※热原检查法
药检文摘日期:2004-8-11
热原检查法
1绪言
热原也称为发热性物质（日本药局方）''英文叫做Pyrogen，即能够引起恒温动物体温异常升高的物质总称。
与注射剂有关的发热性物质研究可追溯到16世纪。直到18世纪丹麦生理学家panum的研究中断定，“发热物质是一种对热稳定，溶于水，不溶于乙醇，由活的细菌中来的一类物质，而且微量静注后就能引起高热反应”。
1923年，Seibert肯定地证实了所有注射剂的发热原因是通过革兰氏阴性菌所产生的一种可滤过的高热稳定的热原污染结果。随后Rademaker进一步证实了Seibert的发现，并进一步强调避免细菌污染的重要性。之后的共同研究确立了使用家兔检测注射剂及水中致热物质的方法。
这个结果导致了官方的重视，20年后，美国药典于1942年USP12）进行了收载''其后，各国药典相继收载，CHP→1953年''BP→1953年''JP→1951年第6版药局方''半个多世纪来，热原检查法在保证注射剂的安全用药方面发挥了重要作用。
2热原与热原反应
热原即发热性物质，目前普遍认为是由革兰氏阴性菌所产生的内毒素（脂多糖），广义说，是所有引起恒温动物体温异常升高物质的总称。
除内毒素引起发热外，还包括病毒，干扰素以及其它种种发热物质。
热原反应是指临床输液反应，如果将携带超量热原物质的注射液静脉输入人体，通常在05-2h 内引起机体严重的临床反应。表现为：机体外周皮肤血管收缩，停止排汗，散热减少，发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐，严重时可出现昏迷、休克、死亡等一系列临床症状，体温通常可上升至40℃左右。
3热原的本质
在自然界，热原分布很广，可以说无处不在，无处不有，关于热原本质的研究，目前在世界范围内，主要存在二种观点。
一种观点是：热原的本质就是革兰氏阴性-菌所产生的细菌内毒素，就注射剂来讲，其输液反应主要来源于细菌内毒素。
另一种观点是：热原可能是一类能刺激哺乳动物巨噬细胞MQ所产生的细胞分裂素Cytokines 的物质的总称。所谓细胞分裂素是一类内源性物质（包括：白细胞介素1，白细胞介素6TNF 等）和干扰素类。这些内源性的热原质可直接作用于大脑中枢神经系统刺激体温中枢，最后使机体发热。
4、内毒素分子结构
（略）
5、细菌毒素（内毒素与外毒素）性质与特点
一般细菌毒素分为两类，一类为外毒素Exotoxin）是一种毒性蛋白质，是细菌生长过程中分泌到菌体外的毒性物质，产生外毒素的细菌主要是G—白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌，另一类为内毒素endotoxin），是革兰氏阴性
菌细胞外壁层上的特有结构，细菌在生活状态时不释放出来，只有当
细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时，才表现出毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中类脂A成分。
外毒素的性质与特点：
·毒性强·具有抗原性
·无发热性·细菌的代谢产物
·单纯蛋白质、易分解破坏，对光、热、酸碱不稳定
内毒素性质与特点:
·强的发热性·细胞壁上特有结构
·毒性作用弱·抗原性弱
·核酸多糖的高分子聚合物，不易破坏
·耐热性·对酸、碱不敏感
·水溶性好，生物活性强
6、细菌内毒素的生物活性
细菌内毒素在机体水平上的生物活性表现在以下方面：
·发热性·致死毒性·体重减少
·Shwartzman反应·骨髓反应·白血球减少
·血小板减少·非特异的感染防御（nonspecificresitance）
·耐受性（tolerant）·辅药作用（adjuvant）
·寒颤（血压低下，血管内凝固）
7热原的物理化学特性：
1耐热性：
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
由于热原的种类繁多，耐热性不完全相同，一般含脂多糖结构的耐热性强，含蛋白质成份耐热差。
2滤过性
体积小，1-50mu间，可通过滤器，但不能通过透析膜或过滤板。
3水溶性：易溶于水，不溶于有机溶媒
4不挥发性：不易挥发，但能随水汽雾头夹带入蒸馏水中
5被吸附性：可被吸附剂吸附，如活性炭等。
8除去热原的方法：
实验用具：250℃30分钟以上，1802hr以上。
JP250℃1h以上，其它药典也如此。
样品：湿热（高压蒸气流）处理，过滤：薄膜过滤后渗压法。
其他：酸碱破坏法
9、检测热原的方法
家兔法-热原检查法
化学方法－BET法
生物学方法—TL－Ⅰ，TL－Ⅱ等的测定
其他方法－免疫测定方法ELISA法等
常用的化学方法BET，是最近20年来发展最快的方法、BET法的优点是方便、快捷、灵敏、经济、克服了生物测定的误差。USP2000年24版，600多种，中国药典2000版69种，还在做工作，5年后估计200种左右。
10、中国药典热原检查法：
中国药典98增补本、2000年版较1995年版以前，热原检查法有较大的修订。
2000年版药典附录IXD热原检查法
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
供试用的家兔应健康无伤，体重17-30kg，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饮料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等有得有异常现象。未经使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达06℃家兔；或三周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前3-7天内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8体温均在380-396℃的范围内，且最高最低体温的
差数不超过04℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息2日方可供第2次检查用。如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。
试验前的准备在作热原检查前1－2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17－28℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，应避免噪音干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。家兔体温应使用精密度为±01℃的肛温计，或其他同样精确的测温装置。肛温计插入肛门的深度和时间各家兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分半钟，每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过02℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用家兔，正常体温应在380－396℃的范围内，且各兔正常体温之差不得超过1℃。
试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟或用180℃加热2小时，也可用其他适宜的方法除去热原。
检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高06或06℃以上，或3只家兔体温升高均低于06℃，但升高的总数达14℃或14℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
结果判断在初试3只家兔中，体温升高均低于06℃，并且3只家兔体温升高总数低于14℃；或在复试的5只家兔中，体温升高06℃或06℃以上的兔数仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总数为35℃或35℃以下，均认为供试品的热原检查符合规定。
在初试3只家兔中，体温升高06℃或06℃以上的兔数超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高06℃或06℃以上的兔数超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总数超过35℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。
主要修订内容：
1、如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。
2、每隔30分钟测量体温一次，共6次。
11热原检查法的建立及优缺点
·建立
1953年中国药典收载，选用家兔试验的原因，主要根据以下实验结果：
马、狗、猫、猴子给予内毒素时，同人一样有发热反应
大鼠、小鼠、豚鼠、鸡小动物给予内毒素时，发现重复性很差，尤其大、小鼠。而且存在依赖性，体温下降等情况，温度不稳定，可能会出现假阳性结果。
由于狗有稳定体温调节，其发热反应敏感性比家兔低，而且有白细胞减少、呕吐、拉稀等细菌内毒素特有的毒性反应。
所以认为家兔最适合于作为检查：
①家兔与人类的所引起的发热反应的最小内毒素量几乎相当（01ng/kg）
②家兔有繁殖容易、使用、注射方便等优点。
·优缺点：
优点：
·热原检查法可以反应动物复杂的升温过程
·不仅内毒素，对内毒素以外的热原也能检测出来。
缺点：
·个体差异·重现性、灵敏度差
·不易定量·受药理活性及理化性能影响大
·数据零散
·实验动物的饲养，费用高，时间长
·爱护动物方面
·实验方法差异（USPJPEPBP）
·干扰因素多
12热原检查法的应用范围
1各种注射剂的成品检测（大输液、小针剂）
2生产过程中中间步骤的内毒素控制
3抗生素类、生化药品类
4新品种、输血、输液用品
5血液制品
13、热原检查法的进展及替代
热原检查法进展：
热原检查法自1942年USP12版收载以来，其方法学的研究一直在进行着，最有影响力的是1990年美国药典委员会、FDA进行的一次协作研究，对以下几个方面进行了考查：
·升温间隔时间
·不同的内毒素升温情况
·升温限度等
以上协作结果成为USP22（93）第8本修订本热原试验的依据。修订为：
·测温间隔时间由1小时改为30分钟
·致热限值由06降至05℃
另外，在欧美日各国，从爱护动物的观点出发，在药典中的试验尽可能的避免使用动物，而采用invirto（体外）替代方法，如细菌内毒素检查法是最近20年建立起来的替代家兔法检测热原的一种新的方法，该方法灵敏、快捷、方便、经济，美国科学新闻1980年曾这样报道细菌内毒素检查法“一种简单的检测强烈的细菌内毒素的试验可以节约时间、金钱和许多小兔子”。
但热原检查法作为一种经典方法，几十年来为保证药品安全检查方面发挥了重要作用，功不
可没，现在各国药典还保留着。
USP使用动物试验消减变化情况
USP21 USP22 USP23USP24
品种数 404 70 34*23
占有比例112 19 0905
14各国药典方法比较
