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天麻素抑制高脂饮食大鼠体重的实验研究

兰州大学

硕士学位论文

天麻素抑制高脂饮食大鼠体重的实验研究

姓名:王君

申请学位级别:硕士

专业:中西医结合

指导教师:郑天珍;李伟

20080501

摘要

肥胖被世界卫生组织确认为一种流行病,已严重地影响着人们的身体健康。肥胖症的发生是机体能量代谢失调的结果,近几年来的研究表明,肥胖的发生与遗传基因、

环境因素、膳食结构等多种因素有关,是以体内脂肪积聚过多为主要特征的一种全球

广泛流行的独立性慢性疾病。因此,研究肥胖症及其相关机制和防治措施已成为21

世纪的迫切任务。近年来通过抗氧化降血脂的研究越来越多,因为大量资料表明,肥

胖诱导的代谢紊乱与细胞的氧化还原体系有着重要的联系。临床及实验研究证实中药

有很好的降脂及减肥作用,国内外学者已经对中药天麻进行了大量的研究,而且最近

有研究报道天麻素有抗自由基和保护细胞膜作用,但将其作为干预物质用于抑制高脂

饮食大鼠体重增加的实验,尚未见报道。因此本实验用天麻的有效单体天麻素作为干

预物质观察其对高脂饮食大鼠体重及生化指标的影响,为研制出疗效好、副作用小的

有效减肥中药提供一定的理论依据。

本实验以高脂饮食的SD大鼠,模拟人体的肥胖状态。通过服用不同浓度的天麻素(gastrodin,GAS),观察其对大鼠体重、摄入热量、糖、脂代谢、胰岛素、抗脂

质过氧化以及血清瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)、肿瘤坏死因子.0【(TNF-cx)、

白介素.6(II,6)等作用的影响,并提取下丘脑总RNA,进行实时荧光定量RT-PCR

测定下丘脑NPY和AGRPmRNA的表达水平,并初步分析其可能的作用机制。

实验选用断¥LlO天雄性健康SD大鼠,体重99.57-t-2.139。基础饲料适应喂养1周后,随机分为5组,正常对照组(normalcontrolgroup,NC)10只,高脂组(high.fat.fed

controlgroup,HFC)10只,高脂+天麻素低(gastrodinlow-dosegroup,GAS—L)、中

(gastrodinmiddle?dosegroup,GAS-M)、高(gastrodinhi}gh—dosegroup,GAS-H)

剂量组(浓度分别为15、30、60mg/kg-d)各8只。除正常对照组喂基础饲料外,其它

各组均喂高脂饲料。正常对照组和高脂组每天灌胃0.9%生理盐水0.3ml,高脂+天麻素

组灌胃同等容量但不同剂量的天麻素溶液。动物分笼饲养,温度(22±2)℃,湿度

为4096,---,60%,光线为12h明暗循环。各组动物每天上午定时记录进食量与饮水量。每

7天测一次体重,连续测8周。实验的第8周末,正常对照组、高脂组和高脂+天麻素低

国家自然科学基金资助项目No30572428

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Abstract

diseasebyWHO,ithasaseriousinfluence

Obesityhasbeenregardedasallepidemic

onthehealthofhumanbeings.Bodymetabolicdisorderresultsinoccurrenceofobesity,in

recentyears,manyresearchshowedthatobesityconnectswithgeneticgene,environment,

andSOOn,itisoneoftheglobalprevalentandindependentchronicdietarystructure

diseasecharacterizedwithfatexcessofbody.Recently,studyofreducingbloodlipidby

antioxidationaremoreandmore,becausealotofdatashowedthatobesityinducedby

metabolicdisorderhasimportantrelationshipwithoxidative-reducingsystem.Therefore,

themechanismandpreventionmeasuresofobesityhasbecomethechiefmatterof

continualdevelopmentin21st.Confirmedbyaclinicalandexperimentalresearch,Chinese

herbshaveabetteranti—obesityeffect,manyscholarsabroaddidalotofresearchon.Alot

ofresearchhasbeencarriedoninthefunctionofGastrodiarhizomebymanyscholars

abroad,furthermore,itWasrecentreportedthatgastrodinhadafunctionofanti—freeradical

andprotectingcellmembrane.However,asaninterventionmaterialusedforinhibiting

bodyweightofratsofhigh-fatdietremainstoevaluate.Ourexperimentusedgastrodin,

aneffectivemonomerofgastrodiarhizome,toobservetheeffectsonhiigh—fatfeedingrats,

finally,atheoreticalfoundationisobtainedforthedesignofChineseherbswithaobvious

effectsbutfewsideeffect.

