实验一酶催化蔗糖转化反应（~28学时）
一、目的和要求
1．用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。
2．了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。
3．学会米氏常数的测定。
二、实验原理
蔗糖转化反应
蔗糖＋水——→葡萄糖＋果糖
这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。
溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度α与反应物浓度C成线形关系，即
α＝kC
作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。
三、仪器和试剂
旋光仪1台
恒温槽1套
葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯）
醋酸－醋酸钠缓冲溶液
四、实验步骤
1．蔗糖酶的提取
取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌15～20分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37℃保温60小时左右。取出后加入3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH＝4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。
2．作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线
根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：
y ＝－60.28x ＋α
其中 x －蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M ） y －蔗糖转化进程中体系的旋光度值 α－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。 α＝66.6×L ×C （L ＝10cm ，C 是蔗糖浓度g/mL ）
通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄糖的浓度x ，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。
3． 酶比活性的测定
配制2.5％的蔗糖溶液100 mL ，测定其旋光度。在20℃的条件下加入蔗糖酶5 mL ，反应3分钟测定体系旋光度值y ，用公式 y ＝－60.28x ＋α 求出葡萄糖浓度x ，及生成葡萄糖的毫克数，即可求出酶的比活性。（上述方法制备的酶，其活性约每毫升20单位。）
比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)
4． 蔗糖酶进程曲线的制作
取200 mL 0.1 M 的蔗糖溶液，在35℃水浴条件下恒温，加10 mL 蔗糖酶溶液，每5分钟取出20 mL 反应液加5滴5 M NaOH 灭活后，测定一次体系的旋光度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线。
5． 蔗糖酶米氏常数的测定
用缓冲溶液稀释0.5 M 的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL ，在35℃恒温条件下加入10 mL 已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入1 mL 5 M NaOH 溶液终止反应，测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V ，根据米氏方程
max m V )S
V
(K V +-=
用反应速度V 对（V/S ）作图，直线的斜率-K m ，直线的截距为V max ，从而可以求出米氏常数K m 。
五、数据处理
1．利用(3)中的数据计算酶的比活性。
2．利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线。 3．利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数。 六、参考文献 [1] 沈同等，“生物化学”，上册，人民教育出版社，1980年版。 [2] 复旦大学，“物理化学实验”，上册，人民教育出版社，1979年版。 [3] 朱俭等，“生物化学实验”，上海科技出版社，1981年版。
附录一 直线
直线方程一般可表示为：
y ＝a ＋bx （1）
式中y 和x 为由实验数据可确定的量；a 和b 为待定参数或函数。例如，对Arrhenius 公式指数式，y 和x 分别为lnk 和1/T ；a 和b 分别为lnA 和（－E/k ）。对式[lnr=lnk ＋nlnC]，y 和x 分别为lnr 和lnC ；a 和b 分别为lnk 和n 。
由于有实验误差，用n 对由实验确定的y i 与x i 值作y 对x 图时，一般说来，所得各点并不严格的在同一直线上，于是存在着这样的问题：应如何更合理地作出直线，从而更准确地求解a 和b 的值？应当指出，若直线选择不当（直线位置画的不当），不大的偏离，将可能导致a 和b 重大偏差。尤其是当试验测定的x 区间范围相对较小时，外推至x ＝0，将可使截距a 产生较大的误差。
例如依Arrhenius 对数式以lnk 对1/T 作图，由实验测定的温度范围外推至1/T ＝0，即T ＝∞时，所选的直线斜率的较小的偏差将会引起截距lnA 产生很大的偏差，致使指前因子A 产生更大的偏差。
怎样方能使直线位置选择（画）的得当呢？通俗地说，实测点（y i ~x i ）应均匀分布在直线两侧。严格的说，可采用下述“最小二乘法”确定最佳a 、b 值，作出最佳直线。
若取得的数据实验值y i 与x i （i=1、2、…n ），一般来说，y i 与a ＋bx i 值并不相等，令其误差为δi ，则
δi =y i ―a ―bx i
线性回归，要求适当选择a 与b 之值，使各对元数据的偏差δi 之平方和之值为最小。即
∑∑==--==n
1
i 2i i n 1
i 2i )bx a (y δS
∑==---=??n
1i i i 0)bx a (y 2a S
