流感高发关于流感病毒你应该知道的N个真相
作者：樊瑞
来源：《科学大观园》2018年第03期
流感，是由流感病毒引起的传染病。打了这么多年抗击流感病毒的战役，
这几个有关流感病毒的问题你都知道答案吗？
进入冬季，多地流感来势汹汹：
北京疾控
流感病毒活动度呈上升趋势，儿童老年人为高危人群。
上海疾控
流感高发期已至，乙型流感时隔三年卷土重来。
广东疾控
流感凶猛！广东流感疫情八成在小学。
流感，是由流感病毒引起的传染病。打了这么多年抗击流感病毒的战役，这几个有关流感病毒的问题你都知道答案吗？
流感病毒、禽流感病毒、乙型流感病毒都是啥？
流感病毒属于正粘病毒科，有4个属，包括A型流感病毒属（也称甲型流感病毒属）、B 型流感病毒属（也称乙型流感病毒属）、C型流感病毒属（也称丙型流感病毒属）和D型流感病毒属（也可称为丁型流感病毒属）。
A型流感病毒引发的症状是最严重的;B型流感病毒并不严重，但仍能引起暴发，而C型流感病毒通常是导致轻微症状;D型流感病毒是新发现的，很多问题还在研究中。
人们生活中常见的流感病毒和禽流感病毒都属于A型流感病毒，而这个冬天在我国多地肆虐的多是B型流感病毒。
A、B和C型流感病毒在总体结构上非常相似。病毒颗粒直径为80～120纳米，通常为大致球形，但可能出现丝状形式。
所有流感病毒的病毒颗粒在组成上是相似的：病毒包膜包裹在中心核周圍，病毒包膜含有两种类型的糖蛋白，中心核包含病毒RNA基因组和其他病毒蛋白质。
流感病毒的基因组不是一条核酸，而是几个片段的负链RNA，每个片段的RNA包含一个或两个基因。这个冬天年流行的A型和B型流感病毒为例：
A型流感基因组包含8个RNA片段，编码11种蛋白质：血凝素（HA ）、神经氨酸酶（ NA ）、核蛋白（ NP ）、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB1-F2和PB2。
B型流感病毒的基因和A型病毒类似，也为8个片段。在第6片段除编码NA蛋白外，还在编码NB蛋白。第7片段编码M1和BM2蛋白。BM2蛋白具有离子通道活性，是病毒增殖不可缺少的。
H5N1、H3N2是什么意思？
我们经常在媒体上看到一些报道，如浙江发生H7N9禽流感疫情，香港某鸡场发生高致病性H5N1禽流感疫情，北京出现甲型H3N2和甲型H1N1流感病毒共同流行等等。
H7N9、H5N1、H3N2究竟是什么意思？
原来，这些不同的名字代表着不同的A型流感病毒亚型。
A型流感病毒根据病毒表面的血凝素（ HA ）和神经氨酸酶（ NA）这两种蛋白可分为多个亚型。目前已知HA亚型有18种，NA亚型有11种，HA和NA之间可以自由组合，理论计算流感病毒的亚型有198种。
例如，“H7N2病毒”是指具有HA7蛋白和NA2蛋白的A型流感病毒亚型。同样地，“H5N1”病毒就是具有HA5蛋白和NA1蛋白的A型流感病毒亚型。
目前对流感病毒的命名是根据1980年WHO公布的命名法，即型别/宿主（人可省略）/分离地点/病毒株/序号/分离年代（HA与NA亚型号）。
除了H17N10和H18N11亚型以外，所有已知的A型流感病毒亚型都可以感染鸟类，而H17N10和H18N11亚型仅在蝙蝠中发现。
目前只有两种A型流感病毒亚型（即H1N1和H3N2）在人群中普遍流行。在其他受感染的动物物种中发现了一些亚型，例如H7N7和H3N8病毒可感染马并引起疾病，H3N8病毒也可感染马和狗并引起疾病。
流感病毒到底有多可怕？
1.变异性强
流感病毒可以说是世界上变异最快的病毒，而A型流感病毒是变异最为频繁的一个类型，每隔十几年就会发生抗原性大变异，产生一个新的毒株。
对于A型流感病毒变异性的原因，学术界尚无统一认识，一些学者认为，是由于人群中传播的A型流感病毒面临较大的免疫压力，促使病毒核酸不断发生突变。另一些学者认为，是由于人A型流感病毒和禽流感病毒同时感染猪后发生基因重组导致病毒的变异。
A型流感病毒的高变异性增大了人们应对流感的难度，无法准确预测即将流行的病毒亚型，便不能有针对性地进行预防性疫苗接种;另一方面，每隔十数年便会产生根本就没有疫苗的流感新毒株。
流感病毒变异与其他病毒不同，特点是表面抗原HA和NA极易变异。
常见的流感病毒抗原变异有两种形式：
①抗原漂移：其变异幅度小，HA、NA氨基酸的变异率小于1%，属于量变，即亚型变异。一般认为是由病毒基因点突变所造成，并与人群选择力有关，每2～5年出现一个新的变异株，引起中、小型流行。
②抗原转换：变异幅度大，HA氨基酸的变异率为20%～50%，属于质变，即病毒株表面抗原结构发生一种或两种变异，导致新亚型的出现。
2.致病率高
全球每年约有5%～10%的成人和20%～30%的儿童罹患季节性流感。
令人闻之色变的禽流感病毒有高致病性禽流感（HPAI）或低致病性禽流感（ LPAI）的区别。LPAI和HPAI病毒都能在人类中引起严重疾病。
HPAI和LPAI病毒均可在家禽群中迅速传播。受LPAI病毒感染的家禽可能没有任何疾病迹象，或者只表现出轻微的疾病（如羽毛起皱和产蛋下降）。家禽感染HPAI病毒可导致严
重疾病，可引起影响多个内脏器官的疾病，通常在48小时内，鸡的死亡率高达90 %～100%。
3.流行规模大
流感每年在世界各地蔓延，导致大约300万至500万例严重疾病和大约25万至50万人死亡。