随着热原检测方法的不断发展，新的更加灵敏的测定方法也已普通采用，然而到目前为止，JPUSPEP以及中国药典附录中也都还保留着热原检查法，也就是说，在一定时间内，热原检查法依然是检测热原的一个手段和工具。现将四国药典中热原检查法的判断基准对比如下：
CP95年版第一次实验3只家兔
注射后有2~3只家兔体温上升06℃为阳性
注射后有1只家兔体温上升06℃或3只体温上升总和超过14℃进行复试
第二次实验5只家兔
注射后体温上升06℃有两只家兔以上或初、复试8只家兔升温总和超过35℃时为阳性
JP13版同CP95年版
USP23版
第一次实验三只家兔
所有家兔升温值在05℃以下时为阴性
升温值在05℃以上时再取5只家兔复试
第二次实验8只家兔
8只家兔中，升温值超过05℃3只以下，总和在33℃以下时为阴性
EP3rdED
首先取1组3只家兔进行实验，结果3只家兔升温总和若在判定基准表A温度值以下时为合格，超过表B温度值时为不合格
若在之间再取一组3只家兔进行实验，以两组6只家兔进行统计，按上述方法计算结果，如有必要，按规定最多取4组家兔进行实验
判定基准表
家免数AB
合计温度在以下为合格合计温度在以上为不合格
3115℃265℃
6280℃430℃
9445℃595℃
12660℃660℃
15临床混合用药输液反应问题
注射剂应用的早期，由于品种单一，热原能很好的控制，也容易查找原因，随着制药工业的发展，注射剂的种类及数量愈来愈多，抗生素、小针剂、生化药的出现，二种或以上的注射剂混合用药越来越普遍，则造成临床的输液反应更为复杂，其监控问题也更加突出，目前，尚无一个标准很好的控制。
临床输液反应有三个方面的因素影响：
1注射剂中热原值过量或混合后超过限值（热原有累加性）
2输液用具的污染
3个体差异
以上以混合后情况最为复杂。
16药品的降温问题及处理
引起家兔降温的原因：
1药品本身具有降温作用或药品生产过程中带入能引起降温的物质，如喹诺酮类、能引起普遍降温。如含Ca的制剂，有时也降温（所以药典规定缓慢注射），又如乳糖酸红霉素也能引起降温反应。
2家兔体质不佳，腹泻，肛门松弛，体重较小或有外伤。
3实验环境变化的影响，如室温或温度变化较大。
4注射速度快，药液的温度较低（尤其冬季影响更大）
在中国药典1985年版附录生测部分草稿审定会上，对降温问题作了重点讨论，处理意见是：（1）如果是药的问题，注射速度减慢。（2）如果环境问题，兔子问题，则控制环境温度，挑选健康无伤的兔子，再试。
（USP降温以“0”计），
17、影响热原试验结果的因素：
药品本身对实验结果的影响
使家兔体温降低的样品：乳酸钙Ca、喹诺酮类等
剂量、浓度、速度的影响
剂量大、浓度大、速度快易引起家兔体温下降或异常。
大剂量的高渗药物，可引起红细胞干瘪、缩小，失去正常的携氧功能。
大剂量低渗药物，可引起红细胞充胀破裂，发生溶血现象，同时，使排泄增加，使家兔短时内降温。
体积大的等渗水也可使体内血液循环量突增，大大超过生理负荷，严重时可使心脏破裂而死亡。（仍以一般药品规定最大体积10ml/kg）（剂量设置要综合考虑，根据该药的药理作用、理化特性、临床用药剂量、在不影响家兔体质的前提下，可考虑按临床一次量的3-5倍，最低不低于2倍）。
速度过快：会引起血压下降，休克、死亡。如氯化钙、氯化钾、枸橼酸钠、ATP、硫酸镁、碳酸氢钠）等。
浓度大的药物需稀释后注射。
家兔对实验结果的影响
（1）品种：一般用大耳白、新西兰兔，不能用安哥那长毛兔
（2）环境：应符合要求
湿度，通风排水设备，空气中消毒粒子，安静舒适环境很重要。T：17-28，氨气：20PPM 以下，湿度40-80，光照150-300lx，噪音70分贝以下。
（3）饲养管理：实验室与饲养间分开，专用的固定设施。
（4）疾病：问题动物及时处理
（5）兔龄与体重：
一般认为：较轻的不恒定，较大不敏感，不超过30kg，各国药典要求最低15kg以上。复试时严格些，20-24kg。也有实验证明体重不影响温度。
（6）原始体温高低的影响：
高→不敏感
低→易升温，使复检率上升，应注意，规定每次实验中各兔体温之差不超过1℃。
（7）进食同体温的关系
95版规定，试验前至少1小时停止进食。
2000版规定，试验前至少1小时停止进食。
BP（1988，1993）隔夜禁食，实验期禁水。
USP22版禁食不禁水（实验过程）。
JP（XI）实验前数小时开始禁食。
一般认为：试验前不禁食，体温上升
有报道：当日不禁食，温度稳定，但饥饿过久，血糖下降，产
热量下降，体温下降。
所以实验前喂食1次较合适。
（8）对热原的敏感性
兔子对热原的反应较敏感，但体温调节机构不稳定，正常体温幅度变化大，随着使用次数的增加，对热原的耐受性增高，复试时，挑选试验次数少的进行试验。一般规定不超过10次。（9）测温时间长短的影响
有试验证明：70s120s结果相同，30s时，1/5的动物达到120s的体温。
（10）其他因素的影响
1）刺激与扰乱2）动物来源及种类
3）外伤，如耳号4）探头的长度及深度（6cm）
5）校正探头6）家兔档案的记录，以利于分析不正常结果。
18其他注意
1、固定方式
2、血液制品
3、动物购买
4、复试问题
异常毒性检查法
中国药典2000年版附录ⅪC：
本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药。在规定的时间内观察小鼠死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。
对动物的要求：
·健康、合格、体重17-20g
·试验前及试验观察期均按正常饲养条件饲养
·作过本试验的小鼠不得重复使用
对样品溶液配制的要求：
除另有规定外，用氯化钠注射液按各药品规定的浓度配制供试品溶液。
实验材料和用具
·天平
精度001或01mg供试品称量用
精度01或1mg试剂称量用
精度01g小鼠称重用
·试验用具：小鼠固定装置（固定器、支架或盒子）
注射器（1ml以下，精度001ml）、大称量瓶、吸管、移液管、小烧杯
·试剂：75乙醇，棉球，氯化钠注射液，其他规定的溶剂。
供试品溶液
·原料药
精密称取适量，置适宜容器中，按规定浓度，加精密量取的一定量溶剂，搅拌使溶解
·注射液
用75乙醇棉球消毒安瓿颈下或瓶塞，按规定浓度，加精密量取的一定量溶剂，混匀。
·粉针剂
用75乙醇棉球消毒安瓿颈部或小瓶瓶塞，加入一定量规定的溶媒配成所需浓度
检查法：
除另有规定外，取上述小鼠5只，按各药品项下规定的给药途径，每只小鼠分别给予供试品溶液05ml。
给药途径：
·静脉注射--注入尾静脉，应在4-5秒匀速注射完毕
·腹腔注射--注入小鼠腹腔
·皮下注射--腹部或背部两侧皮下
·口服注射--通过适宜的导管，灌入小鼠胃中（常用灌胃针头）
静脉注射给药方式（见图片）
·置小鼠固定器中，使尾巴暴露在外。
·75棉球擦拭尾注射部位，注入药液。
·注射速度4-5秒（注意：如注射部位发白且推入药液有阻力，表示针头未推入静脉内，应重插，如药液损失，应另取小鼠注射。
·注射完毕后，拨出针头，止血（棉球），观察即时反应（现注重即时反应，有反应也应记录下来）
·共注射5只小鼠
腹腔注射（图片）
·一手握小鼠，用拇、食指捏住小鼠颈背部，用无名指及小指固定其尾及后肢，腹部向上。·用75乙醇拭擦小鼠腹部（或背部）注射部位
·腹腔注入供试品溶液
·注射完毕后，拨出针头，放鼠盒中，观察即时反应，共注射5只小鼠，正常饲养。
皮下注射
·握小鼠，同腹腔注射法
·消毒腹部或背部注射部位
·皮下注入样品溶液，可见注射部位皮下出现泡状隆起。
·其它同上。
口服给药：（图片）
·握小鼠，同腹腔注射
·用右手捏鼠尾，移至笼子盖或台上将尾向后拉，小鼠会反射性的向前伸。然后用左手的拇指和食指抓住颈部上提，手掌和小拇指夹位臀和尾部。将左后肢夹在左手的无名指和小拇指之间。动物的全身，特别是从颈部到胸部笔直地伸展开来。
注意点：不要过分地按颈部
·将胃管的前端插入小鼠口腔，与体轴保持平行慢慢插入。
·导管的前端到达咽喉部时感到略有抵抗感，这时，将导管的前端稍偏向腹侧就可进入食道。·注意小鼠无呼吸困难的征兆，送入导管，无抵抗感可顺利插入。
·将注射器内药物缓慢注入（图47）
注意点：一般小鼠灌胃针头进入2/3-3/4可进入胃部。
给药完毕，拨出针头，放入盒中，观察即时反应5只，正常饲养。
结果判断：
·除另有规定，5只小鼠在给药后48小时不得死亡。
·如有死亡，另取18-19g小鼠10只，复试；48小时
内全部小鼠不得有死亡。
·常见药典品种毒性分析
·影响毒性试验的因素
1、速度与毒性的关系
2、给药途径与毒性的关系
3、禁食与毒性的关系
4、体重与毒性的关系
5、性别与毒性的关系
6、饲养条件与毒性的关系
7、温度与毒性的关系
8、给药时间与毒性的关系
不同动物不同途径常用容量和最大体积
给药途径小鼠大鼠豚鼠兔狗
ig02-101-41-55-1010-100
ip02-101-32-55-105-15
im01-0202-0502-0505-12-5
iv02-051-21-53-1035-50
sc01-0505-105-21-33-10
报告书应有的内容：
检品名称检品分类
供样单位规格
生产单位包装
批号失效日期
检验目的检品数量
检验依据报告日期
检验日期室温、湿度
检验者审核者
实验动物、来源性别体重
药液配制给药途径
给药剂量结果
结论
过敏试验
全身过敏反应：（原理）
过敏反应是免疫反应的一种特殊表现，当药物作为抗原或半抗原（半抗原在体内与蛋白质结合形成抗原）初次进入体内通过免疫机理、刺激机体产生相应的抗体。当同样的药物再次进入机体内、抗原与抗体形成抗原抗体复合物，导致组织细胞损伤、肥大细胞释放组织胺等物质，从而引起局部水肿、抓鼻、竖毛、呼吸困难、窒息、痉挛、死亡等。
材料
1动物－豚鼠2器械－注射器3药品－供试品
方法
豚鼠（健康无伤）6只，体重：250-350g或200-300g
操作：无菌（消毒注射器）
给药时间：致敏：隔日一次，共三次
攻击：第１４、２１天，各1/2动物。
剂量：致敏：05ml／支（ip）
攻击：10ml／只''2ml／只或腹腔２－３ml
攻击给药部位：耳静脉、阴茎静脉、后肢小隐静脉。
结果判断：
豚鼠反应级数
反应级数反应症状
０无明显反应
１只有轻微抓鼻、颤抖或竖毛
２有几次咳嗽、有抓鼻、颤抖或竖毛
３多次或连续咳嗽，呼吸困难或痉挛、抽搐等
４痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡
结果判断
不合格：二级以上（包括二级）
豚鼠特点、品种、饲养管理、常见病
1豚鼠CaviaParcellus''Quinepig）又名天竺鼠、荷兰猪。产地：欧洲，属于哺乳GANG 分短毛、长毛、刚毛三种
2性情
温顺、胆小、不咬人不抓人
听觉和嗅觉发达
出生后片刻能活动：2－5天离笼饲养
寿命：6－8年成熟：4－5月♀5－6月♂
孕期：62－72天产仔：3－5胎／年，1－6只／胎
3豚鼠体重与年龄的关系
体重g
年龄
雄雌
初生5580
1日100120
2月150200
3月200280
4月300350
5月350400
1年750800
常用品系：
1近亲系目前世界上有12个
2短毛英国种：
我国较多单位使用：英国种豚鼠杂交形成被毛颜色多样的非纯种短毛豚鼠。
3安哥拉种、秘鲁种、北西厄亚种－抵抗力差－易污染疾病，不宜用做实验。
饲养管理
1喜欢生活在清洁，凉爽和安静的环境中。
2白天活动，夜间少食少动。
3易在寒冷环境中发生肺炎。
4食草动物。体内不能合成维Ｃ，必须给新鲜蔬菜或混合饲料或者从
水中加入维Ｃ。
∷过敏反应的四种类型
1、速发型
2、细胞毒型
