细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论
? Ｐolge等人(１9４9)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍 然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-７９0C下精子的存活率。接下来的重大进展就是Luyｅｔ(１9５1)与Ｌoveｌock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Ｍerryman(１９5６)、Reｙ(195７)以及Ｓmｉtｈ(1９61)等学者的继续与发展。 １94９年至1９６0年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。Lovｅｌock(１95９)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(ＤMSＯ)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-70０C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结 冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展 蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2 (1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460) 摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。 关键词：家畜；胚胎；冷冻保存 Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2 (1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460 2.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460) Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation 家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。 1、抗冻保护剂和冷冻溶液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂
玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用 戴志俊季钢张芳芳张奕 （合肥市妇幼保健院，合肥230001，安徽） 摘要：目的：探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。方法：回顾性分析2011年1月～10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。结果：玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎，存活21枚（存活率100%），共解冻12个周期，均有胚胎移植，获得临床妊娠5例（妊娠率41.67%），着床率23.81%（5/21）。结论：玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。 关键词：囊胚，玻璃化，冷冻保存，人类 Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi （Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui）Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was 100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were 作者单位：合肥市妇幼保健院 安徽医科大学妇幼保健临床学院安徽230001
冷冻保存方法： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 易生物仪器库：https://www.doczj.com/doc/b73303521.html,/yp/product-list-42.html （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清
胚胎冷冻保存技术 摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。 关键词：胚胎冷冻保存 为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。 现有的胚胎冷冻保存方法有四种： 一、常规冷冻法 常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。 二、一步冷冻法 一步冷冻法：也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。 三、程序冷冻法 程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。 程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性，
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 点击次数：3337 发布时间：2011-4-12 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤： (1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 (2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。 (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10，见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。
哺乳动物胚胎冷冻保存综述 09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨 摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻 胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在 -196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。 1.胚胎冷冻保存原理 胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如
果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。 2.抗冻保护剂和冷冻保护液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类：（1）低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; （2）低分子质量不可渗物质, 如葡萄
细胞冷冻保存方法、注意事项 1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。 2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron F GLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 4、冷冻保存之细胞浓度： （1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml （2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。 （3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。 （4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 10 6cells/ml。 5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 6、冷冻方法： （1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。 （2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 7、材料：