在地球北部和南部地区，疫情主要发生在冬季，而在赤道周围地区，疫情可能在一年中的任何时候发生。死亡主要发生在年轻人、老年人和其他有健康问题的人身上。
在20世纪，发生了三次流感大流行：1918年西班牙H1N1流感（约5000万人死亡），1957年亚洲H2N2流感（200万人死亡），1968年香港H3N2流感（100万人死亡）。进入到21世纪，也有几次流感影响广泛：2004年青海的H5N1（死亡6000多只鸟），2009年6月暴发了一种新型甲型H1N1流感大流行，2013年中国大陆的H7N9型禽流感。
哪些流感病毒最凶险？
不是所有的流感病毒亚型都会引起发病和流行。
A型流感病毒亚型之间存在遗传和抗原性差异，一些亚型通常只感染鸟类，而另一些亚型可以同时感染鸟类和人。禽流感病毒很少感染人，引起人类感染的禽流感最常见的亚型是H5、H7和H9病毒。其他病毒，如H10N8、H10N7和H6N8也在人群中被检测到，但程度较低。
下面我们来看看几个“臭名昭著”的流感病毒亚型：
1.H5亚型病毒
H5病毒有9种，已知的亚型包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。在世界各地的野生鸟类和家禽中发现的大多数H5病毒都是LPAI，但偶尔也检测到HPAI病毒。
H5病毒也可感染人，呈散發性，如亚洲谱系的HPAI H5N1病毒，目前在亚洲和中东家禽中流行。16个国家报告了人感染H5N1病毒的情况，经常导致严重肺炎和50%以上的死亡率。
2. H7亚型病毒
H7病毒有9种，已知的亚型包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8和H7N9。在世界各地的野生鸟类和家禽中发现的大多数H7病毒是LPAI病毒。
H7病毒感染在人类中是罕见的。与人类感染相关的最常见H7病毒是亚洲谱系的A型禽流感（H7N9）病毒，2013年首次在中国发现。虽然人类感染很少，但这些感染通常导致严重呼吸道疾病和死亡。
除了亚洲谱系H7N9病毒外，还有H7N2、H7N3、H7N7病毒也感染人。这些病毒主要在人中引起轻到中度疾病，症状包括结膜炎和/或上呼吸道症状。
3. H9亚型病毒
H9病毒有9种，已知的亚型包括H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8和H9N9。全球野生鸟类和家禽中鉴定的所有H9病毒都是LPAI病毒。已在亚洲、欧洲、中东和非洲的鸟类种群中检测到H9N2病毒。据报道，罕见的散发性H9N2病毒感染人，一般会引起轻度上呼吸道疾病。
如何应对流感病毒
1.消毒措施
知己知彼，百战不殆。流感病毒本质上是被糖蛋白包裹的RNA，因此它对高温、紫外线、各种消毒药敏感，容易被杀死。
①流感病毒对温度比较敏感，加热至 100 ℃的高温1分钟或56 ℃的温度30分钟都可以灭活病毒。
②阳光中的紫外线对病毒有很强的杀灭作用，也可用常用消毒剂例如1%甲醛、过氧乙酸、84液等消毒。
③保持个人卫生和环境卫生，做到勤洗手，洗手时使用肥皂或洗手液并用流动水洗手，双手接触呼吸道分泌物后（如打喷嚏）应立即洗手。
2.避免接触传染源
目前，预防A型禽流感病毒感染的最佳方法是尽可能避免接触传染源。受感染的禽类的唾液、黏液和粪便中都是重要的传染源。
①吃熟食，尤其是在市场上购买的禽类产品，一定要煮熟（其中心部分须在70℃以上烹煮至少2分钟）再吃，避免食用生鸡蛋。
②去动物园、野生动物园或者饲养活禽的农家乐之类的场所，尽量不要接触活禽，更不要捕捉野生鸟类食用，以避免风险。
③从事家禽相关工作或应对禽流感疫情的人员应按照生物安全防护办法操作，使用适当的个人防护设备和注意手部卫生。
3.进行预防接种
接种流感疫苗是预防流感病毒的第一步，也是最重要的一步。虽然有许多不同的流感病毒，但流感疫苗能预防最常见的病毒亚型。
①年龄在6个月以上的人都应该在流感活动开始之前每年接种流感疫苗。如果可能的话，在10月底前接种疫苗。
②高危人群（家禽从业者）接种疫苗对于降低严重流感的风险尤为重要。
③严重流感并发症的高危人群包括幼儿、孕妇、患有慢性疾病如哮喘、糖尿病或心脏病和肺病的人以及65岁以上的人。疫苗接种对于医护人员以及其他与高危人群一起生活或照顾高危人群的人来说，是很重要的。6个月以下的儿童患严重流感的风险很高，但年龄太小不能接种疫苗。照顾婴儿的人应该接种疫苗。
4.应用抗病毒药物治疗
国际卫生组织目前推荐用神经氨酸酶抑制剂治疗人感染A型禽流感病毒。对世界各地流行的禽流感病毒的分析表明，大多数病毒对奥司他韦（oseltamivir）、培拉米韦（peramivir）和扎那米韦（zanamivi）敏感。
不过，一些证据表明：HPAI亚洲系A型禽流感H5N1病毒（“亚洲H5N1病毒”）和亚洲系A型禽流感H7N9病毒（“亚洲H7N9病毒”）对这些药物具有一定程度的抗性。
最后是一道送分题：
如果流感相关症状出现，怀疑感染了流感病毒时，请尽早去医院诊治，千万不要拖。
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