3、免疫复合型
4、迟发型
∷易引起过敏的药品
∷已报道的中药过敏品种
∷过敏反应应注意的问题
降压物质检查法（附录ⅪG）
本法系比较组胺对照品S与供试晶T引起麻醉猫或狗血压下降的程度，以判定供试晶中所含降压物质的限度是否符合规定。
组胺对照品溶液的配制精密称取磷酸组胺对照品适量，按组胺计算，加水溶解使成每lml 中含10mg的溶液，分装于适宜的容器内，4—8℃贮存，如无沉淀析出，可在3个月内使用。对照品稀释液的配制临用前，精密量取组胺对照品溶液适量，用氯化钠注射液配成每lml 中含组胺05μg的稀释液。
供试品溶液的配制按正文规定的剂量，配成适当浓度的供试品溶液；试验时，一般要求供试品溶液与对照品稀释液的注入体积应相等。
检查法取健康合格、体重2kg以上的猫或体重5kg以上的狗，雌者无孕．用适宜的麻醉剂如巴比妥类麻醉后，固定于保温手术台上，分离气管并插入插管以使呼吸畅通．必要时可行人工呼吸．在一侧颈动脉插入连接测压计的动脉套管，管内充满适宜的抗凝剂溶液，以记录血压，也可用其他适当仪器记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管，供注射药液用。试验中应住意保持动物体温。全部手术完毕后，将测压计调节到与动物血压相当的高度一般为133～160kPa，开启动脉夹，待血压稳定后，即可进行药液注射．各次注射速度应相同，每次注射后立即注入一定量的氯化钠注射液，相邻两次注射的间隔时间应一定3—5分钟，每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行。自静脉轮流注入上述对照晶稀释液，剂量按动物体重每lkg注射组胺005μg、01μg及015μg，每个剂量应各重复2～3次，如01μg剂量所致的血压下降值均不小267kPa，同时相应各剂量所致反应的平均值有差别，可认为该动物的灵敏度符合规定。
取对照品稀释液按动物体重每lkg注射组胺o1μg的剂量ds，供试品溶液按正文中规定的剂量dr，照下列次序注射一组4个剂量：ds、dT、dT、ds，。然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较;如dT所致的反应值均不大于ds所致反应值的一半，即认为供试品的降压物质检查符合规定。否则应按上述次序继续注射一组4个剂量，并按相同方法分别比较两组内各对ds、dT剂量所致的反应值；如dT所致的反应值均不大于ds所致的反应值，仍认
为供试品的降压物质检查符合规定；如dT所致的反应值均大于ds所
致的反应值，即认为供试晶的降压物质检查不符合规定；否则应另取动物复试。如复试的结
果仍有dT的反应值大于ds所致的反应值，即认为供试品的降压物质检查不符合规定。
所用动物经灵敏度检查仍符合规定，可继续用于降压物质检查。
二、操作规程（猫血压法）
1实验材料及用具2溶液配制
3实验动物4检查法及实验操作
5结果判断6试验记录格式及要求
7技术要点及注意事项
（1）组胺标准品的配制，应注意计算组胺的实际重量（mg）称取重×0362实际组胺重量·称重时，减量法，注意玻璃屑不要落入。
·第1次配制时，配制成1mg/ml的组胺溶液，用注射用水或蒸馏水配制，可置冰箱保存，三个月内如无沉淀、浑浊，可用。实验前取
1ml（1mg/ml）→50ml20ug/ml
再取25ml20ug/ml→100ml（05ug/ml，（用生理盐水配制）
（2）麻醉
120mg/kg苯巴比妥钠
15ml/kg戊巴比妥钠
30ml/kg戊巴比妥钠（无苯巴比妥钠时）
（麻醉时：腹腔注意不要注入膀胱，否则吸收差，达不到麻醉目的）
（3）体温
天气冷时，要加温。
（4）气管：样品较少时，可不需切开气管
（5）动物：怀孕动物不宜用
（6）灵敏度测定：
005μg/kg01μg/kg015μg/kg
体积02ml/kg，静脉给药，用05-10ml生理盐水冲洗。
（7）对样品体积的要求
配制时同标准品，将样品每kg应注入的量配在02ml溶液中。
（特殊情况，如氨基酸、大输液及其他，则可根据具体要求，一般不超过1ml/kg。）
（8）给药顺序：
S1T1T2S2（T1同S2比，T2同S1比），
如有T超过S1/2，按S1T1T2S2，S3T3T4S4顺序做八针
（9）结果判断：
T均小于S的1/2，则符合规定，
T均大于S，则不符合规定
如T有超过S1/2，复试T均小于S，则符合规定
（10）一只动物使用次数
只要灵敏度符合规定，可继续进行
（11）复试条件：
有部分dt所致的反应值大于ds，则另取动物复试
∷新药研究中安全性项目剂量的确定；
∷新药标准中安全性项目易出现的问题；
∷替代法的应用
程序维护:湖北省药检所网站湖北省药检所网站 >> 返回上一页
内毒素知识介绍
作者：来源：发布时间：2009-12-04 11:19浏览次数：478
细菌与细菌内毒素的概念
细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A
细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。
细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：
关于细菌细胞壁结构，尤其G+/G-菌不同之处见下图所示：
由以上结构模式图可以发现，G+菌与G-菌有不同之处，其中对于G-菌来说：细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。
（1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。
（2）外膜（outer membrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。
（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰
氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。
一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
（1）外毒素（exotoxin）有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中，称为外毒素。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。如痢疾杆菌、霍乱弧菌等。细菌外毒素有以下特点：
①毒性强，如纯化肉毒杆菌外毒素结晶1mg可杀死2,000万只小白鼠，对人的最小致死量约为10-4mg，破伤风毒素对小白鼠的致死量为10-6mg，白喉毒素对豚鼠的致死量为10-3mg。②对机体组织有选择性的毒性，如白喉杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成，特别是影响肽链延长，引发心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等；破伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞，引起所属肌肉的痉挛强直。
③具有抗原性，外毒素的化学成分为蛋白质，有抗原性，即以外毒素刺激机体可产生大量的抗毒素，抗毒素能中和外毒素使其无毒。外毒素用甲醛处理后，脱毒变成类毒素，但仍保持抗原性。
（2）内毒素（exotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
内毒素的致病作用无特异性，即各种革兰氏阴性菌对人类引起基本相同的反应。少量内毒素可引起机体发热反应；大量内毒素进入血液，可使血管透性改变，局部出血，颗粒性
白细胞增多或减少和体重下降，严惩毒时能导致内毒素性休克。内毒素毒性比外毒素小得多。
内毒素是外源性致热原，它可能激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。
细菌内毒素化学结构及化学组份
到目前为止，我们知道细菌内毒素作为G－菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖（lipopolysacch aride,LPS）主要是由多糖O抗原，核心多糖和类脂A(Lipid A)三部分组成。见图所示：
类脂A位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的KDO (3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO以不耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位。通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物。具有致热作用。是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分
细菌内毒素生物活性
类脂A作为内毒素生物活性的主要部分。也是近年来研究报道最多的。由氨基葡萄糖，磷酸，10-18碳的长链脂肪酸组成，它与可溶性的O-特异性链及核心分离后。即有难溶于水的特性。游离后的类脂A。可自身凝聚成高分子的复合体，其分子量大小不等。同时它也含有疏水性的中心及亲水性的边沿。是一种双相分子，又是酸碱两性分子，因此类脂A的独特结构使细菌内毒素具有多种的生物活性。
细菌内毒素不同水平上的生物活性
细菌内毒素的耐热性
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
细菌内毒素的除去方法
由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干热灭菌方法。
各种外界因素对细菌内毒素活性的影响
细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大。目前已经知道。一些金属离子、超声波以及温度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响，据国外文献报导，铁离子、铝离子和镓离子等会引起细菌内毒素活性的降低。因此在试验过程中最好使用玻璃用具，以必免这些因素，另外温度的高低对细菌内毒素水溶液活性影响很大，根据国内外文献的报道：内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低，因此对于内毒素水溶液一定要在低温处保存，而且对已经稀释好的内毒素水溶液，要尽可能的在2小时内用完。以免活性降低。
细菌内毒素致病机理
（1）致热性
内毒素可使人体和动物致热，人体对内毒素致热原敏感。在正常情况下，人体内内毒素的正常阈值保持在0.001-0.05ng/ml之间，一旦人体免疫力下降或遭受某种致病菌侵袭时，细菌便在机体内繁殖崩解，释放出大量的内毒素，当体内内毒素的浓度高于这个阈值时，即可启动内外源致热原引起机体发热。
（2）内毒素对糖代谢的影响及其机理
内毒素直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变。
①致病机理：脂多糖能刺激肾上腺素的分泌和释放，使磷酸环化酶活性增强，加速糖分解，使血糖浓度表现为暂时性升高。