（2）
∑==---=??n 1
i i i i 0)x bx a (y 2b S
（3）
式中y i 、bx i 均为已知值。令y 与x 分别为y i 与x i 的平均值。
∑==n
1
i i y n 1y
∑==n
1
i i x n 1x
则式（2）、（3）联立，可得
x b y a -=
（4）
∑∑==---=
n
1
i 2
i n
1
i i i
)x (x )
y )(y x (x
b
（5）
由式（4）、（5）确定的a 和b ，称之为线性回归系数。用线性回归系数确定的直线方程
y ＝a ＋bx ，称为回归直线方程。其对应的直线，称为回归直线。
回归直线有下列性质 1．当x ＝x 时，由式（1）、（5）可知y ＝y ，即回归直线必通过（y ，x ）点。
2．由式（2）知，回归直线要求y 的各次实验值y i 与计算值a ＋bx i 偏差之总和为零，即各实验点均匀分布于回归直线的两侧。
欲度量一组实测点与回归直线的相符程度，常引用所谓的相关系数“γ”作为定量指标，其定义为：
∑∑∑----=
i
i
2
i i
2
i i
i
i i i i
)
y (y
)
x (x
)
y )(y x (x
γ （6）
当|γ|值在0～1之间，|γ|值越接近于1，表明该组实测点与回归直线吻合性越好。当|γ|=1时，表示所有的实测点均严格地落在回归直线上；|γ|<0.482，则该组x 、y 间线性关系不明显，此时推求回归直线方程已无意义了。
较精密的小型计算器一般配有直线方程的回归计算标准程序，使用十分方便。
附录二 酶催化反应
一、酶
酶与其他催化剂不同，能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢之中。所以说，酶在生物体的生命活动中占有极为重要的地位，研究酶的化学性质及其作用机理，对于人们了解生命活动的规律，从而进一步指导有关的医学实践及工农业生产具有重大意义。
酶的本质是蛋白质，酶是具有催化作用的蛋白质。酶蛋白主要由氨基酸组成，同其他蛋白质一样，具有两性电解质的性质，并具有一、二、三、四级结构，也受热、紫外线照射等物理因素及酸、碱、有机溶剂等化学因素的影响而变性或沉淀，丧失酶活性。酶的分子量也很大，其水溶液具有亲水胶体的性质，不能透析。在体外，酶能被胰蛋白酶等水解而失活。
根据酶的组成，酶可以分成简单蛋白质和结合蛋白质两类。脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等属于简单蛋白质，其活性仅仅取决于它的蛋白质结构；另一类酶，其中
的蛋白质部分——酶蛋白不具有活性，需要加入非蛋白的组分——辅助因子后，才表现出酶的活性，这就是结合蛋白质。酶蛋白与辅助因子结合后形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶。在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同，酶反应的专一性及高效率取决于酶蛋白本身，而辅助因子则直接对电子、原子或某些化学基团起传递作用。酶的辅助因子包括金属离子（Zn+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等）及小分子复杂有机化合物。它们本身无催化作用，但参与氧化还原或运载酰基载体的作用。在大多数情况下，可以通过透析等方法将全酶中的辅助因子除去，这种与酶蛋白分子松弛结合的辅助因子称为辅酶。在少数情况下，有一些辅助因子以共价键和酶蛋白较牢固地结合在一起，难以透析除去，这种辅助因子称之为辅基。细胞色素氧化酶与铁卟啉辅基就结合的比较牢固。酶母提取物经透析除去辅酶I(Co I)后，便失去了催化葡萄糖发酵的能力。
根据酶蛋白分子的特点可将酶分为单体酶、寡聚酶和多酶体系。单体酶只有一个多肽链，分子量在1.3万到3.5万之间，一般是催化水解反应的多肽链。寡聚酶由几个甚至几十个亚基组成，亚基之间不是共价键结合，彼此很容易分开，分子量从3.5万到几百万，如磷酸化酶a。多酶体系是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。多酶复合体的分子量一般都在几百万以上，它有利于一系列反应的连续进行，如在脂肪酸合成中的脂肪酶合成酶复合体。
在酶促反应中被酶作用的物质称为酶的底物。
根据酶促反应的性质可将酶分为六大类：
1．氧化还原酶类——催化氧化还原反应
A·2H＋B A＋B·2H
例如黄嘌呤?氧化还原酶（习惯称为黄嘌呤氧化酶）
2．移换酶类——催化功能基团的转移反应
AB＋C A＋BC
例如丙氨酸?酮戊二酸转移酶（习惯称为谷丙转氨酶或丙氨酸氨基转移酶）
3．水解酶类——催化水解反应
AB＋HOH AOH＋BH
这类酶包括淀粉酶、蛋白酶等。
例如ATP磷酸水解酶：
ATP＋H2O ADP ＋正磷酸
ATP是腺苷三磷酸（腺三磷），ADP腺苷二磷酸（腺二磷）。
4．裂合酶类——催化从底物上移去一个基团而留下双键的反应或其逆反应，这类酶包括水化酶、脱羧酶和脱氨酶等。
5．异构酶类——催化异构反应
A B
例如催化D、L互交，α、β互交的酶
6．合成酶——催化合成反应，催化一切必须与ATP分解相偶联，并由两种物质（双分子）合成一种物质的反应
X＋Y＋ATP XY＋ADP＋Pi
二、酶的分离提纯及活性测定
药物用酶、生化试剂用酶，对酶的纯度要求较高；对酶的物理化学性质和催化反应进行研究，亦需要纯度较高的酶或纯酶，所以必须对酶进行分离和提纯。生物体内的酶分为胞内酶和胞外酶两类。胞内细胞存在于细胞之内，必须使细胞破碎才能进行分离。胞外酶则容易分离，例如由动物胰液可分出各种蛋白酶和酯酶。
因为酶是蛋白质，故可以用提纯蛋白质的方法来提纯酶。盐析法是最常用的，盐析沉淀的蛋白质保持其天然构象，能再溶解。用于盐析的中性盐以硫酸铵为最好，因为它在水中的溶解度很高（20℃，760g/L）且其温度系数较小。其他提纯方法还有调节pH、等电点沉淀、有机溶剂（乙醇、丙酮、异丙醇等）分级分离等。因为酶是生物活性物质，所以在提纯时必须要减少活性的损失，全部操作需在0～5℃低温下进行。用有机溶剂分级分离则在-15～-20℃进行。为防止重金属使酶失活，有时需在抽提溶剂中加入少量的EDTA螯合剂；为了防止酶蛋白－SH基被氧化失活，需要在抽提溶剂中加入少量的巯基乙醇；为避免产生大量泡沫使酶变性，在分离提纯过程中不能过度搅拌。
为进一步提纯得到纯度更高的酶制剂，常用磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换－葡聚糖凝糖胶层析，凝胶电泳分离及亲和层析分离法。