江苏省无锡市中级人民法院 民事判决书 （2014）锡民终字第01235号 上诉人（原审原告）沈新南。 上诉人（原审原告）邵玉妹。 两上诉人的共同委托代理人郭小兵，江苏瑞莱律师事务所律师。 两上诉人的共同委托代理人郭伟，江苏瑞莱律师事务所律师。 被上诉人（原审被告）刘金法。 被上诉人（原审被告）胡杏仙。 原审第三人南京鼓楼医院，住所地南京市鼓楼区中山路321号。 法定代表人韩光曙，该院院长。 委托代理人王玢，该院生殖中心医生。 委托代理人郑哲兰，江苏永衡昭辉律师事务所律师。 上诉人沈新南、邵玉妹因与被上诉人刘金法、胡杏仙，原审第三人南京鼓楼医院监管权和处置权纠纷一案，不服宜兴市人民法院（2013）宜民初字第2729号民事判决，向本院提起上诉。本院于2014年7月2日受理后，依法组成合议庭审理了本案，现已审理终结。 原审法院审理查明： 沈杰与刘曦于2010年10月13日登记结婚，于2012年4月6日取得生育证明。2012年8月，沈杰与刘曦因“原发性不孕症、外院反复促排卵及人工授精失败”，要求在南京市鼓楼医院（以下简称鼓楼医院）施行体外受精-胚胎移植助孕手术；鼓楼医院在治疗过程中，获卵15枚，受精13枚，分裂13枚；取卵后72小时为预防“卵巢过度刺激综合征”，鼓楼医院未对刘曦移植新鲜胚胎，而于当天冷冻4枚受精胚胎。治疗期间，刘曦曾于2012年3月5日与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》，刘曦在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚，同意进行该检查；愿意承担因该检查可能带来的各种风险；所取样本如有剩余，同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《配子、胚胎去向知情同意书》，上载明两人在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术，获卵15枚，移植0枚，冷冻4枚，继续观察6枚胚胎；对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎，两人选择同意丢
首例冷冻胚胎继承案民 事判决书 Revised as of 23 November 2020
我国首例冷冻胚胎继承案民事判决书江苏省无锡市中级人民法院民事判决书（2014）锡民终字第01235号上诉人（原审原告）沈新南。上诉人（原审原告）邵玉妹。两上诉人的共同委托代理人郭小兵，江苏瑞莱律师事务所律师。两上诉人的共同委托代理人郭伟，江苏瑞莱律师事务所律师。被上诉人（原审被告）刘金法。被上诉人（原审被告）胡杏仙。原审第三人南京鼓楼医院，住所地南京市鼓楼区中山路321号。法定代表人韩光曙，该院院长。委托代理人王玢，该院生殖中心医生。委托代理人郑哲兰，江苏永衡昭辉律师事务所律师。上诉人沈新南、邵玉妹因与被上诉人刘金法、胡杏仙，原审第三人南京鼓楼医院监管权和处置权纠纷一案，不服宜兴市人民法院（2013）宜民初字第2729号民事判决，向本院提起上诉。本院于2014年7月2日受理后，依法组成合议庭审理了本案，现已审理终结。原审法院审理查明：沈杰与刘曦于2010年10月13日登记结婚，于2012年4月6日取得生育证明。2012年8月，沈杰与刘曦因“原发性不孕症、外院反复促排卵及人工授精失败”，要求在南京市鼓楼医院（以下简称鼓楼医院）施行体外受精-胚胎移植助孕手术；鼓楼医院在治疗过程中，获卵15枚，受精13枚，分裂13枚；取卵后72小时为预防“卵巢过度刺激综合征”，鼓楼医院未对刘曦移植新鲜胚胎，而于当天冷冻4枚受精胚胎。治疗期间，刘曦曾于2012年3月5日与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》，刘曦在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚，同意进行该检查；愿意承担因该检查可能带来的各种风险；所取样本如有剩余，同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《配子、胚胎去向知情同意书》，上载明两人在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术，获卵15枚，移植0枚，冷冻4枚，继续观察6枚胚胎；对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎，两人选择同意丢弃；对于继续观察的胚胎，如果发展成囊胚，两人选择同意囊胚冷冻。同日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《胚胎和囊胚冷冻、解冻及移植知情同意书》，鼓楼医院在该同意书中明确，胚胎不能无限期保存，目前该中心冷冻保存期限为一年，首次费用为三个月，如需继续冷冻，需补交费用，逾期不予保存；如果超过保存期，沈杰、刘曦选择同意将胚胎丢弃。2013年3月20日23时20分许，沈杰驾驶苏B5U858车途中在道路左侧侧翻，撞到路边树木，造成刘曦当日死亡，沈杰于同年3月25日死亡的后果。现沈杰、刘
细胞冻存与复苏应用方向、发展历史和冷冻技术 概述 细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。 低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0～196℃进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20～40℃冰箱保存、-60～80℃深低温冰箱和液氮（-196℃）超低温保存等。 应用方向 1. 医学方面 近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。 根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。 骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。 而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。 2. 生物学方面
细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。 发展历史 1. 1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者（Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mant egazza，1866；Scheuk，1870）重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spal lanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。 3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 4. 二十世纪50年代，Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。 5. 1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。 这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤（Intracellul ar ice damage）。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。 同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤（Solution damage）。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。 主要技术
细胞冻存的原理与要求 1. 原理：在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向培养基中加入保护剂（甘油或DMSO）,可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。储存在－130度以下低温中能加水冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0度后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在5～10％之间，常用10％。 2. 要求：为保护细胞最大存活率，一般采用慢冻快溶的方法。标准的冻存速度为－1～－2度/分钟，当温度达－25度时，下降率刻增至－5～－10度/分钟到－100度时则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快能影响到细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。但各种细胞对冻存速度要求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐受性大些，骨髓干细胞－1～－3度/分钟较合适，胚胎细胞耐受性较小，总之，在一开始时下降速度不能超过－10度/分钟。另外，用什么保护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养用DMSO较好，一般细胞可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上皮细胞储存在20~30%甘油中很好。原则上细胞在液氮中可储存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。 冻存液是（DMSO10%+90%FBS） 技术总结要点 1. 冷冻速度 冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。
一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度： ①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml ②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。 ③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml ④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。