②低血糖症的主要机理：脂多糖进入机体数小时后，始作用于肝细胞，引起肝细胞的损伤，使糖元异生的关键酶活性降低，抑制糖原的异生和分解，激活丙酮酸激酶，加速葡萄糖的分解氧化，并产生大量的热量，在临床上表现为发烧症或持续低血糖症。内毒素致肝脏枯否氏细胞功能受到抑制，进而影响对内毒素的消除及对胰岛素的分解代谢。
（3）内毒素对血液循环系统的影响及机理：
内毒素可引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向，可导致弥漫性血管内凝血（DIC）的发生。DIC严重时，可导致严重的休克症状。
①内毒素（脂多糖）对中性粒细胞的作用及机理：内毒素（脂多糖）能引起人体血液中中性粒细胞的增多，这是人体对内毒素反应最敏感的指标之一，亚致热量即可引起中性粒细胞的减少，并伴之以粘连性增加，数小时后，中性粒细胞明显增多。
②脂多糖对血小板的影响：对实验动物注射足量的脂多糖后，均能导致动物血液中血小板明显减少。
③脂多糖对淋巴细胞的作用：脂多糖作用于B淋巴细胞，可增强B淋巴细胞DNA的合成。脂多糖能提高人体体液免疫功能，革兰氏阴性菌感染后引发的机体发热是人体自我防御功能的表现，是积极的。
④脂多糖对单核细胞和巨噬细胞的作用：增强吞噬和巨噬细胞的杀菌能力。同时，脂多糖作用于巨噬细胞和单核细胞后，能产生多种中介物质，参与外源性凝血过程，脂多糖能刺激单核细胞和巨噬细胞产生集落刺激因子（GSF）。
⑤对红细胞和血清铁的影响：脂多糖能抑制红细胞的生成，脂多糖直接作用于骨髓造血干细胞，抑制骨髓的造血功能。内毒素可导致血清铁浓度的降低，内毒素血症的另一病症就是缺铁性贫血。
⑥内毒素可经C3旁路或经典途径激活补体系统，最终导致血压下降和血液动力学的改变，出现局部或全身性shwartzman（炎症症状），并伴有轻微的发热症状。
细菌内毒素作用机理
(1-3)β-D-glucan概念、结构及活性
1) (1-3)β-D-glucan概念：
(1-3)β-D-glucan在自然界的分布很广，主要存在于担子菌、真菌、地衣类、高等植物以及酵母、藻类的菌体成分中，平均分子量在6800左右。分子结构具用多样性。另外，某些使用人造纤维制作的人工肾透析模上也含有类似物质。但它并不引起家兔的升温过程。关于(1-3)β-D-glucan旁反应系是否可以单独形成凝固蛋白，或是与ET反应系的共同作用形成凝固蛋白，目前国外学者尚有一定分歧。(1-3)β-D-glucan对热极为稳定，高压121、1小时不以使其全部灭活。需250℃2小时干热灭菌处理才能彻底去除。另外强酸、强碱以及一些酶类也能使其灭活。目前在日本，尤其是在药局方的各种解说书中，无热原的概念即灭菌后的用具除了无ET外，还要求无(1-3)β-D-glucan。这一点要引起足够重视。
2) (1-3)β-D-glucan结构：
由上可知：(1-3)β-D-glucan在自然界的分布很广，可以说明它同细菌内毒素一样，无处不在，无处不有。有关它的化学结构如下所示：
除此之外，它还有许多其它高一级的结构，如(1-4)β-D-glucan、(1-6)β-D-glucan结构等。
3) (1-3)β-D-glucan生物活性：
(1-3)β-D-glucan与细菌内毒素一样，除了结构的多样化外，它们也有许多共同特性。如对热的稳定性，不易去除，不同菌株所产生的结构差异性等。作为(1-3)β-D-glucan的生物活性主要表现在以下几个方面：
(1-3)β-D-glucan类的生物活性：
1.刺激机体的（MQ）巨噬细胞产生各种细胞分裂素Cytikines(TNF IL-1 IL-6等)；
2.激活补体第二条经路；
3.抗肿瘤作用；
4.抗炎症作用；
5.抗放射线作用；
6.激活G因子旁路使鲎血细胞裂解液（LAL（TAL）试剂）产生凝集反应
细菌内毒素标准品
作为内毒素的研究和使用者对于高纯度的内毒素标准品的渴望是十分迫切的，我们知道，细菌内毒素的活性随着菌株来源不同，调制方法及分散状态等不同差异很大，因此作为一个好的标准内毒素必须有满足以下条件：
1）菌株来源要有很好的稳定性。
2）能够很好地确定其化学分析值。
3）强的发热性与鲎试验活性间要有很好的相关性。
4）反应曲线为直线型。
5）易溶、在冻冷状态下能长时间稳定贮存。
6）高纯度并能保证供应。
WHO在1950年开始就提出了热原标准品的问题，在1959年Shigella dysenteriae内毒素第一次作为WHO standard被采用由于这个标准品稳定性等问题，目前已不在使用，之后，随着内毒素的研究，尤其是鲎试验法的研究与应用，各种新的内毒素标准品已被制备出来，目送各国在内毒素标准品菌株的选择上，一般均使用发热活性比较强的大肠杆菌，除添加附形剂稍有不同处，其对家兔的性几乎都是一样的，各种内毒素标准品，除了发热性好外，还要求具有鲎试验活性，化学分析值安定性、均一等。目前WHO最新的细菌内毒素标准品为EC
细菌内毒素工作标准品：主要用于日常检验工作和实验研究，尤其在内毒素检查法中，用于阳性对照和样品的阳性对照，其力价要比参考内毒素标准品要低的多。由于制备工艺不同其对鲎试剂的反应性也存在很大差异，因此在实验中，为了保证实验有效和准确建立稳定统一的CSE是十分必要的。
另外，目前的内毒素标准品一般都是针对凝胶法而言的，虽说国外在定量法使用上已逐渐增多，但真正的定量法专用内毒素标准品还没有，因此定量法中使用的内毒素标准品的研究是十分重要的。
细菌内毒素量值
关于细菌内毒素的量值在80年代几乎都是以重量单位来表示它很不科学，相同重量的内毒素，由于菌株来源不同，提取方法各异而且所加附形剂不同，因此其生物活性相差很
大。如EC-2和EC-5，其重量换算单位分别：5EU/ng 和10EU/ng，因此随着人们对内毒素生物活性的不断提高，以效价单位表示内毒素的量值是十分合理的。
目前，世界各国药典所收载的细菌内毒素标准品均是以效价单位来表示。由于各国所用菌种来源不同，加入的赋形剂不同，其效价也不尽相同，如美国药典内毒素参考标准品（EC-6）的效价为10000EU/瓶，JP为16000EU/瓶，BP=WHO为14000EU/瓶，而中国药典内毒素参考标准品（Lot;981）的效价为9000EU/Amp。因此，建立统一的细菌标准品是目前各国所面临的一大问题。
内毒素血症
内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起。内毒素血症分为内源性和外源性两大类。
（1）内毒素血症发生的原因。
在严重创伤、感染等应激状态下可出现：
全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力；
胃肠道粘膜缺血、坏死、屏障破坏，大量内毒素释放入血；
肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环；
某些组织、器官的感染引起外源性内毒素入血。
（2）内毒素血症的临床症状
内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克等。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足，缺氧及酸中毒等。
（3）内毒素血症的后果
内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。
内毒素血症可引起一系列病理生理改变：①发热反应：内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢，或作用于白细胞使之释放内原性致热原；②促使血管活性物质如缓激肽、组胺、5-羟色胺、血管紧张素等释放，使血压下降，导致微循环障碍；③引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向；弥漫性血管内凝血；④经C3旁路或经典途径激活补体；⑤直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变；⑥激活白三烯、前列腺素、巨噬细胞、单核细胞及内皮细胞活性。
（4）各类疾病内毒素血症的发生率
急性肝炎37-64%；爆发性肝炎58-100%；丙肝61.54%；胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%；烧伤85%；败血症70%；多器官功能衰竭100%；急性胰腺炎90%；皮肤软组织感染70-81.1%；腹腔感染72-84%；尿路感染70-80%（肾炎）、癌症70%；肺炎100%；上感100%。
（5）内毒素血症的治疗
内毒素血症的治疗原则多主张：①减少内毒素的产生和吸收；②改善内毒素引起的微循环障碍。
肠源性内毒素血症
许多非革兰氏阴性菌感染的重症病人及处于应激状态的患者，绝大部分出现内毒素血症，血浆中内毒素血症主要来源于肠道内毒素的吸收，因此肠源性内毒素血症是病人死亡的主要原因。
肠源性内毒素血症的发病机制与如下几方面有关：
（1）肠道内毒素生成和摄取增多（肠道微生物移位）
机体免疫功能受损和肠粘膜免疫屏障的破坏，内毒素移位，进入血循环；
肠粘膜屏障功能障碍，粘膜缺血、萎缩、破损、脱落均可造成内毒素移位，发生肠源性内毒素血症；
肠道微生态环境破坏，广谱抗生素的长期应用减少了对抗生素敏感的厌氧菌的数量，导致革兰氏阴性菌大量繁殖，突破粘膜屏障而移位进入血循环。
（2）肝脏对内毒素的清除功能减退，大量内毒素在肝脏未经解毒溢入体循环。
（3）门体系统功能障碍，出现门体分流，来自肠道的内毒素绕过肝脏，未经灭活解毒，涌入体循环，形成内毒素血症。
（4）淋巴液生成增加，腹腔淋巴管--胸导管是内毒素进入体循环的重要替代途径。
（5）外周血内毒素灭活功能降低，各种原因造成的外周血灭活内毒素能力下降，易发生肠源性内毒素血症。
鲎的种属及分布
鲎，又称作王蟹，是一种栖生于海洋中的低等无脊椎动物，大约出现在古生代泥盆纪，距今已明几亿年的历史，但直到现在它的形态并无重大变化故有＂活化石＂之称，在国外普通受到保护。
鲎试剂，即利用美州鲎或新鲎的血细胞裂解物提取而来，分别为 LAL试剂和TAL试剂两种
鲎，在动物学分类上，隶属于节肢动物门（Arfhropoda），有螯肢亚门（chelicerata），肢口纲（Merostomata），剑尾目（Xiphosura）。出现在4亿年前的古生代泥盆纪俗称＂活化石＂，鲎是从古生代的三叶虫演化而来。
鲎的种属很少，目前全世界仅存三属4种，分别为：
1. 美洲鲎 Limulus polyphemus LinnaEUs分布在北美西洋岸
2. 东方鲎TachyplEUs tridentatus Leach分布在中国、日本、菲律宾等
3. 巨鲎 TachyplEUs gigas Muller分布在泰国、印度尼西亚等
4. 园尾鲎 Car cinoscorpius rotundi cauda pocock分布马来半岛、印尼等
其中能够用于制备鲎试剂的主要有：1.美洲鲎和 2.东方鲎。
鲎的地理分布狭隘，仅限于北美与东南亚一带，欧洲虽发现过鲎的化石，但目前未发现有活鲎的存在，而分布在我国沿海一带的鲎，都属于同一种，取名为中国鲎，从浙江乍浦以南至福建、台湾广东均有分布，但以福建、广东产的鲎个体大、数量多。
鲎试剂的制备