为便于保存，需将酶制品浓缩、结晶。有三种保存方法：1、保存浓缩的酶液：用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使酶浓缩，使用前再透析除去硫酸铵。2、冷冻干燥：对于已除去盐分的酶液可以先在低温结冻，再减压使水分升华，制成酶的干粉，保存于冰箱中。3、浓缩液加入等体积甘油，于-20℃保存。
在分离提纯过程中，必须经常测定酶的比活性，以指导提纯工作的进行。
酶活性的大小也称为酶活力，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性的高低是研究酶的特性、进行酶制剂的生产及应用时的一项必不可少的指标。
酶的活性的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示。酶催化的反应速度愈大，酶的活性就愈高。所以测定酶的活性就是测定酶促反应的速度，这实质上就是酶的定量测定。酶反应速度可用单位时间内底物浓度的减少或产物浓度的增加来表示。
以产物浓度C对反应时间t作图（见图1－1）。酶反应速度即为该曲线的斜率。
图1-1 酶反应的速度曲线
从酶反应的速率曲线可以看出，反应速度在开始一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。下降的原因是由于底物浓度的降低、酶在一定pH及温度下部分失活、产物对酶的抑制、产物浓度的增加而加速了逆反应的进行等。因此，研究酶的反应速度应以酶促反应的初速度为准。这时上述各种干扰因素尚未起作用，速度保持不变。
在测定酶反应速度时，常常测定的是产物浓度的增加而不是底物浓度的减少。这是由于实验中，底物的浓度往往是过量的，反应时底物浓度的减小微乎其微，难以准确测定；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，其浓度就可以准确测定。
酶活性的高低用酶活性单位来表示。酶含量可以用每克或每毫克酶制剂含有多少个活性单位来表示（单位/克或单位/毫克）。例如 淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示，也可以用每小时催化1毫升2％可溶性淀粉液化所需要的酶量作为一个酶单位。
酶的比活性是指每毫克酶蛋白所具有的酶活性，一般用单位/毫克蛋白来表示。它常用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力。比活性愈高，表明酶愈纯。
三、酶促反应的动力学
1．酶作为生物催化剂除具有一般催化剂的共性外，还有其特性：
（1）催化效率高。以分子比表示，酶催化反应的反应速度比非催化反应高108～1020倍，比其它催化反应高107～1013倍，以转换数——每分钟每个酶分子能催化多
少个反应物分子发生变化表示，大部分酶为1000，高的可达106以上。
（2）酶作用的专一性。一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质，即一种酶只作用于一个或一类底物。
（3）酶易失活。强酸、强碱、高温等条件都能使酶受到破坏而完全失去活性，所以酶作用的条件一般都比较温和，如常温、常压、接近中性的酸碱度等。
（4）酶活性的调节控制。调节控制的方式很多，包括抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等，这里不予详细讨论。
（5）酶的催化活性与辅酶、辅基和金属离子有关。有些酶是复合蛋白质，其中的小分子物质（辅酶、辅基及金属离子）与酶的催化活性密切相关。若将它们除去，
酶就失去活性。
（6）在酶促反应中存在着酶被底物所饱和的现象。
高效率、专一性以及温和的作用条件使酶在生物体新陈代谢中发挥强有力的作用，酶活性的调控使生命活动中各个反应得以有条不紊地进行。为了最大限度地发挥酶反应的高效
蔗糖α0标准浓度曲线 c α0 矫正 0.5013 22.95 22.89 0.2506 11.45 11.39 0.2005 9.50 9.44 0.1253 5.80 5.74 0.1002 4.95 4.89 0.0000 0.05 -0.01 α∞标准浓度曲线 c α∞矫正 0.5 -5.46 -5.4 0.25 -2.46 -2.4 0.2 -1.81 -1.75 0.125 -1.36 -1.3 0.1 -0.96 -0.9 0 -0.01 0.05
Θ~T 图 0.40.60.8 100 200 300 B A B NewFunction1 (User) Fit of Sheet1 B A A B B Statistics Statistics Value Standard Error Value Standard Error Reduced Chi-Sqr Adj. R-Square 578.35485 424.1007 9 24.81417 308.50034 1287.37815 0.80259 浓度 0.05 时间 旋光度 分钟(min) 秒(s) T(s) α 矫正α θ 2 19 139 2.15 2.10 0.8916 3 5 185 1.60 1.55 0.6971 3 34 214 1.40 1.35 0.6264 3 56 236 1.25 1.20 0.5733 4 36 276 1.15 1.10 0.5379 5 21 321 1.00 0.95 0.4849 6 14 374 0.80 0.75 0.4142
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