流行性感冒防治知识培训测试试题 姓名：分数： 一、多选题（每小题3分，共15分） 1.关于流感的叙述下列正确的是（ABCDE） A.患者、隐性感染者为主要传染源 B.病初2~3天传染性最强 C.某一时期的流行多由单一血清型引起 D.少数重症病例病情进展快，可因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和/或多 脏器衰竭而死亡 E.咳嗽明显，食欲减退，可有鼻塞、流涕、胸骨后不适等 2.下列哪些是典型流感的主要临床表现（ABCD） A.突起畏寒、寒战和高热 B.全身酸痛明显，尤以背部和腿部最为明显 C.部分以呕吐、腹痛、腹泻为特点，常见于感染乙型流感的儿童 D.可有咽喉刺痛、胸骨下烧灼感、干咳 E.头疼及中毒症状明显 3.关于流感患者的肺炎，下列描述正确的是（ABCE） A.流感病毒本身可引起病毒性肺炎 B.病程中若持续或反复发热，呼吸道症状加重，提示可能并发细菌性肺 炎 C.并存慢性心、肺疾病和免疫功能低下者，容易迅速致死 D.都必须尽早应用抗生素 E.护理上应密切观察患者的体征
4.流感需与下列疾病鉴别（ABCDE） A.伤寒、麻疹 B.肺炎支原体肺炎 C.钩端螺旋体病 D.急性细菌性扁桃体炎 E.肺炎球菌性肺炎和流脑的早期 5.出现以下情况之一者为危重病例（ABCDE） A.呼吸衰竭； B.急性坏死性脑病； C.脓毒性休克； D.多脏器功能不全； E.出现其他需进行监护治疗的严重临床情况 二、单选题（每小题2分，共20分） 1.关于流行性感冒下列哪项是错误的( D ) A甲型流感易发生变异 B由流行性感冒病毒引起 C临床表现以上呼吸道症状较重 D全身中毒症状较重 2.关于流行性感冒病毒下列哪项是正确的( B ) A流行性感冒病毒属副粘液病毒 B甲、乙、丙、丁四型 C甲型不变异
防控流感的药物治疗方案 今冬流感来袭，来势汹汹，全民抗击。据全国流感监测报告，此次冬季流感活动强度要强于往年，主要由甲型、乙型流感病毒引起，曾誉为“万能药”的板蓝根在此次流感中也并未获得有效治疗效果。1月9日，国家卫计委针对今冬流感的诊断和治疗发布《流行性感冒诊疗方案（2018年版）》（下称方案），给出了权威的建议，10余种抗病毒药物、中成药和中药饮片等被列入方案。我院药学部根据国家相关要求，加强了流感防控工作的部署，细心梳理相关在院药品，针对地区流感趋势及医院收治病患特点，在口服奥司他韦紧缺的情况下，积极与配送公司联系，加班加点、积极备药并提供合理用药建议及应对方案。科学安排、精心组织、克服困难，全力做好药学服务，努力满足临床及患者需求，积极应战流感袭击。 根据卫计委公布的常用药目录，目前我院已储备抗流感药物有： 抗病毒药：奥司他韦胶囊、奥司他韦颗粒、帕拉米韦氯化钠注射液。 中成药：莲花轻瘟胶囊、清开灵胶囊、疏风解毒胶囊、银黄胶囊、小儿小儿豉翘清热颗粒。 在此次流感肆虐中，应充分弘扬中医药文化，利用中医辩证理论进行治疗。在中药治疗流感方面，除奥司他韦外，也可使用方案中所列的中成药：疏风解表、清热解毒类的金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、清开灵颗粒（口服液）、疏风解毒胶囊，以及银翘解毒类、桑菊感冒类等。其中儿童可选要为儿童抗感颗粒，小儿豉翘清热颗粒等。 临床用药过程中可从上述药物中选择对此次流感流行株敏感的抗病毒药物，注意区分普通感冒和流行性感冒，及早、合理应用抗流感病毒药物，避免盲目或不恰当地一种药物，造成过度用药、供货紧张等情况。治疗过程中需根据患者病理生理情况综合考虑，对于儿童、老年人、妊娠妇女、重症患者应特别注意，加强监护。规范和加强流感的临床用药管理，保证治疗和预防流感的有效性，从而达到缓解流感症状、降低并发症的发生率，降低病死率的目的。针对具体临床合理用药相关问题，推荐如下： 一、抗病毒治疗 1.抗流感病毒治疗时机 发病48 h 内进行抗病毒治疗可减少流感并发症、降低住院患者的病死率、缩短住院时间，发病时间超过48 h 的重症患者依然能从抗病毒治疗中获益。 重症流感高危人群及重症患者，应尽早（发病 48h 内）给予抗流感病毒治疗，不必等待病毒检测结果；如果发病时间超过 48 h，症状无改善或呈恶化倾向时也应进行抗流感病毒治疗。
2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析 发表时间：2014-04-09T14:43:02.983Z 来源：《中外健康文摘》2013年第39期供稿作者：刘婧媛 [导读] 2011-2013年两年间辽阳市均有流感病毒流行,通过实验室检测得知两年的流行病毒毒株型别不同,证实了流感病毒抗原性变异的特性。 刘婧媛 (辽阳市疾病预防控制中心质量管理科辽宁辽阳 111000） 【摘要】流行性感冒病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，传播迅速,常会引起暴发，甚至造成世界大流行。上世纪流感病毒就引起四次世界大流行，造成相当严重的损失[1]。目的为了探究流感病毒流行和变异规律，了解其根据流感病毒核蛋白（NP），M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲（A）乙（B）丙（C）三型[2],病毒具有抗原性变异的特性,提供控制流行的科学依据,对 2011—2013年度辽阳市流行性感冒的病原学监测结果进行分析。