鲎试剂：即从鲎的血细胞裂解物中提取而来，用于制备鲎试剂的鲎主要为美洲鲎和东方鲎，所以目前国际上只有中、美、日、德等少数国家生产。鲎试剂分类在鲎的来源不同可分为 LAL试剂和TAL试剂，若按使用方法分类又可分为：凝胶法用鲎试剂，浊度法用试剂，显色法用试剂三大类，目前在日本又开发出一种用于测定β-D-Gluean的试剂，象Gluspecy和由蚕的体液中提取出来的一种SLP试剂。关于鲎试剂的制备见下所示：
对于生产过程要严格按照无菌操作进行。
随着鲎试剂制备工艺的不断完善，以及生物化学的发展，人们已逐渐认清了鲎试剂中各种组份，并已分离提取出来，到目前为止，鲎试剂中的主要组份包括有：C.B.G.凝固原，凝固蛋白酶以及适量的Caz +Mg+Na+等。
标准操作规程 1 目的规范热原测温仪的使用操作。 2 适用范围热原测温仪的使用操作。 3 责任者质管部QC检验人员。 4 内容 4.1 系统进入 4.1.1 接通电源，依次打开主机、打印机电源，进入WINDOW系统。 4.1.2 在WINDOW程序管理器中，用鼠标双击“2000版热原实验”快捷图标，进入热原程序主功能窗口。 4.2 探头标定 4.2.1 把待标定的探头与一根最小分度值为0.1℃的精密温度计置于恒温水浴箱中。 4.2.2 在主功能窗口中，用鼠标点击“标定探头”窗口或“其它”菜单下的“探头自动标定”项，进入自动标定窗口。 4.2.3 在“自动标定”窗口，分别输入起始探头号和终止探头号，按“确认”键。 4.2.4 待水浴温度达到第一个设定点（37.0±0.2℃），水浴温度恒温时（“窗口”右半部分同时显示的每个探头的数字电压基本保持不变），在“第一点温度”项目中输入此刻温度计的数值，按回车键，再按左侧相对应的“OK”按钮，进入第二个温度点。 4.2.5 待水浴温度达到第二个设定点（38.0±0.2℃）且恒定后，按上法输入温度计读数，进入第三个温度点。 4.2.6 按上述操作方法，依次输人第三个温度点（39.3±0.2℃）、第四个温度点（39.9±0.2℃）、第五个温度点（41.0±0.2℃）的温度计读数，上述数据输完后，再按“存盘”，微机存盘后“返回”主功能窗口，至此标定完毕。
标准操作规程 4.2.7 注意事项：在标定过程中，窗口右半部分显示探头的数字电压差异，可以判断探头好坏。如果某个探头的数字电压比其它探头的数字电压高很多，说明该探头短路；相反，如果某个探头的数字电压比其它探头的数字电压低很多或为零，说明该探头按触不良或断路。对于短路或断路的探头，标定时必须换掉。 4.3 新兔挑选 4.3.1 在主功能窗口点击“准备工作”项下的“体重输入”项或点击“体重输入”按钮，输入对应探头下的实验兔体重后，返回主功能窗口。 4.3.2 在主功能窗口点击“准备工作”菜单，再点击“选兔”项，从“新兔挑选”子项进入“新兔挑选”窗口。 4.3.3 在“新兔挑选”窗口中先按“预览”按钮，待兔温稳定后，再按“开始”按钮开始测温，测温过程完成后，微机自动整理保存数据，返回主功能窗口。 4.4 热原检查 4.4.1 在主功能窗口按上法输入实验兔的体重，返回主功能窗口。 4.4.2 点击“试验样品”输入按钮或“准备工作”菜单下的试验样品输入项，进入试样输入窗口，输入试验样品名称、批号等数据，返回主功能窗口。 4.4.3 点击“正常测温”窗口进入测温窗口，先点击“预览”按钮，稳定10～15分钟再点击“开始”按钮，进入正常体温测定程序，30分钟后自动进入家兔分组窗口。 4.4.4 如果家兔数不够实验所需数量，可选择按“重选”按钮，继续选兔15分钟，或者按“删除部分供试品”按钮删掉部分供试品。 4.4.5 点击“家兔分组”按钮，自动分组，输入室温数据，按“打印”按钮打印出家兔分组一览表以供注射用。 4.4.6 注射完毕后，点击“继续”按钮，进入自动测温程序，直至测温结束。 4.4.7 在测温过程中如暂时停电或探头脱落，可点击“异常测温”按钮，正确输入已测试时间，再按“继续”按钮，使实验继续进行。
热原检查法标准操作规程 目的： 建立热原检查的基本操作，为热原检查人员提供正确的操作规程。 2.依据： 《中华人民共和国药典》2000年版二部。 3.范围： 本标准适用于采用家兔法进行的热原检查的操作。 4.职责： QC热原检查操作人员对本标准的实施负责。 5. 程序： 5.1.实验材料及用具： 5.1.1. 天平（精度50g，家兔称重用）。 5.1.2.电热干燥箱(50~300±1)℃ 5.1.3.保温箱(室温+3~60)℃ 5.1.4.智能热原检测仪。 5.1.5.家兔固定盒 5.1. 6.实验用具：注射器、针头、刻度吸管、锥形瓶、硫酸纸、砂轮、洗耳球、金 属直镊、注射器盒、时钟、75%酒精棉球、手术镊。 5.1.7. 稀释剂：灭菌注射用水、氯化钠注射液。 5.2. 供试品溶液的配制： 5.2.1.打开洁净台的风机及照明开关，并用75%酒精棉球擦拭台面消毒。 5.2.2. 用75%酒精棉球擦手消毒。 5.2.3. 取供试品适量，置锥形瓶中，并标明批号。 5.2.4. 加入规定的稀释剂，制成符合规定浓度的供试品溶液，锥形瓶瓶口用经过灭菌的硫酸纸封好，放入保温箱中，温热至约38℃。 5.2.5. 供试品配制完毕后，应在30分钟内注射于家兔体内。 5.3. 实验动物：应符合规定。见家兔预选操作规程（SOP ZL5001）。 5.4. 实验前的准备：
5.4.1. 智能热原检测仪探头应每月校验一次，见智能热原检测仪使用规程（SOP ZL0058）。 5.4.2. 用具的除热原：所有与药液接触的器具，都必须清洗干净后，置电热干燥箱 中经250℃、30分钟加热除热原。注射器、针头、手术镊清洗干净后，放入注射器盒内，密闭，放入电热干燥箱中经250℃，30分钟加热除热原。 5.4.3. 实验室的温度： 实验室的温度应在（17-28）℃范围内 实验室与饲养室的温度相差不得大于5℃ 试验全过程中，室温变化不得大于3℃ 5.5. 检查法： 5.5.1.选符合规定的家兔，停止给饲料和水，称重后置于家兔固定盒中至少1小时。 5.5.2.每隔30分钟测量家兔体温一次，一般测量两次。两次体温之差不得超过0.2 ℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。 5.5.3.测量体温时，测温探头插入肛门的深度和时间各兔应相同。深度为6cm，时 间约为1分半钟。 5.5.4. 当日使用的家兔，正常体温应在（38.0-39.6）℃范围内，且各兔间相差不得 超过1℃。 5.5.5. 每个供试品用家兔3只，在测定正常体温后15分钟内给药。供试品的剂量， 应按各该药项下的规定注射。 注射前，先用75%酒精棉球轻擦家兔耳静脉的注射部位，从耳尖端静脉进针，如进针不利，则顺序向前进行。 5.5.7. 注射完毕，拔出针头时，用75%酒精棉球按压针孔数秒钟，止血，注射时间一般每只家兔不超过3分钟。 5.5.8.每隔30分钟，按前法测家兔体温一次，共测6次。 5.6. 温差计算： 5.6.1.注射药液后，以6次测得体温中最高的一次减去正常体温，为该兔体温的升 高度数，如6次体温均低于正常体温，则升温度数以“0”计。 5.6.2.6次体温中最低的一次，减去正常体温，即为降温值。 5.7. 结果判断：
满分：100分 考试日期：姓名：部门： 判断题（每题25分，共100分） 1. 根据被测物质的不同性质，在药典附录“熔点测定法”项下列有三种不同的测定方法，分别用于测定易粉碎的固体药品、不易粉碎的固体药品或凡士林及其类似物质，并在正文各该品种项下明确规定应选用的方法。（） 2.“初熔”系指供试品在毛细管内开始局部出现液滴时的温度；“全熔”系指供试品全部液化时的温度。（） 3. 测定结果的数据应按个数位的0.5单位修约，即0.1～0．2℃舍去，0.3～0.7℃修约为0.5℃，0.8～0.9℃进为1℃。并以修约后的数据报告。（） 4. 对第一法中的初熔、全熔或分解突变时的温度，以及第二法中熔点的温度，都要估读到0.1℃，并记录突变时或不正常的现象。每一检品应至少测定3次，3次读数之差小于0.5℃且不在合格与不合格边缘时，可取3次的均值加上温度计的校正值后作为熔点测定的结果。如3次读数之差为0.5℃或0.5℃以上时，或关系到可能判定为不合格时，应再重复测定二次，并取3次的均值加上温度计的校正值后作为熔点测定的结果。（）
满分：100分 判断题（每题25分，共100分） 1. 根据被测物质的不同性质，在药典附录“熔点测定法”项下列有三种不同的测定方法，分别用于测定易粉碎的固体药品、不易粉碎的固体药品或凡士林及其类似物质，并在正文各该品种项下明确规定应选用的方法。（√） 2.“初熔”系指供试品在毛细管内开始局部出现液滴时的温度；“全熔”系指供试品全部液化时的温度。（√） 3. 测定结果的数据应按个数位的0.5单位修约，即0.1～0．2℃舍去，0.3～0.7℃修约为0.5℃，0.8～0.9℃进为1℃。并以修约后的数据报告。（√） 4. 对第一法中的初熔、全熔或分解突变时的温度，以及第二法中熔点的温度，都要估读到0.1℃，并记录突变时或不正常的现象。每一检品应至少测定3次，3次读数之差小于0.5℃且不在合格与不合格边缘时，可取3次的均值加上温度计的校正值后作为熔点测定的结果。如3次读数之差为0.5℃或0.5℃以上时，或关系到可能判定为不合格时，应再重复测定二次，并取3次的均值加上温度计的校正值后作为熔点测定的结果。（×）
实验十四热原检查 实验目的 ●掌握注射剂热原检查的操作方法及要点。 ●掌握注射剂热原检查结果的判定方法。 ●理解注射剂热原检查试验前的准备工作。 实验器材 药品注射剂供试品。 器材家兔、无菌无热原的注射器及针头、肛温计。 实训指导 1．方法步骤 （1）供试用家兔的选择供试用的家兔应健康合格，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养,在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30min测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0～39.6℃的范围内,且最高与最低体温的差不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。 （2）试验前的准备在作热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃,在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，防止动物骚动并避免噪音干扰。家兔在试验前至少1h开始停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。肛温计（精密度为±0.1℃）插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1.5min，每隔30min测量体温1次，测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1℃。 （3）检查法取适用家兔3只,测定其正常体温后15min内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，每隔30min测体温1次,共测6次,以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度(℃) 。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上,或3只家兔体温升高均低于0.6℃，但体温升高的总和达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。（家兔升温为负值时，均以0℃计）（4）结果判断在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，且3只家兔体温升高总和低于1.4℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超过1只，且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下,均判为供试品的热原检查符合规定。 在初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。