实验2.7 蔗糖的转化 一级反应 一、实验目的 1．测定蔗糖在酸催化作用下水解反应速率常数、半衰期和活化能。 2．掌握旋光仪的基本原理和使用方法。 3．掌握一级反应的动力学特征。 二、基本原理 蔗糖在水中转化为葡萄糖与果糖，其反应方程式为： C12H22O11(蔗糖)+H2O = C6H12O6(葡萄糖)+ C6H12O6(果糖) 此反应是二级反应，在纯水中反应速率极慢，为使蔗糖水解反应加速，常以酸为催化剂。由于反应中水是大量的，可以近似认为整个反应过程中水的浓度是恒定的；而H+作为催化剂，其浓度也是固定的。因此，此反应可视为准一级反应，反应速率只与蔗糖浓度成正比。 根据反应动力学特征可知，测定反应的速率常数关键是在反应不同时间测定反应物的相应浓度。然而反应是在不断进行的，要快速分析出反应物的浓度是较困难的。但蔗糖及水解产物葡萄糖和果糖均为旋光性物质，而且它们的旋光能力不同，因此可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来衡量反应的进程。溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的种类、浓度、样品管长度、光源波长及温度等因素有关。在其它条件固定时，旋光度α与反应物浓度有直线关系，即： α = KC(2.7-1) 式中的比例常数K与物质的旋光能力、溶液性质、溶液浓度、样品管长度和温度等均有关。 物质的旋光能力用比旋光度来表示。在蔗糖的水解反应中，反应物蔗糖和产物中的葡萄糖都是右旋性物质，其比旋光度分别为66.6°和52.5°，但产物中的果糖是左旋性物质，其比旋光度为-91.9°。由于溶液的旋光度为各组成的旋光度之和，因此随着水解反应的进行，反应体系的右旋角度不断减小，最后经过零点变成左旋。当反应开始时(t＝0)、经过一段时间t，以及蔗糖水解完全时(t→∞)溶液的旋光度分别用α0，αt，α∞表示。则：
实验四蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定 参考 一、实验意义和目的 (2) 二、实验原理 (2) 三、材料、设备与试剂 (3) 四、实验步骤 (3) 1.蔗糖合成酶活性测定实验 (3) 2.转化酶活性测定 (4) 五、实验结果与分析 (4) 1.蔗糖合成酶活性测定.................................................................... 错误!未定义书签。 2.转化酶活性测定............................................................................ 错误!未定义书签。 六、误差分析........................................................................................... 错误!未定义书签。
一、实验意义和目的 蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质，其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响。蔗糖合成酶(SuSy)是植物进行蔗糖代谢的关键酶之一,与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关，在植物的生长发育和代谢活动中具有重要作用。转化酶也是催化蔗糖降解的重要酶类，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，还是控制淀粉合成的关键酶，测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。 通过本实验要掌握三种酶的作用、酶活力测定的原理和方法、学习酶活力的计算方法，了解糖类水解。 二、实验原理 1.蔗糖合成酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖 +UDP 果糖+UDPG。 2.转化酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+H2O—?葡萄糖+果糖。根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶分为两种：一种称为酸性转化酶，主要分布在液泡和细胞壁中，另一类转化酶称为碱性或中性转化酶，主要分布在细胞质中。 黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身 蔗糖合成酶
转化酶的测定 转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。 试剂：1、10%蔗糖溶液 2、葡萄糖标准液（500μg/ml） 3、0.05mol/l的磷酸缓冲液 4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。 方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。 2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。 3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定 ①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液： 管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖原液量（ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 加蒸馏水量（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 葡萄糖浓度（μg/ml）0 100 200 300 400 500 在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。 4、结果计算： A=(N-N’)*V/(T*W*1000) A：转化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V：酶反应液的总体积 T：反应时间W：材料鲜重
实验 15 蔗糖水解反应速率常数测定 一、实验目的 1．学习测定反应级数、反应速率常数的方法； 2．掌握旋光仪的使用；掌握通过测量系统物理量跟踪反应系统浓度的方法。 二、实验原理 蔗糖水溶液在H +存在的条件下，按下式进行水解： （葡萄糖）（果糖）（蔗糖）6 1266126] [2112212O H C O H C O H O H C H +??→?++ 在该反应中，H +是催化剂，当温度、H +浓度一定时，反应速率与蔗糖和水的浓度成正比， 即： B A c c k dt dc '=- （15.1） 式中，B A c c 、分别代表蔗糖浓度和水的浓度。 当蔗糖浓度很低时，反应过程中H 2O 浓度相对与蔗糖浓度改变很小，故，可近似认为c B 为常数，令： 常数==k c k B ' （15.2） 则（15.1）式可写成： A kc dt dc =- （15.3） 将（15.3）式分离变量后进行定积分： 当 t=0时， C A =C A0 ； t=t 时， C A =C A; 定积分式为： ??=-A A C C t A A kdt c dc 00 (15.4) 积分结果： 0ln ln A A c kt c +-= （15.5） (15.5)式是t c A ~ln 的直线方程。反应进行过程中，测定不同时刻 t 时反应系统中蔗糖的浓度c A ，取得若干组c A 、t 的数据后，以lnc A 对t 作图，得一直线，表明该反应为一级反应（准一级反应），直线斜率为-k 。 物理化学的研究方法是采用物理的方法测定反应系统某组分的浓度，所谓物理的方法是利用反应系统某组分或各组分的某些物理性质（如面积、压力、电动势、折光率、旋光度等）与其有确定的单值函数关系的特征，通过测量系统中该物理性质的变化，间接测量浓度变化。此种物理化学的实验方法最大的优点是可以跟踪系统某组分或各组分