方法采集流感样病例的咽拭子标本,采用real time-PCR进行核酸检测，分别用人红细胞、狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2011年4月~2012年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%,经分型鉴定A型H3N2亚型2株(20%),B型Victoria5株(50%),B型Yamagata3株(30%),A型H1N1亚型、新H1N1未检出；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本593份,核酸检测PCR 阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%,经分型鉴定A型H1N1亚型2株(6.67%)，A型H3N2亚型,15株(50%),新H1N112株(40%)，B型Yamagata,1株(3.33%)，B型Victoria未检出。结论:2011~2012年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0179-02 1.材料和方法 1.1标本 2011年4月1日-2012年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本388份；2012年4月1日-2013年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本593份。 1.2流感病毒核酸 real time-PCR 1.2.1采用Quant One step RT-PCR kit RNA 提取试剂盒提取流感病毒样本核酸。 1.2.2QIAGEN real time (荧光定量PCR法)检测试剂盒扩增病毒核酸，反应体系见表1 组分体积（μl） 2×QuantiText Probe RT-PCR Master Mix12.5× 上游引物（40μM）0.5× 下游引物（40μM）0.5× Probe （10μM）0.5× QuantiText RT Mix0.25× Rneasy Free Water UP to 25 病毒核酸RNA 5.0× 1.2.3将上述加好的反应体系的反应管放于PCR仪进行反应，反应程序如下：见表2 步骤反应温度(℃)时间(min)是否采集荧光循环数 逆转录酶605否1 5030否1 预扩增9515否1 950.25否45 扩增及荧光收集550.5否45 720.5是45 725否1 1.2.4结果判定及标准 对照：阴性对照无CT值或CT值为零，阳性对照CT值＜30。 样品：CT值≤35报告为阳性。 样品：37≤CT值≤40为灰区，需重新采样检测。 样品：无CT值或CT值为零报告为阴性。 1.3流感病毒分离 上述PCR结果为阳性的样本接种培养好的MDCK细胞生长液，观察细胞病变情况。 1.3.1将已长成单成的MDCK细胞生长液，用DPBS液洗两遍。 1.3.2每瓶接种标本0.5ml，每个标本接种1瓶，轻摇，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附2小时。 1.3.3倒掉感染液，用DPBS液洗两遍，每瓶加入含2μg/ml胰酶的病毒维持液10ml，35℃培养。 1.3.4次日起每天观察有无细胞病变（CPE）并记录，如病变明显细胞脱落可收获并做血凝，如未有病变，继续观察7日收获做血凝。 1.4血凝实验
病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势 人副流感病毒的病原学特征及流行病学规律 1、HPIV的治疗中（）只能在早期使用 B、利巴韦林、干扰素和蛋白酶抑制剂 2、下列有关于HPIV的说法中，错误的是（） E、HPIV已成为能够导致最沉重疾病负担及影响经济的病毒之一 3、HPIV的实验室检测手段有（） A、LLC-MK2（恒河猴肾细胞） 4、有关HPIV的病原学特征说法错误的的是（） B、病毒粒子呈多形性、无包膜，直径约125～250nm 5、下列关于几个亚型的HPIV的季节流行特征的说法中，错误的是（） C、HPIV2的几乎每年均可检出，发病高峰期为春夏季
人呼吸道合胞病毒的病原学特征及流行病学规律 1、下列选项中（）属于HRSV的实验室检测 B、Hep-2细胞单层 2、（）是目前临床上唯一用于治疗HRSV感染的药物 A、利巴韦林 3、下列关于HRSV的临床表现中错误的是（） B、大多数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎 4、HRSV的致病机包括（） E、以上都是 5、HRSV的病原学特征不包括（） B、HRSV病毒粒子呈球形和棒状两种形态，病毒颗粒约120~300 nm 人禽流感病毒及实验室检验技术
1、血凝（HA）试验原理是HA能与人或其它动物多种红细胞表面（）受体结合引起红细胞凝集 B、N－乙酰神经氨酸酶 2、中国流感/人禽流感监测信息系统至少有（）个国家级网络实验室 A、60 3、人禽流感病毒检测接种鸡胚，样本需要在温度33-35℃、湿度40-60%条件下孵育（） A、2-3天 4、以下哪项不属于人禽流感病毒核酸检测方法（） D、鸡胚接种 5、微量血抑（HI）试验应制备相应亚型的（）个血凝单位的抗原 B、8