1.目的 建立一个熔点测定操作规程，规范检验方法，确保检验数据的准确性。 2.范围 适用于原料、辅料的熔点测定。 3.责任人 质控部负责人、质控部化验员。 4.内容 4.1.规程依据：中国药典2010年版二部附录ⅥC及中国药品检验标准操作规程。 4.2.简述 4.2.1.熔点系指一种物质按照规定的方法测定由固相熔化成液相时的温度，是物质的一项物 理常数。依法测定熔点，可以鉴别或检查药品的纯杂程度。 4.2.2.根据被测物质的不同性质，在《中国药典》2010年版二部附录ⅥC “熔点测定法” 项下列有三种不同的测定方法，分别用于测定易粉碎的固体药品、不易粉碎的固体药品和凡士林及其类似物质，并在各该品种项下明确规定应选用的方法；遇有在品种项下未注明方法时，均系指采用第一法。在第一法中，又因熔融时是否同时伴有分解现象，而规定有不同的升温速度和观测方法。由于因测定方法、受热条件和判断标准的不同，常导致测得的结果有明显的差异，因此在测定时，必须根据药典各品种项下的规定选用方法，并严格遵照该方法中规定的操作条件和判定标准进行测定，才能获得准确的结果。 4.2.3.仪器与用具 4.2.3.1.加热用容器硬质高型玻璃烧杯，或可放入内热式加热器的大内径圆底玻璃管，供 盛装传温液用。 4.2.3.2.搅拌器电磁搅拌器，或用垂直搅拌的环状玻璃搅拌棒，用于搅拌加热的传温液， 使之温度均匀。 4.2.3.3.温度计具有0.5℃刻度的分浸型温度计，其分浸线的高度宜在50mm至80mm之间 （分浸线低于50mm的，因汞球距离液面太近，易受外界气温的影响；分浸线高于80mm的，则毛细管容易漂浮；均不宜使用），温度计的汞球宜短，汞球的直径宜与温度计柱身的粗细接近（便于毛细管装有供试品的部位能紧贴在温度计汞球上）。温度计除应符合国家质量技术监督局的规定外，还应经常采用药品检验用“熔点标准品”进行校正。 4.2.3.4.毛细管：系用洁净的中性硬质玻璃管拉制而成，内径为0.9~1.1mm，壁厚为 0.10~0.15mm，分割成长9cm以上，一端熔封（用于第一法）或管端不熔封（用于 第二法）；当所用温度计浸入传温液在6cm以上时，管长应适当增加，使露出液面 3cm以上。也可将两端熔封，临用时再锯开其一端（用于第一法）或两端（用于 第二法），以保证毛细管内洁净干燥。 4.2.4.传温液与熔点标准品
生物实验――热原检查法 本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。 供试用家兔供试用的家兔应健康合格，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未经使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6℃的家兔；或3周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前3～7日内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0～39.6℃的范围内，且与最低体温的相差不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后 的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48小时方可供第2次检查用。 如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。 试验前的准备在作热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度 的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，避免噪音干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分半钟，每隔30分钟测量体温1次，
一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1℃。 试验用的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟，也可用其他适宜的方法除去热原。 检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度（℃）。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔体温升高均低于0.6℃，但体温升高的总和达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。 结果判断在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的兔数仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下，均认为供试品的热原检查符合规定。 在初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。 当家兔升温为负值时，均以0.℃计。
成品取样标准操作规程 1 目的：规范取样程序，以保证检验结果的准确性。 2 范围：适用于我司成品取样标准操作。 3 职责：中控室现场QA 人员、灌装、轧盖、灯检岗位对本程序实施负责。 4 内容： 4.1取样量 最终取样数量一般不得少于全部检验所需用量的3倍。即1份供实验室分析用，2份作为留样品。 4.2取样方法 4.2.1 冻干粉针剂生测检验样品取样（包括无菌、热原或细菌内毒素） 4.2.1.1 冻干粉针剂在生产过程中，灌装岗位人员应对以下灌装过程的样品进行标识存放：①开始灌装时的100-300支样品，在冻干盘上标识“KS ”字样；②生产过程因异常情况（如设备维修、停电后重新启动灌装机或净化系统等可能造成微生物污染的因素）停止生产后，重新开始的100-300支样品，在冻干盘上标识为“YC ”字样；③灌装即将要结束的100-300支样品，在冻干盘上标识为“JS ”字样,以上标识各取样不少于20瓶，总取样量见附表1。在生产过程中，QA 人员认为存在偏差的样品，有权要求灌装岗位人员进行标识取样； 4.2.1.2 灌装岗位人员对有以上标识的出箱样品，应进行单独存放； 4.2.1.3 轧盖岗位人员，应先取有以上标识的样品进行依次轧盖； 4.2.1.4 灯检岗位人员，按轧盖的顺序先对以上标识样品进行依次灯检； 4.2.1.5 QA 人员对以上标识的产品按轧盖前中后的顺序进行取样，分别从前、中、后样品中各平均抽取适量，抽取总数应够完成两次生测检验量。 4.2.2 粉针剂生测检验样品取样（包括无菌、热原或细菌内毒素） 4.2.2.1 按包装序号，分别从开始序号及结束序号样品中抽取； 4.2.2.2 生产过程异常情况(同上)的样品，QA 人员也应及时进行取样，每次取样数不得少于10瓶； 4.2.2.3 生产前、后及过程异常情况样品的抽取总数应够完成两次生测检验量。 4.2.3冻干粉针剂、粉针剂理化检验样品与口服固体制剂全部检验样品取样 车间在产品内包装结束之后即可填写成品请验单通知QA 人员取样。QA 人员根据请验单上的内容，准备好相应的取样工具，在外包装生产线或待包装产品中间站进行随机取样，取样面应分散，广泛，不能集中在某一区域，取样单位以最小内包装单位为准，取样量参照下表，一般由产品的包装特性而定。 QA 根据本批产品数量（件数），计算好抽样件数，并拟定取样数量： n ≤3时，每样均抽；3＜n ≤300时，取n +1件；n ＞300时，取2 n +1件； 取样量应能满足理化检验所需样品的数量，总取样量见附表1和附表2。
文件内容： 1、主题内容和适用范围 (2) 2、引用标准 (2) 3、简介 (2) 4、仪器与用具 (2) 5、传温液与熔点标准品 (3) 6、操作程序 (4) 7、结果与判定 (7) 8、附注 (7) 9、更改信息 (8) 颁发部门：
质量管理部。 分发清单： QC办公室、中药室、化学室、稳定性考察室。 1 主题内容和适用范围 本程序规定了熔点的测定方法和影响因素，使其规范化、标准化，并描述了更改信息。 本程序适用于药品熔点的测定。 2 引用标准 中国药典2010年版一部附录Ⅶ C和二部附录Ⅵ C “熔点测定法”、中国药品检验 “熔点测定法”。 标准操作规范2010年版P 141 3 简介 熔点系指一种物质按照规定的方法测定由固相熔化成液相时的温度，是物质的一项物理常数。依法测定熔点，可以鉴别或检查药品的纯杂程度。 根据被测物质的不同性质，在中国药典2010年版附录Ⅵ C“熔点测定法”项下列有三种不同的测定方法，分别用于测定易粉碎的固体药品、不易粉碎的固体药品(如脂肪、脂肪酸、石蜡、羊毛脂等)、凡士林或其他类似物质，并在各该品种项下明确规定应选用的方法；遇有在品种项下未注明方法时，均系指采用第一法。在第一法中，又因熔融时是否同时伴有分解现象，而规定有不同的升温速度和观测方法。由于因测定方法、受热条件和判定标准的不同，常导致测得的结果有明显的差异，因此在测定时，必须根据各品种项下的规定选用方法，并严格遵照该操作程序中规定的操作条件和判定标准进
行测定，才能获得准确的结果。
4 仪器与用具 加热用容器硬质高型玻璃烧杯，或可放入内热式加热器的大内径圆低玻璃管，供盛装传温液用。 温度计具有0.5℃刻度的分浸型温度计，其分浸线的高度宜在50mm至80mm之间（分浸线低于50mm的，因汞球距离液面太近，易受外界气温的影响；分浸线高于80mm 的，则毛细管容易漂浮；均不易使用），温度计的汞球宜短，汞球的直径宜与温度计柱身的粗细接近（便于毛细管装有供试品的部位能紧贴在温度计汞球上）。温度计除应符合国家质量技术监督局的规定外，还应经常采用药品检验用“熔点标准品”进行校正。 搅拌器电磁搅拌器，或用垂直搅拌的环状玻璃搅拌棒，用于搅拌加热的传温液，使之温度均匀。 毛细管系采用洁净的中性硬质玻璃管拉制而成，内径0.9～1.1mm，壁厚0.10～0.15mm，分割成长9cm以上，一端熔封（用于第一法）或管端不熔封（用于第二法）；当所用温度计浸入传温液在6cm以上时，管长应适当增加，使露出液面3cm以上。也可将两端熔封，临用时再锯开其一端（用于第一法）或两端（用于第二法），以保证毛细管内洁净干燥。 熔点测定仪带有电磁搅拌装置（用于搅拌加热的传温液，使之温度均匀），其温度探头应经常采用药品检验用“熔点标准品”进行校正。 5 传温液与熔点标准品 5.1传温液 水用于测定熔点在80℃以下者。用前应先加热至沸使脱气，并放冷。 硅油熔点介于80～200℃之间者，用黏度不小于50mm2/s的硅油；熔点高于200℃者，用黏度不小于100mm2/s的硅油。 5.2药品检验用熔点标准品 由中国药品生物制品检定所分发，专供测定熔点时校正温度计用。用前应在研钵中研细，并按所附说明书中规定的条件干燥（见下表）后，置五氧化二磷干燥器中干燥避光保存备用。
