糖，供发酵使用。糖的检测是生产过程控制的常规生化指标[1]。近年来，还原糖测定仪和葡萄糖测定仪已在发酵生产中应用，并逐步取代传统的手工滴定法，实现了还原糖和葡萄糖快速、准确的仪器化分析，大大减少了人为测定的误差[2、3]。但由于测定原理和方法的不同，使测定结果出现了差异。本文对多年来在谷氨酸发酵生产中测定的还原糖和葡萄糖结果进行了总结，对还原糖和葡萄糖检测指标进行了比较和分析，对发酵生产中仪器分析方法的应用特点和意义进行了探讨。 1材料和方法 1.1实验材料 淀粉水解液糖化液为莲花集团不同的糖化车间的送检样品；谷氨酸发酵液为菱花集团三分厂送检样品；化学试剂均为分析纯，用蒸馏水配制。 1.2实验方法 1.2.1 还原糖测定 （1）斐林试剂滴定法 采用国家标准测定法（GB/T 5009.7—1985）
（2）还原糖测定仪 采用山东科学院生物中心提供的SGD-Ⅲ型还原糖测定仪。该仪器测定原理同还原糖斐林试剂滴定法。测定方法如下： 接通电源（220V），按“开/关”键，自动启动准备程序；用微量注射器将标准品注入反应池，完成后自动定标；测定时，用微量注射器将被测样品注入反应池，仪器自动完成测定过程，并显示和打印测定值。1.2.2 葡萄糖测定 采用山东省科学院生物研究所提供的SBA-40型谷氨酸-葡萄糖双功能分析仪。其原理是葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下催化葡萄糖，在过氧化氢型电极上产生电流。该电流值与葡萄糖的浓度有线性比例关系。测定方法如下： 仪器开机后，自动进入清洗过程。当仪器出现进样指令后，用微量进样器取25μL标准溶液注入反应池，仪器自动显示校正结果。测定时，用微量进样器取25μL样品液注入反应池，20s后仪器自动显示或打印测定值。 2结果与讨论 2.1 淀粉糖样品中还原糖和葡萄糖测定 将糖化车间送检的淀粉糖化液分别稀释。还原糖测定时稀释糖浓度至1%以内，采用费林氏剂滴定法测定；葡萄糖测定稀释至0.1% 以内，采用葡萄糖酶电极分析仪测定。测定值乘以稀释倍数为测定结果（表1）。 该试验所提供的糖化样品DE值都在95以上，且颜色浅，透光率好，按常规质量标准衡量基本一致。但样品中葡萄糖/还原糖值变化较大。由表1可以看出：葡萄糖/还原糖比值变化从80% - 94.2%；其中，11、12号样品还原糖含量差别仅有0.2%，而葡萄糖/还原糖比值相差8%以上。因此，采用发酵生产中葡萄糖和还原糖的测定对常规糖质量控制标具有一定的应用价值。
总糖和还原糖的测定──费林试剂热滴定法 目的要求： 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。 实验原理： 还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。 本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2+ Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜： 反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2OCu2O + K4Fe(CN)6 + H2OK2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH 滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。
试剂和器材： 一、试剂 费林试剂： 甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL。 乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾［K4Fe （CN）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。 0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL。 6mol/L HCl：取250mL浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL。 碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。 6mol/L NaOH：称取120gNaOH溶于500mL蒸馏水中。 0.1%酚酞指示剂。 二、材料 藕粉，淀粉。 三、器材 试管3.0×20cm（×1）；移液管5mL（×2）；烧杯100m L(×1); 250mL锥形瓶; 调温电炉; 滴 定管25mL(×1)。 操作方法： 一、样品中还原糖的提取 准确称取1g藕粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
1.目的 掌握直接滴定法测还原糖的原理、操作、条件及注意事项。 2.原理 样品经前处理提取还原糖，在加热条件下，直接滴定一定量的碱性酒石酸铜标准溶液，以次甲基蓝作指示剂，根据样液消耗体积，计算样品中还原糖量。3.试剂 3.1碱性酒石酸铜标准溶液（还原糖因数f/mg·10mL-1） 3.1.1甲液:称取23.10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝，溶于水中 并稀释至100mL 3.1.2乙液: 称取115.33g酒石酸钾钠及33.30氢氧化钠，溶于水中，用水稀 释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶中瓶中 3.2乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至 100mL. 加水溶解并稀释至100mL 3.3亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释 至100mL 3.4盐酸 3.5葡糖糖标准溶液：精密称取7.0000g经过98~100℃干燥至恒量的纯葡 萄糖加水溶解，并以水稀释至1000mL.此溶液每毫升相当于7mg葡糖 糖 4.