·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据
抗流感药物研究趋势 张志豪 流行性感冒简称流感，是人类还不能完全有效控制的世界性传染病，与疟疾、结核病并列为世界死亡人数最多的三种传染病。世界性流感首次大流行是在1889年-1890年，最先发现于俄国中亚的布哈拉(今乌兹别克)，先传到彼得堡，再传到西欧，一年内席卷全球。德国某些城市发病率达40%-50%。 1957年甲2型流感大流行。当年2月流行于中国贵州西部，3月传播全国，4月从香港出境扩散于世界，共死亡几十万人。流行地区发病率约50%，病死率0.01%。 1968年甲3型流感大流行。国外认为7月发源于香港，7月-8月流行于中国大部分地区，其后播散于世界。发病率30%，病死率与1957年相近，仅法国就死了4万人。医疗条件最好的美国，1934年-1966年32年间流感死亡数亦达51.2万人，平均每年1.6万人。 流感病毒是一种RNA病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)流感病毒属(Influenza virus)。根据流感病毒核蛋白(Nucleoprotein, NP)和基质蛋白(Matrix protein, MP)的抗原性不同可以将其分为A、B、C三型。流感病毒A型和B型属于流感病毒属，而流感病毒C型属于流感病毒C属。A型流感病毒能感染多种动物，包括人、禽、猪、马等，存在禽类的流感病毒又称为禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)，因此所有的禽流感病毒都属于A型流感病毒；B型和C型则主要感染人，从猪中也曾分离到。 流感病毒根据其表面纤突血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原的不同，又可以分为不同亚型。 流感病毒中重要的结构蛋白有以下几种： 1.镶嵌在病毒囊膜表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶(NA)。这两种糖蛋白与流感病毒结合宿主细胞，感染宿主细胞有关。 2.同样镶嵌于病毒囊膜上的少量的M2蛋白，这是一种PH依赖的质子通道，与宿主细胞中流感病毒遗传物质的释放息息相关。 3.位于囊膜之下，基质层中的M1蛋白。 4.核糖核蛋白符合体中，与负链RNA相结合的核蛋白NP和3种聚合酶PB2、PB1、PA。 这几种蛋白与流感病毒的复制，蛋白质的转录和翻译有着密切关系。 我们要设计有效的抗流感病毒药物，就要从这几类蛋白着手，了解其结构与功能，挖掘其潜在的抗病毒位点。 1865年巴斯德认识到他称之为“病毒”的微生物是传染病的病因。另一位德国细菌学家保罗·埃尔利希，杜撰了“魔术弹”这一短语用于描述他自己的伟大目标——发明特定药物来杀死引起特定疾病的细菌但不杀死患者。1910年埃尔利希发明了非那明，这是最初治疗梅毒的特效药，但副作用也十分可怕。 而后，1932年另一位德国化学家吉哈德·多玛克，发明了基于硫元素的化合物，它能杀灭引起血中毒的致命链球菌。在之后十年中，医生们能够从一大批新“磺胺”制剂中进行选择，足以对付很大范围的感染，从产褥热、肺炎直到淋病、脑膜炎。一次令人惊奇的偶然，盘尼西林出现了。1920年代，苏格兰细菌学家亚历山大·弗莱明发现葡萄球菌被培养皿上的一块霉菌所摧毁——这次偶然
一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。 （二）病毒核酸提取 1.实验材料及仪器
指导原则编号 流行性感冒病毒核酸检测试剂 注册申报资料技术审评指导原则 （征求意见稿2） 二〇一一年七月
目录 一、前言................................................. 二、范围................................................. 三、注册申报要求 ......................................... （一）综述资料....................................... （二）产品说明书..................................... （三）拟定产品标准及编制说明......................... （四）注册检测....................................... （五）主要原材料研究资料............................. （六）主要生产工艺及反应体系的研究资料............... （七）分析性能评估资料............................... （八）参考值（范围）确定............................. （九）稳定性研究资料................................. （十）临床试验研究................................... 四、名词解释 ............................................. 五、参考文献 .............................................
甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用说明书 【产品名称】 通用名称：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Alere BinaxNOW? Influenza A＆B Card 【包装规格】 22人份/盒。 【预期用途】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）是一种体外免疫层析试验，用于定性检测鼻咽拭子样本中的甲、乙型流感病毒核蛋白抗原，可快速地对甲、乙型流感病毒感染做出辅助鉴别诊断。 试验简介 流感是发生在呼吸道的具有高度传染性的急性病毒感染，它属于传染病范畴，可通过咳嗽或打喷嚏时排出的带有活病毒的气溶胶而在人与人之间传播。每年的秋季和冬季都可爆发流感1.甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒流行性要强，造成的病情也更严重，并且大多数严重的流感也都是由它引起的，而乙型流感则相对比较缓和。 针对甲、乙型流感的快速诊断试验对获取有效的抗病毒治疗是很有意义的。对流感做出快速诊断不但可减少病人住院的天数，减少抗菌素的使用，而且可减少病人的住院费用1。 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）提供了一种用鼻咽拭子标本对甲型和乙型流感进行简便快速诊断的方法，使用方便，结果快速，在急诊检验中提供的信息可帮助医生选择治疗方案并做出是否需要收住院的决定。 甲型流感病毒有许多亚型，有些亚型可在鸟类中发现3。1997年首次报道人类甲型禽流感（H5N1，主要发生于鸟类的一种流感病毒亚型），此后，在人群中出现了H5N1病例，使人们对H5N1关注起来，H5N1的变异使得它更易在人群间传播4，由于备案的禽流感感染病人比
例很低，快速试验在该类病人治疗中利用度尚不得知。 【检验原理】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原这些单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个称作检测卡的书型铰链状的纸板中。 拭子标本需要进行预处理：用洗脱液、盐水或转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，将标本加到检测条顶端，闭合检测卡，15分钟时根据是否出现紫红色样品线来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。 【主要组成成分】 提供的材料 1.检测卡：22人份。包含对甲型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、结合 有胶体金颗粒的对甲型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、对乙型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、结合有胶体金颗粒的对乙型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、兔抗羊IgG、结合有胶体金颗粒的羊IgG。2.吸管：22份，吸管的体积是固定的（100ul），用于向检测卡中加标本用。只能使用随试 剂盒提供的吸管或经过校准能转移100ul标本体积的吸管。 3.阳性对照拭子：1份，将灭活的甲型流感病毒和灭活的乙型流感/哈尔滨（即乙型流感病 毒）干燥结合到拭子上。 4.阴性对照拭子：1份，灭活的A群链球菌干燥结合到拭子上 5.对照拭子用洗脱液小瓶:2瓶，小瓶中含约洗脱液，用于处理测试的对照拭子。 不包含但试验必需的组分（可单独购买） 鼻咽拭子附件包： 鼻咽拭子：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是无菌拭子，可用其他
附件5：流感监测实验技术操作规范 一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输 （一）、流感临床标本的采集 病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。 采样液常用的采样液有以下五种： 普通肉汤、pH 7.4～ 7.6的Hank's、Eagle's、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。 为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为 0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为 7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml,-20℃冻存。采样方法有以下几种： 1)鼻拭子： 将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 2)咽拭子： 用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。注： 亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3)鼻咽抽取物： 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。 先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。 收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。4)漱口液： 用10ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液 5)鼻洗液： 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。 （二）、临床标本运送 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。 冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，24小时内能进行病毒分离的，可以放置4℃保存。如未能分离的标本应置-70℃或以下保存。 临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。 （三）、临床标本处理 临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。含聚丙烯纤维的拭子的采集标本，先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液的标本，充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5ml。上清液可直接接种或低温保存。 鼻咽漱液或抽取液：