Higll—fatfeedingSDratswereselectedasmodeltosimulatestateofhumanbody’S

constructdifferentgastrodinpuritytoobeseratsofhigh-fatdiet,inordertoobesity.To

examinetheeffectofitonbodyweight,caloricintake,thebloodglucose(Glu),theserum

levelsofmalondialdehyde(MDA),totalantioxidativeability(T-AOC),insulin(Ins),FFA,

GPT'GOT,bloodlipidandtheserumlevelsofLe;ptin,Resistin,,n吓-0【,IL-6,and

Real?timePolymeraseChainReactionRT—PCRWasusedtomeasurethegeneexpression

ofNPYandAGRPinhypothalamus.Byanalyzingsomerelativedatatosearchforits

possiblemechanismofaction.

The

WascarriedoutintheInstituteofPhysiologyandPsychology,School

experiment

ofBasicMedicalSciences,LanzhouUniversityandKeyLaboratoryofPre-clinicalStudy

forNewDrugsofGansuProvincefromJunetoAugust2007.Forty-fourhealthmaleSD

ratsof1weekoldand99.57±2.139wereselected.AfterbeingadaptivelyfedwithBasic

animalfeeds1week,healthymaleSDratswererandomlydividedintofivegroups:normal

III

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ofrats’waterintakebetweenlow,middleandhigh-dosegroup(P>0.05).Thelevelsof

serumMDA,bloodglucose,FFA,Leptin,Resistin,IL-6andinsulinresistanceindex(瓜I)of

HDF+gastrodinweredecreasedsignificantlyascomparedwiththoseinHFC

(P<O.05-0.001),andT-AOC,insulinsensitivityindex(ISr)ofHDF+gastrodinwerehigher

thanthoseinHFCsignificantly(P<0.05 ̄0.01).GeneexpressionlevelsofNPYandAGRP

alsoweredecreasedsignificantlyascomparedwiththoseinHFC(P<O.001).

Theresultsindicatethatgastrodinmight

animportantroleininhibitingrats’body

play

weightofhigh-fatdiet.Themechanismofactionmightbeitseffectofdownregulating

andAGRPinhypothalamus,improvingleptinresistance,

geneexpressionofNPY

serumresistinandinflammatoryfactor,elevatinginsulinsensitivity,degradingthelevelsof

andregulatingthebloodglucoseandserumlipid,especiallyantioxidativeeffection.

Keywords:Gastrodin,High-fat-fed,Obesity,NPY,AGRP,FFA,IRI

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关于学位论文使用授权的声明

本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定,同

意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版,允许

论文被查阅和借阅;本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分

内容编入有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存和汇编本学

位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论

文或成果时,第一署名单位仍然为兰州大学。

保密论文在解密后应遵守此规定。

论文作者签名:王丞

论文作者签名:虫蕴导师签名:

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脑外伤综合症、偏头痛等)及高血压等的辅助治疗【6】。近年来抗氧化降血脂的研究越

来越多,因为大量资料表明,肥胖诱导的代谢紊乱与细胞的氧化还原体系有着重要的

联系。而且最近有研究报道天麻素有抗自由基和保护细胞膜作用,既然天麻素具有抗

氧化和自由基的作用,那么是否可以抑制高脂饮食大鼠体重的增加,经查阅大量国内

外资料尚未见报道。

本实验选用不同浓度天麻素,观察其干预高脂饮食大鼠体重及下丘脑肥胖相关基因的表达、血清细胞因子及对血糖、血脂水平的影响,分析其可能的作用机制,为研

制出疗效好、副作用小的有效减肥中药提供一定的理论依据。

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(二)氧化功能测定试剂盒

1.MDA测定试剂盒,批号:姗806

2.T-AOC测定试剂盒,批号:20070806;南京建成生物工程研究所

(三)酶标试剂盒

1.IL-6试剂盒,晶美生物工程有限公司,批号:20070715

2.TI叮FIQ试剂盒,晶美生物工程有限公司,批号:20070715

3.抵抗素试剂盒,B.BridgeInternational,Inc,批号:774008’

4.瘦素试剂盒,B.BridgeInternational,Inc,批号:550017

(四)实时荧光定量试剂(盒)