说到热原检查，我们先了解几个概念，热原、热原反应、内毒素、实验动物。 热原（p yr o g e n）：指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。 它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。注射液中的热原主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。 热原反应：临床上在进行静脉滴注大量输液时，由于药液中含有热原，病人在0.5～1h内出现冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，高热时体温可达40℃，严重者甚至可休克，这种现象称为热原反应。 细菌内毒素：是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100E U/m l。 当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。注射液中如果含有内毒素，就会产生代谢产物，内毒素大量进入血液就会引起发热反应即热原反应。 因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。
由于家兔对热原的反应与人基本相似，对热原比较敏感，所以半个世纪以来一直用家兔来检测热原，家兔为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。 鲎试验在某些情况下，比如西药注射液、生理盐水等成分明确的药品，现在大多采用鲎试验来检测，但在一些中药注射剂、血液制品，抗毒素等由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，还在使用兔法来检测热原，因此鲎试验目前还无法完全取代家兔热原试验。 检查法药典要求一 雌兔应无孕，家兔怀孕了会出现腹围会变大，体重也会增大，情绪变得多变，在试验固定台上不容易固定，怀孕后温度波动也会变得不敏感，药物反应小，影响检验结果的准确性。 新兔使用前要预测体温，有的兔子本身体温就低，不符合试验要求，要挑出来，也有运动健将型的，在试验台上固定着老是动来动去的，由于运动频繁体温也自然升高，一旦注射药物，有时候会出现假阳性可能。 有疾病的动物也不能使用，这些有病的动物可能本身就在发烧，如果注射药物后体温会降下来，就是药物发挥了治疗作用或急据升高，加重病情，总之不确定性太多，所以我们要选择体重合格、体温合格、精神状态好的。 大概的选择依据是这样的，兔身体匀称，肌肉结实丰满，背毛光滑。对外界反应表现出很机灵的样子。食欲旺盛是家兔健康的表现，粪便呈球形或椭圆形，大小均匀，外表光滑圆润，松散均匀，呈黑褐
药业有限公司 标准操作规程 题目 制订人 制订日期 颁发部门热原测温仪操作规程 质管部审核人 审核日期编号 SOP-EM-329 批准人 批准日期版本号 A 共3 页第1 页生效日期分发部门质管部 1 目的规范热原测温仪的使用操作。 2 适用范围热原测温仪的使用操作。 3 责任者质管部QC 检验人员。 4 内容 4.1 系统进入 4.1.1接通电源，依次打开主机、打印机电源，进入WINDOW系统。 4.1.2在WINDOW程序管理器中，用鼠标双击“ 200版热原实验”快捷图标，进入热原程序主功能窗口。 4.2 探头标定 4.2.1把待标定的探头与一根最小分度值为
0.1 C的精密温度计置于恒温水浴箱中。 4.2.2在主功能窗口中，用鼠标点击“标定探头”窗口或“其它”菜单下的“探头自动标定”项，进入自动标定窗口。 4.2.3在“自动标定”窗口，分别输入起始探头号和终止探头号，按“确认” 键。 4.2.4待水浴温度达到第一个设定点（ 37.0 ± 0.2C），水浴温度恒温时（窗口”右半部分同时显示的每个探头的数字电压基本保持不变），在“第一点温度”项目中输入此刻温度计的数值，按回车键，再按左侧相对应的“0!”钮，进入第二个温度点。 4 . 2 . 5待水浴温度达到第二个设定点（ 38.0 士 0.2C ）且恒定后，按上法输入温度计读数，进入第三个温度点。 4.2.6按上述操作方法，依次输人第三个温度点（ 39.3 士 0.2C）、第四个温度点（ 39.9 士 0.2C）、第五个温度点（ 41.0 士 0.2C ）的温度计读数，上述数据输完后，再按存盘”，微机存盘后返回” 主功能窗口，至此标定完毕。药业有限公司 标准操作规程 题目热原测温仪操作规程编号
目的：建立熔点测定法第三法的标准操作程序，规范熔点测定法第三法的操作。 范围：适用于熔点测定法。 职责：检验科主管、检验员。 规程： 1．简述 本法（中国药典2000年版式二部附录Ⅶ C熔点测定项下的第三法）所称的熔点，系指在本规程所特定的实验条件下，将熔融并放冷至一定温度的供试品，用预冷至5℃的温度计使供试品以一定厚度，均匀粘附于温度计汞球的下半部，而后升温使供试品熔融，至供试品第一滴脱温度计时的温度，专用于药品标准明确规定采用本法测定熔点的白凡士林，黄凡士林或其他类似物质。 2 仪器与用具 2.1 平底耐热熔器可采用直径为2～3cm的扁形称量瓶代用，在瓶壁上，距内底12mm处应加一 环形标线，以便控制倒入供试品的厚度。 2.2 温度计为具有0.2℃分度的分浸型温度计，要求汞球部分的长度为18～28mm，直径为5～6mm， 刻度标值应径检定并附有校正值。 2.3 试管为长约15cm，外径约25mm的干燥试管，管口配有软木塞，木塞正中打孔，便于插入温 度计，并在木塞边缘开有小槽使空气得以流通。 2.4 水浴为800～1000ml烧杯，附有搅拌装置。 3．操作方法 3.1 供试品的预处理取供试品约15g，缓缓搅拌并加热至温度达90～92℃，倒入平底耐热容器至液面与环形标线相齐(使供试品的夺取度为12±lmm)，放冷至较规定的熔点上限高8～10℃。 3.2 用温度计粘附供试品事先取温度计插入试管所附的软木塞，并放冷至5℃，擦干。待完成3.1的操作时，立即将放冷至5℃的温度计汞球部垂直插入经预处理的供试品中，直对碰到容器底部(即浸没12±lmm)，随即取出温度计并保持垂直悬置，俟粘附在温度计汞球部的供试品表面浑浊，将温度计
XXXX药业有限公司 标准操作规程(S O P) 1.目的 规范热原检查操作，保证热原检查结果的准确可靠。 2.范围 热原检查 3.责任 质量保证科、化验室、实验动物室负责人及相关人员 4. 制定依据： 《中国药典》2010年版三部 5.规程 5.1 实验材料及用具 5.1.1 天平精度 10g 家兔称量用 5.1.2 电热干燥箱 5.1.3 ZRY-2D型热原仪 5.1.4 家兔固定盒 5.1.5 实验用具注射器、广口试剂瓶（均需去热原）、直镊、时钟、脱脂棉5.1.6 试剂75%乙醇
5.2.实验动物 5.2.1 健康无伤、体重1.7kg以上、同一来源、同一品系家兔，雌兔应无孕，一兔一笼，标兔号。 5.2.2 新兔预选 5.2.2.1 新兔经饲养7日后,进行预测体温,测温的条件与热原检查要求相同。 5.2.2.2 测量体温时,肛门体温计插入肛门的深度各兔应相同,约为6cm,测温时间不得少于1.5分钟。 5.2.2.3 每隔30分钟测温1次，共8次。 5.2.2.4 8次体温均在38.0-39.6℃（一般多选用38.4-39.4℃）的范围内，且最高最底体温数不超过0.4℃（以不超过0.35℃为佳）的家兔，可供3周内实验用。 5.2.2.5 录用新兔编号，登记入兔史记录卡，未被录选家兔，可饲养7日按2.2.1至2.2.3程序再预测体温一次，如仍不符合要求则淘汰。 5.2.3 家兔的重复使用 5.2.3.1 供试品判定为符合规定的家兔；升温达0.6℃的家兔应休息2周以上，方可供下次试验用。 5.2.3.2 供试品判定为需重复实验的家兔，应暂作休息处理，如重复合格，升温≥0.6℃的家兔，应重新测温挑选。 5.2.3.3 供试品判定为不符合规定的家兔，不再使用。 5.2.3.4 复试用家兔挑选体重在2.0-2.4kg、正常体温在38.8-39.2℃、使用过2～3次的家兔进行实验。 5.3 实验前的准备 5.3.1 温度探头每6个月校验一次，不符合要求者不能使用。 5.3.2 用具除热原清洗干净的玻璃器皿、注射器、针头、直镊等放入金属制容器内，密闭，置电热干燥箱中经250℃30分钟或180℃2小时加热除热原。去除热原未曾开启的密封容器内用具，可供一周内使用。或者使用一次性注射器
溶出度系指药物从片剂或胶囊剂等固体制剂在规定溶剂中溶出的速度和程度。凡检查溶出度的制剂，不再进行崩解时限的检查。第一法仪器装置（1）转篮分篮体与篮轴两部分,均为不锈钢金属材料制成。篮体A由不锈钢丝网(丝径为0.254mm，孔径0.425mm)焊接而成，呈圆柱形，内径为22.2±1.0mm，上下两端都有金属边缘。篮轴B的直径为9.4～10.1mm，轴的末端连一金属片，作为转篮的盖；盖上有通气孔(孔径 2.0mm)；盖边系两层，上层外径与转篮外径同，下层直径与转篮内径同;盖上的三个弹簧片与中心呈120°角。转篮旋转时摆动幅度不得超过±1.0mm。（2）操作容器为1000ml的圆底烧杯，内径为98～106mm，高160～175mm；烧杯上有一有机玻璃盖,盖上有2孔，中心孔为篮轴的位置，另一孔供取样或测温度用。为使操作容器保持恒温,应外套水浴；水浴的温度应能使容器内溶剂的温度保持在37±0.5℃。转篮底部离烧杯底部的距离为25±2mm。（3）电动机与篮轴相连，转速可任意调节在每分钟50～200转，稳速误差不超过±4％。运转时整套装置应保持平稳，不得晃动或振动。（4）仪器应装有6套操作装置,可一次测定6份供试品。取样点位置应在转篮上端距液面中间，离烧杯壁10mm处。测定法除另有规定外，量取经脱气处理的溶剂900ml，注入每个操作容器内,加温使溶剂温度保持在37±0.5℃，调整转速使其稳定。取供试品6片(个),分别投入6个转篮内，将转篮降入容器中，立即开始计时，除另有规定外，至45分钟时，在规定取样点吸取溶液适量，立即经0.8μm微孔滤膜滤过，自取样至滤过应在30秒钟内完成。取滤液，照各药品项下规定的方法测定，算出每片(个)的溶出量。结果判断6片(个)中每片(个)的溶出量，按标示含量计算，均应不低于规定限度(Q)；除另有规定外,限度(Q)为标示含量的70％。如6片(个)中仅有1～2片(个)低于规定限度，但不低于Q－10％，且其平均溶出量不低于规定限度时，仍可判为符合规定。如6片(个)中有1片(个)低于Q－10％，应另取6片(个)复试；初、复试的12片(个)中仅有1～2片(个)低于Q－10％，且其平均溶出量不低于规定限度时，亦可判为符合规定。供试品的取用量如为2片(个)或2片(个)以上时，算出每片(个)的溶出量，均不得低于规定限度(Q)；不再复试。