抗流感药物靶点及其抑制剂 流感病毒是一种负螺旋单链RNA病毒，属于正黏病毒科。根据病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基质蛋白（matrix proteins，M1）的抗原决定簇不同，流感病毒被分为三类：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒颗粒结构大致相似（如图1），自内而外可分成核心、基质蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圆形，长丝状。甲型和乙型流感病毒核酸有八个RNA节段，负责编码十种蛋白，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、碱性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、离子通道蛋白（M2）、非结构蛋白（NS1）、核输出蛋白（NEP或NS2）。此外，大多数甲型流感病毒还有线粒体靶向的寡聚PB1-F2蛋白[1]，报道其与细胞凋亡以及病毒毒力有关。这些病毒RNA片段同NP 结合并缠绕形成病毒核糖核蛋白体（vRNP），vRNP再与三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）结合形成核糖核苷酸，负责RNA的复制和转录，这种结合模式确保了病毒RNA对于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七个RNA节段。基因组分节段的特点为流感病毒高频率基因重配提供了条件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包围，在脂膜上有基质蛋白M1，其是病毒颗粒的主要蛋白，并通过化学键结合到vRNP。M2蛋白为具有离子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一种叫做BM2的蛋白可以起到类似M2蛋白作用。病毒最外层的包膜是包裹基质蛋白的磷脂双分子层，该膜来源于宿主细胞的细胞膜。膜表面具有两类非常重要的“刺突”，即两种糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相对简单，仅有一种HA 和一种NA。对于甲型流感，根据病毒表面抗原HA及NA的不同，其可进一步细分为16个HA亚型（H1 ～ H16）、9个NA亚型(N1 ～ N9)[2]。 图1 甲型流感病毒结构模式图[3]
流感病毒作用机理及抗流感药物研究进展 S1130556 田玉伟 摘要：流感病毒是人类健康的一大威胁。应对流感病毒的主要方式是疫苗和药物治疗。对可能大规模爆发的流感疫情来讲, 药物治疗是最好的控制流感病毒传播的手段。本文主要从流感病毒致病机理及抗流感病毒药物研究最新进展方面进行阐述。 关键词：流感病毒；抗病毒作用机制；抗流感病毒药物； The mechanism of influenza virus and the development of anti-influenza virus agent Abstract : Influenza is a major threat to millions of people worldwide. Vaccines and antiviral agents are two main options available to reduce the impact of the influenza virus, while anti-influenza agents are the most effective means to prevent the transmission of the highly contagious virus and to treat the epidemics of disease. In this article, recent progress in the research of the action mechanisms and structure-activity relationships of these anti-influenza virus agents were reviewed. Keywords: influenza virus ;anti-viral mechanism;anti-influenza virus agent; 1 流感病毒生物学结构 流行性感冒病毒[1-3]（influenza virus）简称流感病毒，属正粘病毒科（orthomyxoviridae），呈球状或丝状，是一种有包膜和分节段的单链、负链RNA病毒。它可分为甲、乙、丙3型。甲型流感病毒常以流行形式出现，特点是传染性强，发病率高，传播快，可引起爆发流行乃至世界大流行，并可在动物中引起流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒，常引起流感局部爆发，不引起大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出现。 流感病毒的基因由8个单链RNA片段组成，分别为NA、HA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因。它们编码10种蛋白：膜蛋白血凝素（Hemagglutinin HA），神经氨酸酶（Neuraminidase NA），基质蛋白（Matrix protein1 M1，核蛋白（Nucleoprotein NP），3种RNA依赖多聚糖（RNA-dependent RNApolymerase PB1、PB2和PA）离子通道蛋白（Ion channel protein M2）和非结构蛋白（Non-structural protein NS1和NS2）。
常用流感病毒实验室检测方法的比较 摘要目的通过对四种常用流感病毒检测方法的比较，确定适用于常规监测及疫情暴发时的检测方法。方法用四种方法对随机抽取的50份样品进行检测，对结果进行对比分析。结果胶体金法虽简单快速，但漏检率较高（20.00%）；RT-PCR法灵敏快捷，准确度高（34.00%）；细胞培养法费用适中，检出率较高（14.00%）；鸡胚培养法检出率最低（2.00%）。结论胶体金法适合疫情现场检测，RT-PCR法适合实验室内快速检测，组织培养法适合常规监测，鸡胚培养法适合流感疫苗生产。 关键词组织培养；鸡胚培养；病毒分离；RT-PCR；流感病毒 现在实验室对流感病毒的检测手段有很多种，在本科室常用的方法有胶体金法、细胞培养法、鸡胚培养法、RT-PCR法四种。为实际工作中找到最适合的检测方法，更及时准确的提供检测结果，对实验室常用的四种流感病毒检测方法进行比较。现报告如下。 1 资料与方法 1. 1 检测样品2014年1～4月份本院对就诊的流感样病例（发热，体温≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一者，未服用过抗病毒药物[1]）采集的鼻咽拭子，随机抽取50份。流感病毒采样管由北京友康恒业科技有限公司购买。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 胶体金法美国QUIDEL公司，QuickVue Influenza A+B Test，按照试剂盒说明书操作。 1. 2. 2 细胞培养法MDCK细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。样品前处理：将采样管漩涡震荡10 s，反复挤压拭子头后弃去拭子，加入青霉素、链霉素、制霉菌素，4℃静置2 h。