酵母蔗糖酶的提取方法 摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。 1材料与方法 1．1材料 酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。 1．2主要化学试剂和仪器 十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。 1．3酶活性测定 适当稀释的酶液0．5mL，加入0．3mL pH 4．6、0。1mol／L的NaAc—HAc缓冲液，0．2mL0．1mol／L的蔗糖，37℃准确反应15min，后加0．125mL 1mol／L的NaOH中止反应。 用DNS法叩在540nm波长下测定形成的还原糖量。在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖，经DNS测定光吸收读数为1mA所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。 1．4蛋白质含量的测定 按Lowry氏法_1叩测定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准，绘制标准曲线。 l-5 SDS-PAGE 分离胶质量分数为12，浓缩胶质量分数为5。 1．6等电聚焦 用PhastSystem全自动快速水平电泳仪进行等电聚焦电泳。电泳程序的设置参照Amersham 公司使用手册。 1．7粗酶制备 1．7．1甲苯自溶法称取酵母10g，加入2OmL双蒸水使其溶解，加入2．4gNaAc和4．5mL 甲苯，摇床振荡10min，37℃恒温水浴69h。再加入4．8mL4mol／L的HAc和15mL双蒸水，调pH至4．5，于4℃、3000r／min离心30min，离心后将
生物化学第六章酶化学 第一节概述 一、酶的概念 1、酶的概念---酶是生物催化剂 （1）所有酶均由生物体产生 几乎所有的生物都能合成酶，甚至病毒也能合成或含有某些酶。 （2）酶和生命活动密切相关 几乎所有的生命活动或过程都有酶参加 A 执行具体的生理机制，如乙酰胆碱酯酶和神经冲动有关。 B 参与消除药物毒物转化的过程，如限制性核酸内切酶能特异性地水解外源DNA,防止异种生物遗传物质的侵入。 C 协同激素等物质起信号转化、传递与放大作用，如细胞膜上的腺苷酸环化酶。 D 催化代谢反应，在生物体内建立各种代谢途径，形成相应的代谢体系。 ◆酶的组成和分布是生物进化与组织功能分化的基础。 不同生物，有各自相应的酶系和辅酶；即使同类生物，酶的组成与分布也有明显的种属差异,例如精氨酸酶只在排尿素动物的肝脏内，在排尿酸的动物中没有；例如，肝脏是氨基酸代谢与尿素形成的主要场所，因此，精氨酸酶几乎全部集中在肝脏内。 ◆在生物的长期进化过程中，为适应各种生理机能的需要，为适应外界条件的千变万化，还形成了从酶的合成到酶的结构和活性各种水平的调节机制。 2、酶的化学本质---大多数酶都是蛋白质 （1）酶的相对分子质量很大,如胃蛋白酶的相对分子质量为36000. （2）酶由氨基酸组成，将酶制剂水解后可得到氨基酸。 （3）酶具有两性性质 （4）酶的变性失活与水解一切可以使蛋白质失活变性的因素同样可以使酶变性。酶都是蛋白质？核酶不是 二、酶的催化特性 1、高效率酶的催化效率比一般化学剂高106—1013倍 2、专一性 一种酶只能作用于一类或某一种物质的性质称为酶作用的专一性或特异性。 蔗糖酶只能催化蔗糖等。 三、酶的组成及分类 1、酶的组成—根据组成分为单纯酶和结合酶 单纯酶：由简单蛋白质构成，如水解酶（淀粉酶、蛋白酶等） 结合酶：结构中含有蛋白质和非蛋白成分，结合酶分为酶蛋白或脱辅基酶蛋白，非蛋白成分称为辅因子，辅因子又分为辅酶（与酶蛋白结合疏松，可用透析法除去）和辅基（不能用透析法去除）两类。 辅酶及辅基从化学本质来看分为两类：一类为无机金属元素（铜/锌/镁/锰等），另一类为小分子有机物，如维生素。 酶蛋白决定酶的专一性。 2、酶的命名 3、酶的分类—酶按其催化的反应分类
蔗糖合成酶的测定方法 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂 HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA； 0.2%(W/V)BSA；2%PVP； 0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。 2、酶活性测定 依次加入50μL粗酶液， 50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5， 20μL 50 mmol/LMgCI2， 20μL 100mmol/L UDPG， 20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖）， 30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作： 取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。 4、计算 样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）= 式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）； V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）； V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml） 淀粉酶活性的测定 1方法 1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。 1.2测定方法 1.2.1酶液的提取 将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL 预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再