仪器 碱式滴定管、电炉 5.样品 硬糖（m样=5.8002g） 6.操作 6.1样品处理 称取样品5.8002g置于小烧杯中，加40mL水，40℃微热溶解，冷却后加40mL水，调节PH至中性，加水定容至100mL，过滤后收集滤液即为样品溶液。 6.2标定碱性酒石酸铜溶液 吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL乙液，置150mL三角锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，置于电炉上加热至沸（要求控制在2min内沸腾），然而趁热以每秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖的总体积。同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL（甲液乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质
还原糖的测定方法（1） 食物中还原糖的测定方法：高锰酸钾滴定法和直接滴定法。 一、高锰酸钾滴定法 1.原理 样品经除去蛋白质后，其中还原糖在碱性环境下将铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量计算氧化亚同含量，再查表得还原糖量。 2.适用范围 GB5009.7-85，本法适用于所有食品中还原糖的测定以及通过酸水解或酶水解转化成还原糖的非还原性糖类物质的测定。 3.仪器 （1）滴定管 （2）25ml古氏坩埚或G4垂融坩埚 （3）真空泵 （4）水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 4.1 6 mol/L盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100 ml。 4.2 甲基红指示剂：称取10mg甲基红，用100ml乙醇溶解。 4.3 5 mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。 4.4 碱性酒石酸铜甲液：称取34.639g 硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀释至5 00ml，用精制石棉过滤。 4.5 碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500ml，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。 4.6 精制石棉：取石棉先用3mol/L盐酸浸泡2～3天，用水洗净，再加2.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡2～3天，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜已液浸泡数小时，用水洗净。再以3 mol/L 盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软县委，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩埚用。 4.7 0.1000mol/L高锰酸钾标准溶液。 4.8 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 4.9 硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷却后加水稀释至1L。 4.10 3mol/L盐酸：量取30ml盐酸，加水稀释至120ml。 5. 操作方法 5.1 样品处理： 5.1.1 乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约0.5～2 g固体样品（吸取2～10 ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50 ml水，摇匀。加入10 ml碱性酒石酸铜甲液及4 ml1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀。静置3 0min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。（注：此步骤目的是沉淀蛋白） 5.1.2 酒精性饮料：吸取100 ml样品，置于蒸发皿中，用1 mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积1/4后（注：如果蒸发时间过长，应注意保持溶液pH为中性），移入250 ml容量瓶中。加50 ml水，混匀。以下按5.1.1自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操作。 5.1.3 含多量淀粉的食品：称取2～10 g样品，置于250 ml容量瓶中，加200 ml水，在45℃水浴中加热1 h，并时时振摇。（注意：此步骤是使还原糖溶于水中，切忌温度过高，因为淀粉在高温条件下可糊化、水解，影响检测结果。）冷却后加水至刻度，混匀，静置。吸取200 ml上清液于另一250 ml容量瓶中，以下按5.1.1自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操作。 5.1.4 含有脂肪的食品：称取2～10 g样品，先用乙醚或石油醚淋洗3次，去除醚层。加入50ml水混匀，以下按5.1.1自"加10ml碱性酒石酸铜甲液"起依法操作。 5.1.5 汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100 ml样品置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250 ml容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后，备用。 