0612熔点测定法 依照待测物质的性质不同，测定法分为下列三种。各品种项下未注明时， 均系指第一法。 第一法测定易粉碎的固体药品 A.传温液加热法 取供试品适量，研成细粉，除另有规定外，应按照各药品项下干燥失重的 条件进行干燥。若该药品为不检查干燥失重、熔点范围低限在135℃以上、受 热不分解的供试品，可采用105℃干燥；熔点在135℃以下或受热分解的供试品，可在五氧化二磷干燥器中干燥过夜或用其他适宜的干燥方法干燥，如恒温减压干燥。 分取供试品适量，置熔点测定用毛细管（简称毛细管，由中性硬质玻璃管 制成，长9cm以上,内径0.9～1.1mm，壁厚0.10～0.15mm，一端熔封；当所用温度计浸入传温液在6cm以上时，管长应适当增加，使露出液面3cm以上）中，轻击管壁或借助长短适宜的洁净玻璃管，垂直放在表面皿或其他适宜的硬质物体上，将毛细管自上口放入使自由落下，反复数次,使粉末紧密集结在毛细管 的熔封端。装入供试品的高度为3mm。另将温度计（分浸型，具有0.5℃刻度,经熔点测定用对照品校正）放入盛装传温液（熔点在80℃以下者，用水；熔点在80℃以上者，用硅油或液状石蜡）的容器中，使温度计汞球部的底端与容器的底部距离2.5cm以上（用内加热的容器，温度计汞球与加热器上表面距离2.5cm以上）；加入传温液以使传温液受热后的液面适在温度计的分浸线处。 将传温液加热，俟温度上升至较规定的熔点低限约低10℃时，将装有供试品的毛细管浸入传温液，贴附在温度计上(可用橡皮圈或毛细管夹固定)，位置须使毛细管的内容物部分适在温度计汞球中部；继续加热，调节升温速率为每分钟上升1.0～1.5℃，加热时须不断搅拌使传温液温度保持均匀，记录供试品在初熔至全熔时的温度，重复测定3次，取其平均值,即得。 “初熔”系指供试品毛细管内开始局部液化出现明显液滴时的温度。 “全熔”系指供试品全部液化时的温度。 测定熔融同时分解的供试品时，方法如上述,但调节升温速率使每分钟上升2.5～3.0℃；供试品开始局部液化时(或开始产生气泡时)的温度作为初熔温度；供试品固相消失全部液化时的温度作为全熔温度。遇有固相消失不明显时，应
熔点测定法 -----------2017 1 简述 熔点系指一种物质按照规定的方法测定由固相熔化成液相时的温度，是物质的一项物理常数。依法测定熔点，可以鉴别或检查药品的纯杂程度。 根据被测物质的不同性质，在熔点测定法项下列有三种不同的测定方法，分别用于测定易粉碎的固体药品、不易粉碎的固体药品和凡士林或其他类似物质，并在各该品种项下明确规定应选用的方法；遇有在品种项下未注明方法时，均系指采用第一法。在第一法中，又因熔融时是否同时伴有分解现象，而规定有不同的升温速度和观测方法。由于因测定方法、受热条件和判断标准的不同，常导致测得的结果有明显的差异，因此在测定时，必须根据药典各品种项下的规定选用方法，并严格遵照该方法中规定的操作条件和判定标准进行测定，才能获得准确的结果。 2 仪器与用具 2.1 加热用容器硬质高型玻璃烧杯，或可放入内热式加热器的大内径圆底玻璃管，供盛装传温液用。 2.2 搅拌器电磁搅拌器，或用垂直搅拌的环状玻璃搅拌棒，用于搅拌加热的传温液，使之温度均匀。 2.3 温度计具有0.5℃刻度的分浸型温度计，其分浸线的高度宜在50mm至80mm之间（分浸线低于50mm的，因汞球距离液面太近，易受外界气温的影响；分浸线高于80mm的，则毛细管容易漂浮；均不宜使用），温度计的汞球宜短，汞球的直径宜与温度计柱身的粗细接近（便于毛细管装有供试品的部位能紧贴在温度计汞球上）。温度计除应符合国家质量技术监督局的规定外，还应经常采用药品检验用“熔点标准品”进行校正。 2.4 毛细管系用洁净的中性硬质玻璃管拉制而成，内径为0.9~1.lmm，壁厚为0.10~0.l5mm，分割成长9cm以上，一端熔封（用于第一法）或管端不熔封（用于第二法）；当所用温度计浸入传温液在6cm以上时，管长应适当增加，使露出液面3cm以上。也可将两端熔封，临用时再锯开其一端（用于第一法）或两端
热原检查标准操作规程（2015版药典）1．目的： 通过本规程的制定，使该检查操作进一步规范化，标准化，以减少误差的发生。 2．依据： 《中国药典》2015年版四部通则1142 P153。 3．适用范围： 本标准适用于本公司有热原检查的操作。 4．责任： 热原QC检验人员对本规程的实施负责。 5．程序： 5．1．概述 本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。 5．2．实验材料及用具 5．2．1．天平（精度50g，家兔称重用）。 5．2．2．电热干燥箱（0~300±）℃ 5．2．3．恒温水浴箱（37~100）℃ 5．2．4．家兔固定盒 5．2．5．实验用具：注射器、针头、金属直镊、注射器盒、时钟、75％酒精棉球、手术镊。 5．3．将供试品放入恒温水浴箱中，温热至约38℃。 5．4．供试用家兔供试用的家兔应健康合格，体重1.7kg以上，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未曾使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6℃的家兔；或3周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前7日内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0~39.6℃的范围内，且最高与最低体温相差不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48小时方可再供热原检查用，其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上。对用于血液制品、抗毒素和其他同一抗原性供试品检测的家兔可在5天内重复使用1次。如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。 5．5．试验前的准备 5．5．1．用具的除热原：所有与药液接触的器具，都必须清洗干净后，置电热干燥箱中经250℃、50分钟加热除热原。注射器、针头、手术镊清洗干净后，放入注射器盒内，密闭，放入电热干燥箱中经250℃，50分钟加热除热原。
一、目的：建立注射剂检验标准操作规程，防止错检、漏检的发生。 二、范围：适用于注射剂的检验操作方法。 三、责任：质量部、化验室相关操作人员。 四、内容： 注射剂 注射剂（《中国药典》2010年版二部附录IB）系指药物与适宜的溶剂或分散介质制成的供注入体内的溶液、乳状液或混悬液，以及供临用前配制或稀释成溶液或混悬液的粉末或浓溶液的无菌制剂。 注射剂可分注射液（其中供静脉滴注用的大体积注射液也称静脉输液）、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。 注射剂除应按药典品种项下规定的检验项目外，还应检查“装量”或“装量差异”、“可见异物”和“无菌”。静脉用注射剂应加查“热原”或“细菌内毒素”；溶液型静脉用注射液、溶液型静脉注射用粉末及注射用浓溶液应加查“不溶性微粒”；静脉输液及插管注射用注射液应加查“渗透压摩尔浓度”。 混悬型注射液，除另有规定外，药物粒度应控制在l5um以下，含15～20um(间有个别20～50um)者，不应超过10%，若有可见沉淀，振摇时应容易分散均匀；乳状液型注射液不得有相分离现象；静脉用乳状液型注射液分散相球粒的粒度90%应在lum以下，并不得有大于5um的乳滴。 “装量”检查法 1 简述 1.1本法适用于50ml及50ml以下的单剂量注射液的装量检查，其目的在于保证单剂量注射液的注射用量不少于标示量，以达到临床用药剂量要求。 1.2标示装量为50ml以上的注射液和注射用浓溶液，按最低装量检查法标准操作规范检查，应符合规定。
1.3 凡规定检查含量均匀度的注射液（如塞替派注射液）．可不进行“装量”检查。 2 仪器与用具 2.1注射器及注射针头。 2.2量筒（量入型）规格l、2、5、1O、20及50ml的量筒，均应预经标化。 3 操作方法 3.1 按下表规定取用量抽取供试品。 标示装量供试品取用量（支） 2ml或2ml以下 5 2ml以上至50ml 3 3.2取供试品，擦净瓶外壁，轻弹瓶颈部使液体全部下落，小心开启，将每支内容物分别用相应体积的干燥注射器（包括注射器针头）抽尽，注入预经标化的量筒内，在室温下检视，读出每支装量。 3.3如供试品为油溶液或混悬液时，检查前应先微温摇匀，立即按3.2项下方法操作，并冷至室温后检视。 4 注意事项 4.1所用注射器及量筒必须洁净、干燥并经定期校正；其最大容量应与供试品的标示装量相一致，量筒的体积应使待测体积至少占其额定体积的40%。 4.2 注射器应配上适宜号数的注射针头，其大小与临床使用情况相近为宜。 5 记录与计算主要记录室温，抽取供试品支数，供试品的标示装量，每支供试品的实测装量。 6 结果与判定 每支注射液的装量均不得少于其标示装量；如有少于其标示装量者，即判为不符合规定。 “装量差异”检查法 l 简述 1.1本法适用于注射用无菌粉末的装量差异检查。 1.2本项检查的目的在于控制各瓶间装量的一致性，以保证使用剂量的准确。 1.3凡规定检查含量均匀度的注射用无菌粉末，可不进行“装量差异”检查。 2 仪器与用具 分析天平感量0. 1mg（适用于平均装量为0.15g及其以下的粉针剂）或感量1mg
实验四：加速实验法测定药物的有效期 实验学时：4 实验类型：综合 实验要求：分光度计法测定药物有效期 一、实验目的 1. 应用化学动力学的原理和方法，采用加速实验法测量不同温度下药物的反应速率，根据阿伦尼乌斯公式，计算药物在常温下的有效期。 2. 掌握分光光度计的测量原理及应用。 二、实验内容 1. 加速法测定不同温度下药物反应速率。 2. 根据动力学方法计算药物在常温下的有效期。 三、实验原理、方法和手段 四环素在酸性溶液中（PH＜6），特别是在加热情况下易产生脱水四环素。 四环素脱水四环素 在脱水四环素分子中，由于共轭双键的数目增多，因此其色泽加深，对光的吸收程度也较大。脱水四环素在445nm处有最大吸收。 四环素在酸性溶液中变成脱水四环素的反应，在一定时间范围内属于一级反应。生成的脱水四环素在酸性溶液呈橙黄色，其吸光度A与脱水四环素的浓度呈函数关系。利用颜色反应可以测定四环素在酸性溶液中变成脱水四环素的动力学性质。 按一级反应动力学方程式：
0ln c kt c = (1) 则 01ln c k t c = (2) 式中：c 0为t ＝0时反应物的浓度，mol.L -1 c 为反应到时间t 时反应物的浓度，mol.L -1 设x 为经过t 时间反应物消耗掉的浓度，因此，有c ＝c 0－x ，带入式(2)可得： 0ln c x kt c -=- (3) 在酸性条件下，测定溶液吸光度的变化，用A ￥ 表示四环素完全脱水变成脱 水四环素的旋光度，t A 代表在时间t 时部分四环素变成脱水四环素的吸光度。则公式中可用A ￥ 代替c 0，()t A A ￥ -代替（c 0－x ） ，即 ln t A A kt A ￥￥ -=- (4) 根据以上原理，可用分光光度计测定反应生成物的浓度变化，并计算反应的速率常数k 。实验可在不同温度下进行，测得不同温度下的速率常数k 值。依据阿伦尼乌斯公式，ln k 对1/T 作图，得一直线，将直线外推25℃（即 129815.K 处）即可得到该温度时的速率常数k 值。据公式： 09 25 01054..t k = (5) 可计算出药物的有效期 四、实验组织运行要求 根据实验室可以提供的实验仪器条件，有两种方式组织实验。一种方法是整个班级一起做实验，三个人一组；另一种方法是将班级的学生分为两半，一半同学做实验“加速法测定药物的有效期”，另一半的同学做实验“电导法测定表面活性剂的CMC 值”，两个人一组。 五、实验条件