探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用 1、实验目的 （1）初步学会探索酶催化特定化学反应的方法。 （2）探索淀粉酶是否只能催化特定的化学反应。 2、实验原理 淀粉和蔗糖都没有还原性,也就是都不能使斐林试剂还原,所以都不能与斐林试剂发生反应。唾液淀粉酶将淀粉水解成的麦芽糖则具有还原性,能够使斐林试剂还原,生成砖红色的沉淀。蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖都具有还原性,但唾液淀粉酶不能将蔗糖水解。 试验中可以用菊糖代替蔗糖。这是因为菊糖是由多个果糖分子缩合而成的，与淀粉同属于多糖，用菊糖与淀粉进行对比实验，更具有说服力。 3、实验材料 质量分数分别为3%的可溶性淀粉溶液和蔗糖溶液；质量分数为2%的新鲜淀粉酶（化学试剂商店有售）溶液。 4、试剂与仪器 斐林试剂（也可以用班氏试剂）试管、大烧杯、量筒、滴管、温度计、试管夹、三脚架、石棉网、酒精灯、火柴。 5、实验方法与步骤 （1）取两支洁净的试管，编上号，然后向1号注入2mL可溶性淀粉溶液和2mL新鲜淀粉酶溶液。向2号注入2mL蔗糖溶液和2mL新鲜淀粉酶溶液。 （2）轻轻振荡这两支试管，使试管内的液体混合均匀，然后将试管的下半部浸到60℃左右的热水中，保温5min。 （3）取出试管，各加入2mL斐林试剂（边加入斐林试剂，边轻轻振荡这两支试管，以便使试管内的物质混合均匀）。 （4）将两支试管的下半部放进盛有热水的大烧杯中,用酒精灯加热,煮沸并保持1min。 （5）观察并记录两支试管内的变化 6、注意事项 ①做好本实验的关键是蔗糖的纯度和新鲜程度。这是因为蔗糖是非还原性糖，如果其中混有少量的葡萄糖或果糖，或蔗糖放置久了受细菌作用部分分解成单糖，则与斐林试剂共热时能生成砖红色沉淀，使人产生错觉。为了确保实验的成功，实验之前应检验一下纯度。普通的细粒蔗糖往往是由于部分水解而具有一些还原糖。可用市售大块冰糖，水洗去其表面葡萄糖得到纯净的蔗糖。 ②实验中要将试管的下半部浸到37℃的温水中，因为淀粉酶在适宜的温度条件下催化能力最强。 ③在实验中，质量分数为3%的蔗糖溶液要现配现用（以免被细菌污染变质），取唾液时一不定期要用清漱口，以免食物残渣进入唾液中。 ④制备的可溶性淀粉溶液，一定要完全冷却后才能使用，因为温度过高会使酶活性降低，甚至失去催化能力。 ⑤实验中如果2号试管也产生了砖红色沉淀，可能的原因是： 蔗糖溶液放置的时间过长，蔗糖被溶液中的微生物分解成还原性的糖，从而影响实验效果。这时应临时配制蔗糖溶液。另一个可能的原因是试管不干净，所以实验之前应将试管用清水再清洗一次，试管编号要醒目。
实验一酶催化蔗糖转化反应（~28学时） 一、目的和要求 1．用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。 2．了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。 3．学会米氏常数的测定。 二、实验原理 蔗糖转化反应 蔗糖＋水——→葡萄糖＋果糖 这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。 溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度与反应物浓度C成线形关系，即 ＝kC 作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。 三、仪器和试剂 旋光仪1台 恒温槽1套 葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯） 醋酸－醋酸钠缓冲溶液 四、实验步骤 1．蔗糖酶的提取 取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌15～20分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37℃保温60小时左右。取出后加入3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH＝4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。 2．作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线 根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：
大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。 一．实验原理及相关知识 （1）蔗糖酶的介绍 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的 —呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 （2）。实验原理： 本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有以下分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
植物体内转化酶活性的测定 转化酶又称蔗糖酶(β—D—呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。 【原理】 转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。 通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在左右的为中性转化酶，最适pH在以下的为酸性转化酶)。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。 【材料、仪器与试剂】 1．材料：植物组织 2．试剂： , 2 mmol/L （1）提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，内含5 mmol/L MgCl 2 ,2% 乙二醇，%牛血清蛋白（BSA），2%PVP，5 mmol/LDTT。 EDTA-Na 2