5.2 样品测定： 吸取50ml处理后的样品溶液，于400ml烧杯中，加入25ml碱性酒石酸铜甲液及25ml乙液，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确煮沸2min，乘热用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不成碱性为止。（注：还原糖与碱性酒石酸铜试剂的反应一定要在沸腾状态下进行，沸腾时间需严格控制。煮沸的溶液应保持蓝色，如果蓝色消失，说明还原糖含量过高，应将样品溶液稀释后重做。）将古氏坩埚或垂融坩埚放回原400ml烧杯中，加25 ml硫酸铁溶液及25ml水，用玻棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以0.1mol/ L高锰酸钾标准液滴定至微红色为终点。 同时吸取50ml水，加与测样品时相同量的碱性酒石酸铜甲、乙液，硫酸铁溶液及水，按同一方法做试剂空白实验。 6. 计算： X1=（V-V0）×N×71.54 （1） 式中：X1--样品中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，mg；
6.2.2 DE值 6.2.2.1 试剂 a) 次甲基蓝指示液10g/L：称取1.0 g次甲基蓝(C16H18ClN3S·2H2O)，溶解于水并稀释至100ml； b) 葡萄糖标准溶液2g/L：称取于100±2℃烘干至恒重的无 水葡萄糖0.5000g，称准至0.0001g,加水溶解，洗入250 ml容量 瓶中并稀释至刻度，摇匀，备用。 C)费林溶液：按GB603配制。 标定：预滴定时，先吸取费林试剂Ⅱ，再吸取费林试剂Ⅰ各5.0ml于150ml三角瓶中，加水20ml，加入玻璃珠3粒，用50ml 滴定管预先加入24ml葡萄糖标准溶液(b)，摇匀，置于铺有石棉网的电炉上加热，控制瓶中液体在120s±15s内沸腾，并保持微沸，加2滴次甲基蓝指示液(a)，继续以葡萄糖标准溶液滴定， 直至蓝色刚好消失为其终点，整个滴定操作应在3min内完成。正式滴定时，预加入比上述滴定消耗的葡萄糖标准溶液少1ml，作平行试验，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。取其算术平均值。 RP=m1×v1/250 式中：RP——斐林溶液Ⅱ、Ⅰ各5ml相当于葡萄糖的质量，g； m1——称取基准无水葡萄糖的量，g v1 ——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL 250——配制葡萄糖标准溶液的总体积，mL。 6.2.2.2 测定 a) 样液的制备 称取一定量的样品，称准至0.0001g（取样量以每100ml样液中含有还原糖量125-200mg为宜），置于50ml小烧杯中，加热水溶解后全部移入250ml容量瓶中，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，备用。 b) 预滴定 按标定费林溶液操作，先吸取费林试剂Ⅱ，再吸取费林试剂Ⅰ各5.0ml于150ml三角瓶中，加水20ml，加入玻璃珠3粒，用50ml滴定管预先加入一定量的样液(a)，将锥形瓶置于铺有石棉网的电炉上加热至沸，控制在120s±15s内沸腾，并保持微沸，以样液继续滴定（滴加样液的速度约为每两秒1滴），至溶液蓝色即将消失时，加入2滴次甲基蓝指示液，再继续滴加样液直至蓝色刚好消失为其终点，记录消耗样液的总体积。
第三章 基础实验 （一）糖化学 实验一 总糖和还原糖的测定（一）──费林试剂比色法 目的要求 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。 实验原理 将一定量的碱性酒石酸铜甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀： 2NaOH + CuSO 4 = Cu(OH) 2 + Na 2SO 4 所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的酒石酸钾钠铜： 在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，还原糖则被氧化和降解，其反应如下： 反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。
Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH （氧化亚铜）（淡黄色） 滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。 试剂和器材 一、试剂 碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。 碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。 0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。 6mol/LHCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。 碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。 6N NaOH：称取120gNaOH溶于500ml蒸馏水中。 0.1%酚酞指示剂。 二、材料 山芋粉 三、器材 电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。 操作方法 一、样品中还原糖的提取 准确称取2g山芋粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入50ml 蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。 二、样品中总糖的水解及提取 准确称取1g山芋粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。