1.Trizol:Invitrogen公司提供,批号:1373341

2.反转录试剂盒,宝生物工程大连有限公司TaKaRaCode:DRR037

3.RT.PCR反应试剂盒,宝生物工程大连有限公司提供TaKaRaCode:DRR041

4.18S、NPY、AGRP引物:宝生物工程大连有限公司合成

(五)其它

1.碘11125】胰岛素放射免疫分析试剂盒,北京科美东雅生物技术有限公司,批号:

姗0725

2.血脂测定试剂盒,广州标佳科技有限公司,批号:070411

3.谷丙转氨酶测定试剂盒,广州标佳科技有限公司,批号:070424

4.谷草转氨酶测定试剂盒,广州标佳科技有限公司,批号:070806

五、实验仪器及设备

1.756MC紫外型可见光分光光度计(上海精密科学有限公司)

2.AnkeTDL-5型台式离心机TGL-C型(上海安亭科学仪器厂)

3.FAll04型上皿电子天平M.200A型(上海精密科学有限公司

4.QT.1漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)

5.HH.W21.600电热恒温水温箱(北京光明医疗仪器厂)

6.202.3型电热恒温干燥箱(上海跃进医疗仪器厂)

7.双标尺架盘天平(上海精密科学一起有限公司)

8.乐康全2血糖检测仪(罗氏诊断公司)

9.HF328.U86超低温冷冻储藏(上海力申科学仪器公司)

10.TGL-16G-A高速台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)

11.ENSTD6100.1型全自动酶标分析系统(美国生物技术仪器有限公司)

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实验方法

一、动物分组

雄性健康SD大鼠44只,1周龄,体重99.57--+2.139,基础饲料适应喂养1周后,

随机分为5组,正常对照组(NC)10只,高脂组(HFC)10只,高脂+天麻素低(Q峪.L)、

中(GAS.M)、高(GAS.H)剂量组(浓度分别为15、30、60mg/kg.‘t)各8只。

二、饲养环境

44只动物分笼饲养于11个等大的饲养笼中,每笼4只,每隔2天更换一次垫料以保持笼内卫生。动物房温度为22±2℃,湿度为40%'-'60%,光线为12h明暗循环。

三、模型制备

除正常对照组喂基础饲料外,其它各组均喂高脂饲料。正常对照组和高脂组每天下午6点定时灌胃0.9%生理盐水0.3ml,高脂+天麻素组灌胃同等容量但不同剂量的天

麻素溶液。自由饮水。饲养8周。

四、观察指标

1.各组动物每天上午定时记录进食量与饮水量,连续N8周。

2.每7天测一次体重,连续测8周。

3.实验的第8周末,正常对照组、高脂组和高脂+天麻素低剂量组大鼠空腹12h后,股动脉取血测血糖值。

4.股动脉取血并分离血清后,用一次提取比色法测定血清游离脂肪酸、MDA、T-AOC水平,用酶联免疫法(EuSA)测定血清瘦素、抵抗素、TNF-ct、IL-6的水平。

由兰州军区总医院安宁分院检验科测定血脂(bloodlipid)、胰岛素(insulin,INS)、

谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)。计算胰岛素敏感指数(LU)和抵抗指

数(IRI)。IAI=I/(空腹胰岛素含量X空腹含量),mI=(空腹胰岛素含量X空腹血

糖含量)/22.5。

5.砌叮A提取和实时荧光定量RT-PCR:①取材:饲养8周后将各组大鼠处死,采用无菌术开颅取出下丘脑,置液氮冻存,然后转入.80℃超低温冰箱保存,以备RNA

提取。②RNA提取:按Trizol说明书提取下丘脑总RNA,然后用核酸蛋白含量测定仪

测定总RNA的浓度和纯度。③反转录:计算反转录所需的总RNA的量,根据试剂盒

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实验结果

天麻素对高脂饮食大鼠体重的影响

如表1所示,与正常对照组比较,高脂组大鼠的体重4--.8周明显高于正常对照组,差异非常显著(P<0.001)。与高脂组比较,各天麻素组体重均明显降低(P<0.05-0.01)。低剂量组从第四周开始出现差异,中剂量组从第二周开始出现差异,高剂量组从第七周开始出现差异,但低、中、高剂量组之间无差异(P>O.05),提示天麻素抑制高脂饮食大鼠体重的作用不存在剂量效应关系。见图1。

表1给药8w各组大鼠体重(91只)的比较(i±占)

Table1Comparisonofbodyweightamongfivegroupsatdifferenttimepoints

(i±岛g/rat)

NC0=10)rn2c(n=m)GAS-L0=8)GAS—M0=8)GAS-H0=8)