20 ～ 20 学年度第学期 教师课时授课教案 学科系：医学院授课教师： 专业：科目：生物化学 教研室主任签字：学科系系办主任签字：年月日年月日
第二节酶促反应的特点与作用机制 一、酶促反应的特点 酶是一类催化剂，具有一般催化剂的特征:在化学反应前后没有质和量的改变;只能催化热力学上允许进行的反应;只加速可逆反应的进程，不改变平衡点;对可逆反应的正反应和逆反应都具有催化作用。但酶的化学本质是蛋白质，又具有一般催化剂所没有的特征。 (一）高度的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107-1013倍。例如蔗糖酶催化蔗糖水解的速率是H+催化作用的2.5×1012倍，脲酶催化尿素的水解速率是H+催化作用的7×1012倍，且不需要较高的反应温度。研究表明，酶能更有效地降低反应的活化能，使参与反应的活化分子数量显著增加，从而大大提高酶的催化效率。 (二)高度的专一性 一种酶只能催化一种或一类化合物，或一种化学键，发生一定的化学反应，生成一定的产物，这种特性称为酶的专一性或特异性。根据酶对底物选择的严格程度不同，酶的专一性可分为三种类型。 1.绝对专一性酶只作用于某一特定的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定的产物，称为绝对专一性。例如，尿酶只催化尿素水解成NH3和CO2，而对尿素的衍生物如甲基尿素没有催化作用。 2.相对专一性有些酶能作用于一类化合物或一种化学键，这种不太严格的选择性称为相对专一性。如磷酸酶对一般的磷酸键都能水解，不论是甘油磷酸酯，还是葡萄糖磷酸酯;蔗糖酶不仅水解蔗糖，
也能水解棉子糖，使之生成蜜二糖和果糖。 3.立体异构专一性有些酶对底物的立体构型有要求，仅作用于底物的一种立体异构体，这种特性称为酶的立体异构专一性。如L-氨基酸氧化酶只作用于L-氨基酸，对D-氨基酸则没有催化作用;淀粉酶只能水解淀粉中的α-1，4-糖苷键，而不能水解纤维素中的β-1，4-糖苷键。 (三)酶具有不稳定性 酶所催化的反应都是在比较温和的条件下进行的，如常温、常压、接近中性的环境等。由于酶的化学本质是蛋白质，任何能引起蛋白质变性的理化因素，如强酸、强碱、重金属盐、高温、紫外线、X射线等均能影响酶的催化活性，甚至使酶完全失活。 (四)酶促反应具有可调节性 酶促反应受多种因素的调控，以适应内外环境变化和生命活动的需要。例如在细胞内酶的分布具有区域化;酶原的激活使酶在合适的环境被激活和发挥作用;代谢物对关键酶、变构酶的抑制与激活和酶的共价修饰等调节;酶的含量受到酶蛋白合成的诱导、阻遏与酶降解速率的调节。 二、酶的作用机制 (一)酶能更有效地降低反应活化能 在任何一种热力学允许的反应体系中，底物分子所含能量各不相同，只有那些能量达到或超过一定水平的过渡态分子(即活化分子)オ有可能发生化学反应，底物分子达到活化分子所需要的最小能量称为
实验五植物体内转化酶活性的测定 转化酶又称蔗糖酶(β—D—呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。 【原理】 转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。 通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适pH 在7.0以下的为酸性转化酶)。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。如冀棉2号棉铃中纤维和种子部分的转化酶活性的最适pH 为3.5～4.0。 而本实验所选择的材料一棉花叶片中转化酶的最适pH为 6.0。 【材料、仪器与试剂】 1．材料：棉花叶片 2．试剂，10％蔗糖溶液；葡萄糖标准液(500μg／ml)，0.05mol／L pH6.0的磷酸缓冲液；3，5—二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262ml 2mol／L NaOH 溶液，加到500ml含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至l 000ml，贮于棕色瓶中备用。 3．设备 研钵﹑容量瓶(100ml) ﹑台式离心机﹑20ml刻度试管﹑恒温水浴锅﹑分 光光度计﹑移液管 【方法与步骤】 1．酶的提取：1 g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100m1，在冰箱中浸提3h，4000rpm离心15min(离心机型号LDZ 5—2)，上清液即为酶的粗提液。 2．酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH 6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml，在37℃水浴锅中保温0.5h，取出后立即按3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的含量(见下步)。以煮沸酶液10min钝化酶的试管作对照。 3．还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定
《探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解的作用》实验要点导析1、实验成败的关键 本实验的关键是蔗糖的纯度及蔗糖溶液的新鲜程度。蔗糖是非还原糖，如果不纯，混有少量的葡萄糖或果糖，或放置时间过长，容易被微生物分解成还原糖，这样与斐林试剂共热时也能生成砖红色沉淀，使人产生错觉。因此，实验中质量分数为3%的蔗糖溶液要现用现配（以免细菌污染变质）。 2、两支试管均产生砖红色沉淀的原因 本实验鉴定的原理是斐林试剂可与还原糖反应生成砖红色氧化亚铜沉淀。淀粉和蔗糖没有还原性，淀粉分解的产物是麦芽糖和葡萄糖，蔗糖水解的产物是葡萄糖和果糖，麦芽糖、葡萄糖和果糖都有还原性。如果2号试管（注入蔗糖但未注入淀粉）也产生也砖红色沉淀，可能的原因有以下几个： （1）试管不干净，残留有还原糖。 （2）蔗糖纯度不高，里面混杂有果糖、葡萄糖等。 （3）蔗糖溶液放置时间过长，被溶液中的微生物分解成还原糖。 3、本实验的特点及本实验的重要启示 本实验是探索类实验，主要目的是通过研究淀粉酶对淀粉和蔗糖的分解是否都具有催化作用，探索酶催化化学反应的特点。 本实验给我们重要启示是：设计实验时，确定好实验变量（自变量）、因变量和控制变量。 实验变量：淀粉酶。 因变量：淀粉、蔗糖水解的产物、水解的速率等的变化为变化的结果，即因变量。从因变量入手推知自变量（实验变量）对其影响程度或它们之间的关系。 控制变量：淀粉、蔗糖在实验过程中的浓度和用量，淀粉酶的浓度和用量，水解过程中的温度等都为控制变量，需遵循同时等量原则，以排除控制变量对水解反应的影响。 4、本实验设置1号试管的必要性 本实验设置1号试管，可以进一步确认淀粉酶能够催化淀粉水解成麦芽糖，并且对2号试管起到对照作用。 4、本实验检测底物是否水解的试剂斐林试剂可以换成碘液？ 由于蔗糖水解的产物是葡萄糖和果糖，蔗糖、葡萄糖和果糖遇碘都不变蓝，无法判断蔗糖是否被水解。