细胞传代及病毒接种按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品接种MDCK细胞培养出的第一代病毒培养液用1%豚鼠血红血球进行微量血凝实验（haemagglutination assay，HA），HA≥1：8的第一代病毒培养液用血凝抑制法（hemagglutination inhibition，HI）进行流感病毒分型鉴定（鉴定试剂盒由国家流感中心提供）。HA<1：8的第一代病毒培养液再次接种MDCK细胞增毒，增毒后HA≥1：8的第二代病毒培养液用HI法进行流感病毒分型鉴定，HA<1：8的第二代病毒培养液用RT-PCR法进行流感病毒分型鉴定。第一代病毒培养液HA为阴性的再次接种MDCK细胞，盲传一代后仍为阴性的报告未检出流感病毒。 1. 2. 3 鸡胚培养法9～11日龄无特定病原菌（specific pathogen free，SPF）鸡胚蛋由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买。双腔接种法按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品前处理、增毒、盲传、
流感病毒检验 发表时间：2009-08-10T09:20:24.920Z 来源：《中外健康文摘》2009年第20期供稿作者：谭耀武 (黑龙江省宝清县八五三农场疾控中心黑龙江宝清 [导读] 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2009)20-0277-01 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒。流感病毒属正粘病毒科，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现的前后顺序，更重要的是反映了对人危害程度的顺序，甲型常以流行的形式出现，可造成世界性的大流行，乙型常以局部流行的形式出现，丙型主要是侵犯婴幼儿。 1 样本采集 1.1采样液 Hank平衡盐、细胞培养液、牛肉浸液（小牛肉浸膏l0g、牛血清白蛋白2g，加蒸馏水至400ml、庆大霉素40mg、多粘菌素 B 0. 8mg，过滤除菌）等均可作采样液。 1.2采集鼻咽腔拭子标本（1）咽拭子：用棉签擦拭双侧扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸人2～3ml采样液中。（2）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插人鼻腔、接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液刷洗收集器3次。（3）含漱液：用8～10以采样液漱口。 1.3收集血清标本血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期应在发病7天内采集，恢复期则在发病后2～4周采集。血液标本以2500r/min离心l5min，收集血清，弃血凝块。 1.4标本运送病毒分离标本采集后应立即低温保存，应尽快送至实验室。24～48h内样品可置4℃保存，如48h内未能进行接种，应置－70℃或以下保存。血清标本可在4汇存放一周，在－20℃长期保存。 1.5标本处理咽拭子标本，收集管于混合器充分震荡，用无菌镊子取出棉拭子并在管壁上反复挤压棉拭子后弃拭子，标本加入双抗（青霉素、链霉素）终浓度为l000IU/ml，混匀置4℃2h方可接种或低温保存；含漱液标本，混匀后自然沉淀，取上清液3ml，加双抗；鼻咽抽取物标本，取无菌毛细吸管将洗液反复吹打，把粘液打散，而后按上述方法进行处理；器官组织标本，先用无菌的乳钵磨碎，用生理盐水配成20％悬液，2000r/min离心l0min，取上清液3ml按上述方法进行抗菌处理。 2 检验方法 2.1材料和方法 2.1.1器材孵卵箱（38℃、33～35℃：各一个）、照卵器、卵盘、注射器、消毒剂、镊子、无菌生理盐水、毛细吸管、试管、液体石蜡和封口胶等。 2.1.2方法当今国内外常用狗肾传代细胞（MDCK）。将已长成单层的细胞管弃生长液，用含有l00IU/ml双抗HanK's液洗2遍，用0.2～0.4ml处理过的标本液接种于细胞管，每份标本接种4管，置35T吸附1～2h后弃标本液，加入病毒培养液，其量为生长液的2倍。如标本液清亮和进行病毒传代时，可不必吸附，直接加入。置33～35℃孵育7d。从第3d开始观察细胞病变（CPE），如细胞出现颗粒增多、变圆、脱落达+++～++++时进行收获。如果7d还不出现CPE，可收集病毒培养液做血细胞凝集试验，在做试验前将细胞管冻融1～2次，以提高病毒滴度。阳性者可测定其血凝滴度并鉴定之，阴性者混合4管细胞液盲传2代，仍为阴性则弃去。 2.3病毒鉴定新分离的病毒可用血细胞凝集抑制试验、补体结合试验和中和试验等方法进行鉴定。最常用和简单的方法是血细胞凝集抑制试验，必要时采用补体结合试验。 2.4快速诊断流感病毒的主要感染部位是呼吸道上皮细胞，在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物。 2.5血清学诊断病毒分离是诊断流感最常用的方法之一，如因各方面因素未分离出病毒，血清学亦可作为一种代替手段，但必须收集急性期和恢复期双份血清，如恢复期血清特异性抗体较急性期增高4倍或以上，即可诊断。本章介绍两种常用的方法：血凝抑制试验和中和试验。
附件2： 流行性感冒病毒抗原检测试剂注册申报资料 技术审评指导原则 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对流行性感冒病毒（以下简称流感病毒）抗原检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对流感病毒抗原检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 二、适用范围 流感病毒抗原检测试剂是指利用胶体金法、酶联免疫法
等基于抗原抗体反应原理，以特定的流感病毒抗原为检测目标，直接对人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物样本中的流感病毒进行体外定性检测的试剂。 本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。 三、注册申报资料要求 （一）综述资料 流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为16个H亚型（H1-H16）和9个N亚型（N1-N9）。在甲型流感病毒中，目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有人感染的报道。由于编码HA和（或）NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和（或）NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的转变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移（antigenic drift），因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般