初始99.37±2.03100.07-1-1.1599.18±1.6099.81+1.5799.34±2.18

1W2W161.204-5.97162.16±4.87159.49±5.40157.55±3.98160.54±4.08218.6917.36230.70+7.39230.70±12.71220.11±6.59d224.13±5.50

3W285.69±12.53297.35±9.56286.84±10.64283.09±8.22d289.58±6.35

4W340.434-15.28360.93±12.454344.50±14.654345.91±10.25351.18±5.11

5W382.24±16.97415.15±14.750388.83±19.72d394.33±6.55。399.39±5.26

6W417.56±17.73461.99±16.70c429.50±22.59d441.35±11.30d444.66±4.7

7W449.36±18.58505.93±15.78c467.40±22.6旷483.19-1-9.41d484.99+5.694

8.W471.82±17.55537.76±15.08c494.51±21.54e510.34±7.11。513.12±10.砰

注:与正常对照比较,''<0.05,bp<o.01,cP<0.001;与高脂对照组比较,d.P<0.05,eP<O.01

二天麻素对高脂饮食大鼠热量摄入的影响

如表2所示,与正常对照组比较,高脂组摄入的热量显著增多俾<O.01,P<0.001)。

与高脂组比较,天麻素低、中、高各组的摄入热量从第4周后开始明显下降(P<0.05,

P<O.01,P<O.001)。见图2。

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四天麻素对高脂饮食大鼠NPY、AGRPmRNA的影响

如表4所示,与正常对照组比较,高脂组大鼠的NPY、AGRPmRNA表达增高,差异有显著性(P<O.001)。而天麻素低剂量组与高脂组比较,以上两种指标均下降

(P<O.001)。见图4~5;图6~1l(扩增和融解曲线)。

表4给药8w后各组大鼠M,Y、AGRPmRNA的比较(i±s)

"l’able4ComparisonoftheserumlevelsofNPY,AGRPmRNAamongthreegroups(i±s)

NC(n=1∞HFC(n=1∞GAS.【砌=乃

NPY1.49_-q).353.09_+0.4740.90_+0.280

AGRP1.40_+0.352.23_+0.2矿1.13_+0.30D

注:与正常对照比较,ap<0.001;与高脂对照组比较,bp<0.001

五天麻素对高脂饮食大鼠Glu、INS、ISI、IRI的影响

如表5所示,与正常对照组比较,高脂组大鼠的血糖浓度升高,胰岛素敏感指数下降,抵抗指数上升,差异有显著性(P<O.05,P<0.01)。而天麻素低剂量组与高脂组

比较,血糖浓度降低,胰岛素敏感指数升高而胰岛素抵抗指数降低俨<0.001)。见图12~

15。

表5给药8w后各组大鼠Glu、Ins、ISI、IRI的比较(i士s)

Table5ComparisonofthebloodglucoseandserumlevelsofInsulin,ISI,IRI

amongthreegroups(i±占)

NC0=10)HFC(n=10)GAS-I如=8)

Glu(mmol/L)6.6±0.67.6±0.986.6±0.6c

玳S(ItLU/mL)29.42±6.8739.18±8.18"33.97±3.01

ISI-5.24±0.27-5.67±0.19b-5.41±0.13。

IRl8.63±2.2913.09+2.4509.96±1.27c

注:与正常对照比较,aP<0.05,bp<0.011与高脂对照组比较,cP<0.01

六天麻素对高脂饮食大鼠瘦素、抵抗素、TNF-c3t、IL-6的影响

如表6所示,与正常对照组比较,高脂组大鼠的瘦素、抵抗素、IL-6水平增高,

差异有显著性(P<O.05,P<0.01)。而天麻素低剂量组与高脂组比较,瘦素、抵抗素、

册a、IL-6水平均下降(P<O.05)。见图16~19。

10

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表8给药8w后各组大鼠T-AOC、MDA、GPT、GOT的比较(i±s)

Table8ComparisonoftheserumlevelsofT-AOC,MDA,GPT,GOTamongthreegroups(i±s)

NC伪=1∞riFC(n=10)GAS-I和=8)

TAOC(u/mL)21.75±11.959.56±0.86011.30-1.30c

MDA(nmol/mL)3.84±0.416.03±0.5903.68±0.38"

OPT(m/L)50.92±9.3460.23±8.09-62.82±12.34

GOT(IU/L)88.70±9.8084.80±8.0190.38±16.94

注:与正常对照比较,?艮O.05,bp<0.001;与高脂对照组比较,cp<0.01,dp<0.001

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