酶催化蔗糖转化反应 院系：化学学院 年级：2011级
一、目的和要求 1．用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。 2．了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。 3．学会米氏常数的测定。 二、实验原理 蔗糖转化反应 蔗糖＋水——→葡萄糖＋果糖 这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。 溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度α与反应物浓度C成线形关系，即 α＝kC 作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。
三、仪器和试剂 旋光仪1台 恒温槽1套 葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯） 醋酸－醋酸钠缓冲溶液 四、实验步骤 1．蔗糖酶的提取 取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌15～20分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37℃保温24小时左右。取出后加入3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH＝4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。 2．蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线 根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：
酶促反应的特点与作用机制 以下是为大家整理的酶促反应的特点与作用机制的相关范文，本文关键词为酶促,反应,特点,作用,机制,酶促,反应,特点,作用,机制,，您可以从右上方搜索框检索更多相关文章，如果您觉得有用，请继续关注我们并推荐给您的好友，您可以在医药卫生中查看更多范文。 酶促反应的特点和作用机制 宝鸡职业技术学院 20～20学年度第学期 教师课时授课教案
学科系：医学院授课教师： 专业：科目：生物化学 教研室主任签字：学科系系办主任签字：年月日年月日 酶促反应的特点和作用机制 宝鸡职业技术学院 第二节酶促反应的特点与作用机制 一、酶促反应的特点 酶是一类催化剂，具有一般催化剂的特征:在化学反应前后没有
质和量的改变;只能催化热力学上允许进行的反应;只加速可逆反应的进程，不改变平衡点;对可逆反应的正反应和逆反应都具有催化作用。但酶的化学本质是蛋白质，又具有一般催化剂所没有的特征。 (一）高度的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107-1013倍。例如蔗糖酶催化蔗糖水解的速率是h+催化作用的2.51012倍，脲酶催化尿素的水解速率是h+催化作用的71012倍，且不需要较高的反应温度。研究表明，酶能更有效地降低反应的活化能，使参与反应的活化分子数量显著增加，从而大大提高酶的催化效率。 (二)高度的专一性 一种酶只能催化一种或一类化合物，或一种化学键，发生一定的化学反应，生成一定的产物，这种特性称为酶的专一性或特异性。根据酶对底物选择的严格程度不同，酶的专一性可分为三种类型。 1.绝对专一性酶只作用于某一特定的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定的产物，称为绝对专一性。例如，尿酶只催化尿素水解成nh3和co2，而对尿素的衍生物如甲基尿素没有催化作用。
实验二十三 蔗糖水解反应速率常数的测定 一、实验目的 1．了解该反应的反应物浓度与旋光度之间的关系。 2．学习旋光仪的使用方法。 3．测定蔗糖在酸催化条件下的水解反应速率常数和半衰期。 二、实验原理 下列反应理论上是一个三级反应。 C 12H 22O 11(蔗糖) + H 2O ?? →?+ O H 3 C 6H 6O 6（果糖）+ C 6H 6O 6（葡萄糖） 总旋光度 t=0 C 0 0 0 0α t=t C 0-x x x α t=∞ 0 C 0 C 0 ∞α 但在低蔗糖浓度溶液中，即使蔗糖全部水解了，所消耗的水量也是十分有限的，因 而H 2O 的浓度均近似为常数，而H +作为催化剂，其浓度是不变的，故上述反应变为准一级反应。 一级反应的速率方程可由下式表示： — kc dt dc = 式中c 为时间t 时的反应物浓度，k 为反应速率常数。 积分可得： 0 ln c kt c = c 0为反应开始时反应物浓度。 一级反应的半衰期为： t 1/2= k k In 693 .02= 从上式中我们不难看出，在不同时间测定反应物的相应浓度，是可以求出反应速率常 数k 的。然而反应是在不断进行的，难以直接测量反应物的浓度，所以要考虑使用间接测量方法。因体系的旋光度与溶液中具有旋光性的物质的浓度成正比。设0α、t α和 α∞分别表示反应在起始时刻、t 时刻和无限长时体系的旋光度。反应在相同条件下进行，旋光度与浓度成正比，而且溶液的旋光度为各组成旋光度之和。所以有： α0=K 反c 0 （t=0，蔗糖尚未水解） （1） α∞=K 生c 0 （t=∞，蔗糖已完全水解） （2） αt = K 反c+ K 生(c 0－c) (3） 联立（1）、（2）、(3)式可得： c 0= 生 反K K --∞ αα0=K ′ （α0－α∞） (4)